NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY HOA LILY SORBONE BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy khả năng có thể chuyển được gen vào cây hoa lily Sorbonne, một loại cây thuộc nhóm một lá mầm bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Đồng thời, các thông số kĩ thuật đã xác định được sẽ làm cơ sở cho việc tiếp tục chuyển các gen mong muốn khác vào cây hoa lily Sorbonne nói riêng và các cây hoa lily nói chung.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY HOA LILY SORBONE BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH HÀ NỘI - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn cảm ơn Các thông tin, tài liệu luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Hoàng Tùng i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CT Công thức 2,4 D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BA 6-Benzyllamino purine AS Acetosyringone TNC Tiền nuôi cấy ĐNC Đồng nuôi cấy MS Murashige & Skoog, 1962 PPT DL - Phosphinotricine ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU .II MỤC LỤC III STT V TÊN BẢNG V TRANG V BẢNG 4.1 .V ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT CHỌN LỌC PPT ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA MÔ CALLUS LILY IN VITRO V 38 .V BẢNG 4.2 .V ẢNH HƯỞNG CỦA KHÁNG SINH CEFOTACIME ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH NĂNG TÁI SINH CALLUS LILY “SORBONE” V 40 .V BẢNG 4.3 .V ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS V 42 .V BẢNG 4.4 .V ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN LÂY NHIỄM MẪU ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS V 43 .V BẢNG 4.5 .V ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TIỀN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS V 45 .V BẢNG 4.6 .V ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN ĐỒNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS V 47 .V BẢNG 4.7 .V ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG THỨC LÂY NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS V 49 .V BẢNG 4.8 .V iii ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC VÉC TƠ CHUYỂN GEN NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS V 50 .V DANH MỤC HÌNH VI MỞ ĐẦU .1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.2.3 THÍ NGHIỆM 1: THÍ NGHIỆM VỀ XÁC ĐỊNH NGƯỠNG PPT CHỌN LỌC 35 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT CHỌN LỌC PPT .37 BẢNG 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT CHỌN LỌC PPT ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA TIỀN CHỒI LILY SORBONNE SAU TUẦN 37 BẢNG 4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA KHÁNG SINH CEFOTACIME ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH NĂNG TÁI SINH TIỀN CHỒI LILY SORBONNE SAU TUẦN 40 BẢNG 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU TUẦN) 41 BẢNG 4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN LÂY NHIỄM MẪU ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU TUẦN) 42 BẢNG 4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG THỨC LÂY NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU TUẦN) 45 BẢNG 4.6 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TIỀN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU TUẦN) 46 BẢNG 4.7 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN ĐỒNG NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU TUẦN) 49 BẢNG 4.8 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC VÉC TƠ CHUYỂN GEN NHIỄM ĐẾN KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN CỦA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFASCIENS (SAU TUẦN) 50 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 PHỤ LỤC 60 THÀNH PHẦN NỒNG ĐỘ NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH MẸ 60 iv DANH MỤC BẢNG Tên bảng STT Trang Bảng 4.1 Ảnh hưởng chất chọn lọc PPT đến tỷ lệ sống 38 khả tái sinh mô callus Lily in vitro Bảng 4.2 Ảnh hưởng kháng sinh Cefotacime đến tỷ lệ 40 sống khả tái sinh tái sinh callus lily “Sorbone” Bảng 4.3 Ảnh hưởng nguồn mẫu cấy đến khả 42 chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens Bảng 4.4 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm mẫu đến khả 43 chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian tiền nuôi cấy đến khả 45 chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens Bảng 4.6 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả 47 chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens Bảng 4.7 Ảnh hưởng phương thức lây nhiễm đến khả 49 chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens Bảng 4.8 Ảnh hưởng véc tơ chuyển gen nhiễm đến khả chuyển gen Agrobacterium tumefasciens v vi khuẩn 50 DANH MỤC HÌNH Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR dòng lily Sorbonne chuyển gen 54 vi MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong nhiều năm qua, hoa lily đánh giá loại hoa cao cấp, có giá trị kinh tế giá trị xuất cao Nhu cầu loại hoa thị trường hoa nước giới lớn Vì thế, loại hoa quan tâm trọng phát triển Tuy nhiên điều kiện khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều nước ta tạo điều kiện cho nhiều loại sâu bệnh hại phát triển yếu tố hạn chế chủ yếu đến sản xuất nông nghiệp, có hoa Cùng với việc mở rộng diện tích tăng cường thành phần giống hoa kéo theo hàng loạt loại sâu bệnh hại làm giảm suất, phẩm chất, giá trị thẩm mỹ thương phẩm hoa Đặc biệt, môi trường vùng trồng hoa bị ô nhiễm nghiêm trọng người sản xuất sử dụng thái thuốc bảo vệ thực vật hóa học Chính thế, việc chọn tạo giống hoa có khả kháng sâu bệnh nhu cầu cấp thiết thực tiễn Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống lúc đưa vào loài trồng gen mong muốn có nguồn gốc từ thể sống khác nhau, không loài có họ gần mà loài xa nhau, từ chuyển gen mong muốn tạo đặc tính lạ (mầu sắc, cấu trúc hoa, hơng thơm, tuổi thọ hoa cắm, đặc tính kháng sâu bệnh hại, chống chịu với điều kiện bất thuận…) Chính thực đề tài:“Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào hoa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens” nhằm góp phần đẩy mạnh hướng nghiên cứu tạo giống trồng kỹ thuật gen nước ta 1.2 Mục đích- yêu cầu 1.2.1 Mục đích: - Xác định thông số kĩ thuật cho bước qui trình chuyển gen mục tiêu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens, làm sở cho việc tạo chuyển gen mang đặc tính mong muốn 1.2.2 Yêu cầu - Xác định nồng độ Cefotacime chọn lọc - Xác định nồng độ PPT sử dụng để chọn lọc - Xác định phương pháp lây nhiễm vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy thích hợp - Đánh giá biểu gen sau chuyển nạp 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cho thấy khả chuyển gen vào hoa lily Sorbonne, loại thuộc nhóm mầm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Đồng thời, thông số kĩ thuật xác định làm sở cho việc tiếp tục chuyển gen mong muốn khác vào hoa lily Sorbonne nói riêng hoa lily nói chung 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu đề tài làm tiền đề thúc đẩy việc ứng dụng phương pháp tạo giống trồng chuyển gen mang đặc tính mong muốn công tác chọn tạo giống trồng nói chung hoa lily Sorbonne riêng Việt Nam 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật 2.1.1 Khái niệm Kỹ thuật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen kỹ thuật đưa hay nhiều gen lạ thiết kế dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ trồng nói riêng sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật…) làm cho gen lạ tồn dạng plasmid tái tổ hợp gắn vào gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, gen hoạt động tổng hợp nên protein đặc trng dẫn tới việc xuất đặc tính thể chuyển gen Chuyển gen thực vật có ý nghĩa lớn mặt khoa học, khẳng định tính khách quan tự nhiên vật chất di truyền như: khả mã hoá cho tính trạng định, khả phiên mã, dịch mã khả di truyền Thông qua chuyển gen, nhà sinh lý, hoá sinh di truyền nghiên cứu trình điều khiển, thể ảnh hởng yếu tố di truyền ngoại cảnh lên hoạt động gen Trong kỹ thuật chuyển gen vào thể thực vật, nguồn vật liệu thường sử dụng để chuyển gen là: mô lá, mô thân, mẩu callus, phôi, tế bào tách rời… Những vật liệu sau biến nạp thành công, tế bào dung nạp gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho tế bào tái sinh thành thể hoàn chỉnh cách đặt vào môi trường tái sinh thích hợp Nếu như, tái sinh thành hoàn chỉnh không thành công tất vật liệu biến nạp trở nên vô nghĩa Chính vậy, thành công kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc vào tái sinh tế bào Do vậy, việc lựa chọn điều chỉnh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đóng vai trò quan trọng, mang tính định tới thành công hay thất bại thí nghiệm biến nạp, bên cạnh đó, vấn đề sử dụng mô hay tế bào thích hợp để biến nạp mục tiêu nghiên Hình 4.5 Mẫu chuyển gen tái sinh chồi môi trường chọn lọc Kết biểu gen Gus: Trong vector EHA 105/pITB 2C có gen thị Gus A gen Gus A mã hoá cho việc tổng hợp enzym β-glucuronidase, enzym xúc tác phân giải nhiều loại β-D-glucuronit Hoạt tính Gus mô thực vật biến nạp xác định có mặt màu xanh chàm đặc trưng dễ nhận biết tạo thành sau thuỷ phân chất không màu axit 5-bromo-4-cloro-3-indolyl βD-glucuronic Để kiểm tra biểu gen Gus A mẫu lây nhiễm, lấy mẫu lây nhiễm sống sau diệt vi khuẩn ngâm với dung dịch X-gluc khoảng 15 370C bóng tối Mẫu chuyển gen có màu xanh chàm đặc trưng mẫu đối chứng màu Kết cho thấy mẫu kiểm tra sau nhuộm dung dịch X-gluc xuất màu xanh đặc trưng Kết khẳng định vector mang gen cần chuyển nạp chuyển vào Mẫu đối chứng không cho kết biểu gen Gus Sự biểu gen Gus thấy mẫu lây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens 51 Mẫu chuyển Gen Đối chứng Đối chứng Mẫu chuyển Gen Hình 4.6: Sự biểu gen Gus 4.9 Kiểm tra có mặt gen chuyển vào phương pháp PCR * Kết PCR cho dòng loa Sorbonne chuyển gen 52 Các chồi Sorbonne sống môi trường chọn lọc PPT nhân nhanh cắt để chiết tách DNA, tiến hành PCR Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi cho 35S promoter để phân tích DNA số chồi tái sinh thu sau chọn lọc PPT có kết 5/5 mẫu DNA chiết tách từ chồi cho tín hiệu khuếch đại đoạn khoảng 200bp (so với thang chuẩn M), dòng S1, S2, S3, S4, S5 Với mẫu đối chứng âm (là mẫu DNA chiết tách từ Sorbonne không chuyển gen) không ghi nhận khuyếch đại DNA, mẫu đối chứng dương (là mẫu DNA chiết tách từ chủng vi khuẩn - TU) có kết dương tính Điều chứng tỏ phản ứng PCR không bị ngoại nhiễm cặp mồi sử dụng đặc hiệu cho việc kiểm tra chuyển gen M S1 S2 S3 53 S4 S5 ĐC TU Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR dòng lily Sorbonne chuyển gen Như vậy, kết kiểm tra chứng minh dòng lily Sorbonne S1, S2, S3, S4, S5, S6 tái sinh sau chọn lọc có mang gen chuyển Trên sở kết có đề xuất quy trình chuyển gen Gus, gen Bar gen Cry cho hoa loa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn A.tumefaciens sau : 54 Tiền chồi Tiền nuôi cấy 3-5 ngày MS+30g/lsaccharose+0.7mg/lBA+0.3mg/l 2.4D, pH=5.8 Lây nhiễm với vi khuẩn Ngâm mẫu vào dd vi khuẩn phút Đồng nuôi cấy ngày MS (không có NH4NO3) + 20mg/l AS + 20g/l saccharose + 10g/l glucose + 10mM/l MES + 0.25mg/l BA + 1g/l cassamino acid + 700mg/l L-asparagine monohydrate + 700mg/l Lglutamine + 7g/l agar pH = Rửa khuẩn Vi khuẩn rửa nước cất vô trùng môi trường MS vô trùng có bổ xung Cefotacime với nồng độ 500mg/l Mẫu rửa – lần, sau rửa nước cất vô trùng (hoặc MS vô trùng) lần Cấy mẫu vào môi trường diệt khuẩn MS + 0.25mg/l BA + 20g/l saccharose + 7g/l agar +500mg/l Cefotacime pH = 5.8 Xác định biểu gen Gus tạm thời nhuộm X-gluc Cấy vào môi trường chọn lọc MS + 60g/l saccharose + 10g/l glucose + 0.25 mg/l BA + 5mg/l PPT + 7g/l agar pH = 5.8 Xác định kết chuyển gen Hình 4.8 Sơ đồ thể quy trình chuyển gen cho hoa lily Sorbonne 55 Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thí nghiệm nghiên cứu rút kết luận sau: * Hoàn toàn chuyển gen vào hoa lily Sorbonne vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Nồng độ 5mg/lít PPT ngưỡng chọn lọc cho mẫu tiền chồi lily Sorbonne chuyển gen in vitro Nồng độ 500mg/lít Cefotacime nồng độ diệt khuẩn cho mẫu tiền chồi lily Sorbonne chuyển gen in vitro Thời gian tiền nuôi cấy mẫu phù hợp ngày Phương pháp lây nhiễm thích hợp cắt mẫu sau tiền nuôi cấy ngày, lây nhiễm với vi khuẩn cách ngâm dịch vi khuẩn phút Phương thức nuôi cấy giai đoạn đồng nuôi cấy phù hợp đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn môi trường đồng nuôi cấy thời gian ngày 5.2 Đề nghị * Tiếp tục đánh giá biểu gen chuyển vào kỹ thuật lai Southern Blot, Western Blot biotest để khẳng định biểu ổn định gen chuyển vào * Có thể áp dụng quy trình nêu để chuyển gen cho hoa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen triển vọng khác có đặc tính cho hoa loa kèn nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Tài liệu nước Bùi Lan Anh cs, Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – Gen kháng thuốc diệt cỏ vào khoai mì (Manihot esculenta Crantz) phương pháp bắn gen, 2008 Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 11, số 01 – 2008 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang.- Di truyền phân tử nguyên tắc chọn giống trồng TP.HCM: Nông nghiệp, 1999 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm, 2000 Giáo trình Sinh lý thực vật Nguyễn Quang Thạch cộng sự, 2004 “Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp” Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Quang Thạch, 1996 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống hoa lily Sorbonne in vitro, in vivo số phơng pháp bảo quản hoa cắt Báo cáo tốt nghiệp Cao Ngọc Thuý, Hoàng Minh Tấn, 1997 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thấp đến sinh trởng phát triển hiệu kinh tế hoa lily Sorbonne trắng Luận án thạc sĩ Dương Đức Tiến, Võ Văn Chi Giáo trình phân loại thực vật Trương Thu Thủy cs, 2004 “Xây dựng quy trình tái sinh Bông cách tạo đa chồi”, Tạp chí khoa học công nghệ Nguyễn Văn Uyển Xây dựng hệ thống tái sinh ứng dụng nghiên cứu tạo cải chuyển gen kháng sâu Hội nghị tổng kết NCCB KHTN 2005 Tài liệu tiếng Anh 57 10 Binns, A.N., Costantino, P 1998 The Agrobacterium oncogenes In: The Rhizobiaceae (Ed Spaink, H., Kondorosi, A., Hooykaas, P.J.J ).126-129 11 Y Dessaux 1998 The Ti Plasmid of Agrobacterium tumefaciens Harbors an attM-Paralogous Gene, aiiB, Also Encoding N-Acyl Homoserine Lactonase Activity American Society for Microbiology 546-548 12 Gamborg, O L and G C Phillips Laboratory facilities, operation, and management In Gamborg, O L and G C Phillips, editors eds Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods Springer Berlin 1995 925-927 13 Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press, Inc New York, USA 587-589 14 Birch RG 1997 Plant Transformation: Problems and strategies for practical applications Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology 48: 297326 15 Chrispeels MJ and Sadava DE 2003 Plants, Genes, and Crop Biotechnology 2nd ed Jones and Bartlett Publishers, Massachusetts, USA 156-157 16 Cutler SJ and Cutler HG 2000 Biologically Active Natural Products: Pharmaceuticals CRC Press LLC, USA.432-434 17 Ingo Potrykus, Zeng-yu Wang Transgenic Plants of Tall Fescue (Festuca arundinacea Schreb.) Obtained by Direct Gene Transfer to Protoplast.Bio/Technology 1991 923-927 18 James F Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith and Peter Waterhouse DNA fingerprints and cryopreservation of potato cultivars for improved quality assurance Final report (Horticultural Research & Development Corporation) 2000 367-369 58 19 Gelvin, Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool American society for microbiology 2003 246- 248 20 Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK 87-89 21 Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK 76- 78 22 Walker JM and Rapley R 2002 Molecular Biology and Biotechnology th Edition The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK 156-158 23 Zhu 2000, A T-DNA Insertion Knockout of the Bifunctional Lysine- Ketoglutarate Reductase/Saccharopine Dehydrogenase Gene Elevates Lysine Levels in Arabidopsis Seeds American Society of Plant Physiologists 645647 24 Ziemienowicz A; Merkle T; Schoumacher F; Hohn B; Rossi L Import of Agrobacterium T-DNA into plant nuclei: two distinct functions of VirD2 and VirE2 proteins.The Plant cell 2001;13(2):369-83 2001 723-725 25 Ziemienowicz, 2001 Calf thymus Hsc70 and Hsc40 can substitute for DnaK and DnaJ function in protein renaturation but not in bacteriophage DNA replication Zurich Open Repository and Archive 324-326 59 PHỤ LỤC Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Thành phần Nồng độ Nồng độ dung dịch mẹ (mg/l) (mg/l) Khoáng đa lượng 20X NH4NO3 1650 33000 KNO3 1900 38000 CaCl2.2H2O(pha riêng) 440 8800 MgSO4.7H2O 370 7400 KH2PO4 170 3400 Fe-EDTA 100X FeSO4.7H2O 27,85 2780 Na2-EDTA.2H2O 37,25 3725 Khoáng vi lượng 100X MnSO4.4H2O 22,300 2230,0 ZnSO4.7H2O 8,600 860,0 H3PO4 6,200 620,0 KI 0,830 83,0 Na2MoO4.2H2O 0,250 25,0 CuSO4.7H2O 0,025 2,5 CoCl2.6 H2O 0,025 2,5 60 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL S?NG FILE TGLN 31/ 8/** 7:54 PAGE VARIATE V003 TL S?NG S?NG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CôNG THUC 12.0050 6.00251 0.16 0.856 * RESIDUAL 339.669 37.7410 * TOTAL (CORRECTED) 11 351.674 31.9704 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BOOK1 31/ 8/** 7:54 PAGE MEANS FOR EFFECT CôNG TH?$ NHAC LAI 4 NOS TL SONG 61.1950 59.9700 62.4200 SE(N= 4) 3.01769 5%LSD 9DF 9.82650 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BOOK1 31/ 8/** 7:54 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CôNG TH?| (N= 12) SD/MEAN |$ | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | TL S?NG 12 61.195 5.6542 6.1434 2.30 0.8555 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI5 FILE SO LIEU 31/ 8/** 8:12 61 PAGE VARIATE V004 SOCHOI5 CHOIB CHOIB LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CONGTHU$ 3.63862 1.21287 45.60 0.000 * RESIDUAL 212801 266001E-01 * TOTAL (CORRECTED) 11 3.85142 350130 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO LIEU 31/ 8/** 8:12 PAGE MEANS FOR EFFECT CONGTHU$ CONGTHU$ CT1 CT2 CT3 CT4 NOS SOCHOI5 1.88000 2.56000 3.04000 1.65000 SE(N= 3) 0.941631E-01 5%LSD 8DF 0.417056 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SO LIEU 31/ 8/** 8:12 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHU$| (N= 12) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | SOCHOI5 12 2.2825 0.59172 0.16310 2.3 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI6 FILE CHOI 31/ 8/** 8:17 62 PAGE VARIATE V005 SOCHOI6 CHOI6 CHOIB CHOIB LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CONGTHU$ 53.3312 17.7771 316.60 0.000 * RESIDUAL 449205 561506E-01 * TOTAL (CORRECTED) 11 53.7804 4.88913 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CHOI 31/ 8/** 8:17 PAGE MEANS FOR EFFECT CONGTHU$ CONGTHU$ CT1 CT2 CT3 CT4 NOS SOCHOI6 2.67000 7.71000 5.36000 2.65000 SE(N= 3) 0.136810 5%LSD 8DF 1.197122 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CHOI 31/ 8/** 8:17 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHU$| (N= 12) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | SOCHOI6 12 4.5975 2.2111 0.23696 3.1 0.0000 63 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI7 FILE CHOI 31/ 8/** 8:19 PAGE VARIATE V006 SOCHOI7 CHOI7 CHOIB CHOIB LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CONGTHU$ 333.469 111.156 ****** 0.000 * RESIDUAL 858425 107303 * TOTAL (CORRECTED) 11 334.327 30.3934 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CHOI 31/ 8/** 8:19 PAGE MEANS FOR EFFECT CONGTHU$ CONGTHU$ CT1 CT2 CT3 CT4 NOS SOCHOI7 4.26000 4.73000 17.1100 6.13000 SE(N= 3) 0.189123 5%LSD 8DF 2.496712 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CHOI 31/ 8/** 8:19 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHU$| (N= 12) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | SOCHOI7 12 8.0575 5.5130 0.32757 2.5 0.0000 64 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLCHOI8 FILE SOLIEUB8 31/ 8/** 8:27 PAGE VARIATE V002 TLCHOI8 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CONGTHU$ 34.5696 17.2848 13.51 0.007 * RESIDUAL 7.67400 1.27900 * TOTAL (CORRECTED) 42.2436 5.28045 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SOLIEUB8 31/ 8/** 8:27 PAGE MEANS FOR EFFECT CONGTHU$ CONGTHU$ NOS TLCHOI8 GUS 11.8000 GUS PLUS 9.96000 TU 7.04000 SE(N= 3) 0.652942 5%LSD 6DF 1.27863 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SOLIEUB8 31/ 8/** 8:27 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CONGTHU$| (N= 9) SD/MEAN | | NO BASED ON BASED ON % | | OBS TOTAL SS RESID SS | | TLCHOI8 9.6000 2.2979 1.1309 4.6 0.0066 65 ... 20 gen nằm operon, gen là: virA, virB, virC, virD, virE virG Những gen vir có vai trò vi c tạo sợi đơn T-DNA vi khuẩn chuyển vào tế bào chủ gắn vào nhiễm sắc thể chủ Các gen vir có vai trò vi c... 2.1.3.3 Chức gen Vir Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A tumefaciens sang tế bào chủ thực hoạt động gen vir Có 25 gen nhận biết đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF vùng... trúc hoa, hơng thơm, tuổi thọ hoa cắm, đặc tính kháng sâu bệnh hại, chống chịu với điều kiện bất thuận…) Chính thực đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào hoa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn