Xây dựng quy trình chuyển gen kháng thuốc kháng sinh cefotaxime vào cây hoa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Cỏc chỉ tiờu theo dừi

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 35 ∑ số mẫu sống sau diệt khuẩn. Thớ nghiệm ủược bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại. Thớ nghiệm 2: TThhớớ nngghhiiệmệm vvề ề xxỏỏcc ủịủịnnhh nnồnồngg ủộủộ cceeffoottaacciimmee ddiiệtệt kkhhuuẩnẩn Cụng thức Nồng ủộ Cefotacime (mg/l) Ghi chỳ.

Thớ nghiệm 3: Ảnh hưởng của dạng mẫu cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens

Thớ nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian lõy nhiễm mẫu ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens. 1 ðối chứng (không lây nhiễm với vi khuẩn) Vi khuẩn mang gen TU 2 Ngâm mẫu trong dung dịch 5 phút Mẫu: Tiền chồi. Thớ nghiệm 5: Ảnh hưởng của phương thức lõy nhiễm cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens.

2 Cắt mẫu trong dung dịch vi khuẩn Vi khuẩn mang gen TU 3 CT2: Mẫu ủược cấy trong mụi trường. 5 phút trong dung dịch vi khuẩn Lượng mẫu: 200 mẫu/công thức 5 Căt mẫu trong môi trường ðNC sau. Thớ nghiệm 6: Ảnh hưởng của thời gian tiền nuụi cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens.

Thớ nghiệm 7: Ảnh hưởng của thời gian ủồng nuụi cấy ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens. Cụng thức Thời gian ủồng nuụi cấy (ngày) Ghi chỳ 1 ðối chứng (không lây nhiễm với vi. Thớ nghiệm 8: Ảnh hưởng của cỏc loại vộc tơ ủến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Trong khi ủú ở CT5, sử dụng nồng ủộ Cefotacime 600mg/l tỷ lệ tạo chồi giảm mạnh, chiều cao và số lá thấp ảnh hưởng tới sức sống của chồi tái sinh sau chọn lọc. Ảnh hưởng của khỏng sinh Cefotacime ủến tỷ lệ sống và khả năng tái sinh năng tái sinh titiềềnn cchhồồii lliillyy SSoorrbboonnnnee ssaauu 88 ttuuầầnn ðường hướng tái sinh Tăng trưởng của. Vỡ thế chỳng tụi tiếp tục theo dừi mẫu cấy trờn mụi trường cú chứa PPT kết quả thu ủược như sau: Ở cụng thức ủối chứng toàn bộ mẫu ủều chết sau khi chọn lọc.

Trong thí nghiệm chuyển gen bằng vi khuẩn, thời gian lây nhiễm ảnh hưởng rất lớn tới sức sống cũng như khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào mẫu. Khi thời gian lõy nhiễm ngắn, vi khuẩn khụng ủủ thời gian ủể xõm nhập vào trong các tế bào và như vậy chúng sẽ bị chết sau khi diệt khuẩn. Ngược lại, nếu thời gian lây nhiễm quá dài lượng vi khuẩn xâm nhập vào tế bào quá lớn sẽ ảnh hưởng tới sức sống cũng như khả năng tái sinh củ tế bào.

Chúng tụi ủó tiến hành thớ nghiệm gồm 5 cụng thức: CT1 (ủối chứng khụng nhiễm khuẩn), CT2 (ngâm trong dịch vi khuân 5 phút), CT3 (ngâm trong dịch vi. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 45 Qua bảng 4.4 cho thấy ở cụng thức ủối chứng 100% mẫu bị chết sau khi chọn lọc. Biểu ủồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian lõy nhiễm mẫu ủến tỷ lệ sống sau lõy nhiễm, sau chọn lọc và tỷ lệ mẫu tỏi sinh.

Thời gian tiếp xỳc nhanh hay lõu, mức ủộ sự tổn thương của cỏc tế bào khi tiếp xỳc cú ảnh hưởng rất lớn ủến quỏ trỡnh lõy nhiễm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 47 CT1: cắt trong dung dịch vi khuẩn CT2: Mẫu ủược cấy trong mụi trường. Thời gian TNC là khoảng thời gian mà mẫu cấy ủược nuụi cấy trờn mụi trường tái sinh trước khi tiến hành quá trình lây nhiễm vi khuẩn, trong qua thời gian này các tế bào, mô tiến hành quá trình phân chia mạnh mẽ.

Thí nghiệm nghiên cứu thời gian tiền nuôi cấy với nguồn mẫu là tiền chồi ủược tiến hành trờn 4 cụng thức: tiền nuụi cấy 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày và 4 ngày. Thông qua bảng 4.5 chúng tôi nhận thấy như sau: Ở CT3 tiền nuôi cấy 3 ngày cho biểu hiện tốt nhất về số chồi thu ủược cũng như về sinh trưởng chồi tỏi sinh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 53 ðể kiểm tra sự biểu hiện của gen Gus A trong cỏc mẫu ủó lõy nhiễm, chỳng tụi lấy cỏc mẫu ủó lõy nhiễm sống sau diệt vi khuẩn ngõm với dung dịch X-gluc khoảng 15 giờ ở 370C trong bóng tối.

Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi cho 35S promoter ủể phõn tớch DNA của một số chồi tỏi sinh thu ủược sau chọn lọc PPT chỳng tụi cú ủược kết quả 5/5 mẫu DNA chiết tỏch từ những chồi này cho tớn hiệu khuếch ủại ủoạn khoảng 200bp (so với thang chuẩn M), ủú là cỏc dũng S1, S2, S3, S4, S5. Với mẫu ủối chứng õm (là mẫu DNA chiết tỏch từ lỏ cõy Sorbonne khụng chuyển gen) khụng ghi nhận ủược sự khuyếch ủại DNA, trong khi mẫu ủối chứng dương (là mẫu DNA chiết tỏch từ chủng. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 55 vi khuẩn - TU) cú kết quả dương tớnh.