Xây dựng quy trình chuyển gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào giống quýt Đường Canh (Citrus reticulata) thông qua Agrobacterium tumefaciens tạo quả không hạt

DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến tỷ lệ mọc khuẩn trong thời gian đồng nuôi cấy...Bảng 2 Tỷ lệ mẫu sống sau rửa khuẩn...Bảng 3 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm

MỤC LỤC

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TÓM TẮT

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

1.2 Mục đích, yêu cầu

1.2.1 Mục đích

1.2.2 Yêu cầu

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây quýt

2.2 Giới thiệu chung về công nghệ chuyển gen ở thực vật

2.2.1 Các phương pháp chuyển gen

2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

2.2.3 Các phương pháp đánh giá cây chuyển gen

2.3 Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới tạo quả không hạt

2.3.1 Các nghiên cứu tạo quả không hạt trên thế giới

2.3.2 Các nghiên cứu trong nước

2.4 Các nghiên cứu chuyển gen ở cây cam quýt bằng vi khuẩn A tumefaciens

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

3.2 Phương pháp

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.4 Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp của vi khuẩn

4.2 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

4.3 Ảnh hưởng của Acetosyringone (AS) đến sự biến nạp của vi khuẩn

4.4 Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi

4.5 Ảnh hưởng của môi trường tái sinh đến khả năng tái sinh và hiệu quả chuyển gen

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1.Kết luận

5.2 Đề nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến tỷ lệ mọc khuẩn trong thời

gian đồng nuôi cấy Bảng 2 Tỷ lệ mẫu sống sau rửa khuẩn Bảng 3 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến sự tái sinh chồi và hiệu

quả chuyển gen Bảng 4 Tỷ lệ mọc khuẩn trong thời gian đồng nuôi cấy Bảng 5 Tỷ lệ mẫu sống sau hai lần rửa khuẩn Bảng 6 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả tái sinh chồi

và hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn Bảng 7 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến tái sinh chồi và hiệu quả chuyển

gen Bảng 8 Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy đến khả năng tái sinh và

hiệu quả biến nạp của vi khuẩn Bảng 9 Ảnh hưởng của BAP và IAA đến khả năng tái sinh chồi ở quýt Đường

canh

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cơ chế chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Hình 2 Phản ứng sinh màu của hóa chất X-gluc

Hình 3 Chiến lược tạo quả không hạt

Hình 4 Sơ đồ sinh và mẫn cảm auxin/GA ở bầu nhụy

Hình 5 Cây con 3 tuần tuổi

Hình 6 Cấu trúc vector pDU04.4522

Hình 7 Sơ đồ quá trình thực hiện đề tài

Hình 8 Ảnh mẫu cấy trong môi trường đồng nuôi cấy khi lây nhiễm ở các thời gian khác nhau

Hình 7 Chồi tái sinh ở các thời gian lây nhiễm khác nhau

Hình 8 Vi khuẩn mọc trong thời gian đồng nuôi cấy

Hình 9 Chồi tái sinh khi đồng nuôi cấy ở các môi trường khác nhau

Hình 10 Hình ảnh kết quả nhuộm gen gus

Hình 11 Chồi tái sinh trên môi trường có nồng độ BAP và IAA khác nhau

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BA: 6-Benzyl Adenine

BAP: 6-Benzyl Adenopurine

IAA: indol-3-acetic acid

TÓM TẮT

Từ lâu chọn tạo giống không hat trên thế giới và nước ta đã tiến hành vàthu được sản phẩm quả không hạt đáp ứng được nhu cầu thị trường Tuy nhiênchuyển gen thông qua Agrobacterium tạo quả không hạt trên cam quýt mới chỉđược nghiên cứu ở nước ngoài, thu được quả không hạt ổn định và không làm ảnhhưởng đến chất lượng quả Vì vậy mục tiêu của đề tài là bước đầu tìm hiểu và xâydựng được quy trình chuyển gen tạo quả không hạt cho quýt Đường canh

Đoạn trụ trên lá mầm (epicotyl) dùng làm mẫu cấy được lây nhiễm với

dung dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang plasmid chứa gen mẫn cảm auxin rolB kết hợp với promotor hoạt động đặc thù bầu nhụy Kết quả thu

được từ những thí nghiệm cho thấy các yếu tố ảnh hưởng đến sự biến nạp của vikhuẩn là thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy, ảnh hưởng của hợp chấtAcetosyringone (AS) bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy, ảnh hưởng của môitrường đồng nuôi cấy; ảnh hưởng của các hormon đến khả năng tái sinh của mẫucấy

Kết quả thu được như sau: thời gian lây nhiễm 20 phút, thời gian đồng nuôicấy 2 ngày, nồng độ AS bằng không, môi trường đồng nuôi cấy là MS + 2 mg/LBAP + 0.5 mg/L Ki + 1 mg/L NAA + 8 g/L agar + 30 g/L Sucrose pH 5.7 là điềukiện tốt cho sự phát triển của mẫu cấy tạo chồi Sự tái sinh thành chồi chuyển gencao khi áp dụng 2 mg/L BAP và 0.2 mg/L IAA trên nền môi trường MS

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây ăn quả chi Citrus có giá trị cao về mặt dinh dưỡng đứng thứ 2 sau

chuối về tầm quan trọng và có ý nghĩa kinh tế ở Việt Nam Nhưng hạt trong quảcủa cây có múi là một đặc điểm không mong muốn, làm giảm chất lượng thươngphẩm và tính tiện lợi cho người tiêu dùng quả tươi và công nghiệp chế biến Vìvậy chọn tạo quả không hạt ở cây có múi thông qua chuyển gen trên thế giới đãđược nghiên cứu từ lâu Tuy nhiên vấn đề này mới được đề cập đến ở Việt Nam từvài năm nay và hiện đang là vấn đề cấp thiết nhằm đáp ứng nhu cầu của thịtrường

Tạo quả không hạt bằng phương pháp chọn tạo giống truyền thống có cácphương pháp khác nhau như lai xa, tạo cây tam bội không hạt, xử lý đột biến bằngcolchicine, dùng các chất kích thích sinh trưởng, chọn lọc các đột biến tự nhiên…Tuy nhiên các phương pháp trên thường tốn nhiều thời gian, không định hướngđược đột biến nên kết quả thấp và không ổn định

Bình thường sau khi thụ phấn thụ tinh tạo hợp tử, hợp tử sinh auxin kíchthích tế bào bầu nhụy phân chia, bầu nhụy lớn lên và tạo thành quả Như vậy cóthụ tinh thì mới có quả Tuy nhiên ở một số giống vô phối tạo quả không qua thụtinh, nhưng quả thường bị thui non và cần phải phun bổ sung auxin ngoại sinh đểtạo và nuôi quả

Nhờ phát triển công nghệ chuyển gen, hiện nay người ta đã tách được nhiều

gen từ các loại sinh vật khác nhau Trong đó có gen mẫn cảm auxin rolB từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, gen này được gắn với promoter INO từ thực vật hoạt động đặc thù bầu nhụy Khi tổ hợp gen rolB-INO hoạt động, chỉ cần một

lượng auxin nhỏ sản xuất ở đâu đó trong cây cũng có thể kích thích để bầu nhụyphân chia và lớn lên thành quả Công nghệ này đã thành công trên các đối tượng

cà chua, cà, thuốc lá và cả họ cam quýt trên thế giới Nhưng ở Việt Nam chưa cónghiên cứu nào tiến hành, liệu chúng ta có thể tiếp bước những thành tựu đó tạo

quả không hạt ở nước mình không? Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình chuyển gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào giống

quýt Đường Canh (Citrus reticulata) thông qua Agrobacterium tumefaciens

tạo quả không hạt”.

• Xây dựng được quy trình chuyển gen vào quýt Đường canh

• Xác định được thời gian đồng nuôi cấy thích hợp

• Xác định được thời gian lây nhiễm mẫu thích hợp

• Ảnh hưởng của Acetosyringone tới khả năng biến nạp của vi khuẩn

• Xác định được môi trường đồng nuôi cấy cho vi khuẩn chuyển gen tốt nhất

• Xác định được nồng độ chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho sự táisinh chồi

• Sử dụng chất X-gluc để phát hiện nhanh vật liệu chuyển gen có chứa gen

gus.

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây quýt

Quýt là loại chứa nhiều khoáng chất, vitamin, rất cần cho sức khỏe conngười, giúp chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ, tăng sức đề kháng chống chịu bệnhtật Theo Hoàng Ngọc Thuận, (2000) thì các loại cam quýt nói chung trong thànhphần thịt quả có chứa 6-12% đường (chủ yếu là đường saccaroza), hàm lượngvitamin C có từ 40-90 mg/100g tươi, các axit hữu cơ từ 0.4-1.2%, trong đó cónhiều chất có hoạt tính sinh học cao cùng với các chất khoáng và dầu thơm Quảquýt dùng để ăn tươi, làm mứt, chế nước giải khát và chữa bệnh Tinh dầu cất từ

vỏ quả, lá, hoa được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm

Các loại quả thuộc chi Citrus đã được dùng nhiều trong y học dân tộc củanhiều quốc gia trên thế giới Theo Lê Quý Đôn đã viết trong “Vân đài loại ngữ”:

“Quýt vàng là thượng phẩm, quýt đỏ, quýt vá, quýt cát là hạ phẩm, vỏ quýt có tínhkhoan trung, hạ khí, hạ đờm tiêu ích…” Hải Thượng Lãn Ông đã sử dụng nhiềuquả quýt non phơi khô trong các bài thuốc của mình Từ thế kỷ thứ XVI, các thầythuốc Trung Quốc, Ấn Độ đã tìm thấy tác dụng phòng ngừa bệnh dịch hạch, trịbệnh phổi và chảy máu dưới da của các loại cam quýt Ở Mỹ, năm 1938 các nhàkhoa học đã sử dụng kết hợp cam quýt với insulin chữa bệnh đái tháo đường Ởnước Nga việc sử dụng các loại quả có múi trong y học dân gian bắt đầu từ thế kỷXI

Quýt là cây ăn quả lâu năm, tương đối dễ trồng, ít kén chọn đất, là loại cây ănquả có năng suất ổn định nhất hiện nay Trên thế giới quýt được trồng hơn 100nước, chủ yếu ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới, năm 2001 sản suất khoảng 100triệu tấn và diện tích chiếm 7,2 triệu ha Các nước xuất khẩu cam quýt chính bao

gồm: Tây Ban Nha, Ixaren, Italia, Braxin, Mỹ… Các giống quýt được mô tả lầnđầu tiên vào năm 1837 và được trồng khắp các vùng trồng cam quýt trên thế giới.Sản lượng và tỷ trọng ngày càng tăng Theo nhiều tác giả quýt là loại có nguồngốc ở nước ta từ lâu đời Vì vậy hiện nay số lượng giống được phổ biến trong sảnxuất rất nhiều mặc dù chỉ qua con đường chọn giống dân gian

Trong các giống quýt trồng phổ biến ở nước ta hiện nay thì quýt Đường Canh

(Citrus reticulata) mà nhân dân ta vẫn quen gọi là cam được trồng hầu hết các địa

phương trong nước Đặc điểm của loại quýt này là vỏ mỏng và dai nên nhiều nơi gọi

là cam giấy, quả tròn dẹt, vỏ màu đỏ da cam hoặc đỏ gấc rất hấp dẫn Quả có 10-12múi, thịt quả có màu vàng da cam đậm, con tép mịn, ăn ngọt và ít hạt Tuy nhiên,nhược điểm chính của loại quýt này là hàm lượng axit citric thấp (0,3-0,5%) nên có vịngọt mát, không thích hợp với khẩu vị người tiêu dùng ngoài nước Vì vậy muốn pháttriển mạnh giống này để xuất khẩu cẩn phải tuyển chọn các dạng hình có hàm lượngaxit citric cao hơn (0,8-1%) Quýt Đường Canh được chọn lọc và trồng từ xa xưa ởlàng Canh Diễn, ngày nay đã phát triển khắp các huyện ngoại thành và cũng đượctrồng nhiều ở các huyện Văn Giang, Mỹ Văn (Hưng Yên) Cây sinh trưởng khỏenhưng thấp, cành nhỏ và phân cành rất mạnh Lá có màu xanh đậm hoặc xanh vàng,túi dầu tinh nhỏ và có mùi thơm nhẹ Giống chín sớm có kích thước lá to hơn giốngchín muộn, mép lá không có răng cưa, gợn sóng và dày, đuôi lá nhọn và dài, cuốngngắn, gần như không có eo lá Cây ra quả rất sớm, có thể có quả ngay trong vườnươm, trên những cây ghép Quýt Đường Canh có tính chống chịu với sâu bệnh tốthơn các giống khác trồng ở đồng bằng sông Hồng Hiệu quả kinh tế của việc trồnggiống này vẫn cao hơn trồng bưởi rất nhiều

2.2 Giới thiệu chung về công nghệ chuyển gen ở thực vật

Công nghệ chuyển gen ở thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đãđược thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng làm cho gen lạ

có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ,

các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiệncác đặc tính mới ở cơ thể chuyển gen.

2.2.1 Các phương pháp chuyển gen

Các phương pháp chuyển gen hiện nay được chia làm hai nhóm chính:

• Các phương pháp chuyển gen trực tiếp

Trong các phương pháp này gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vậtthông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định không cần phải nhờ các sinh vậttrung gian có các phương pháp chính sau:

• Phương pháp chuyển gen nhờ xung điện

• Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm

• Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

• Phương pháp chuyển gen nhờ súng bắn gen

• Chuyển gen trực tiếp vào protoplas

• Phương pháp chuyển gen nhờ siliconcacbit

• Các phương pháp chuyển gen gián tiếp:

• Phương pháp chuyển gen nhờ virus

• Phương pháp chhuyển gen thông qua Agrobacterium

2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng

cách chuyển một đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật Khi DNA vi khuẩn đượchợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tếbào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể

vi khuẩn, gây ra bệnh khối u và bệnh lông rễ ở nhiều loài cây ăn quả và cây cảnh

Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như một vector chuyển gen các nhà

khoa học đã loại bỏ gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-DNA và thay thếvào đó là các marker chọn lọc trong khi vẫn duy trì bờ trái và bờ phải của T-DNA

và các gen vir Gen chuyển được xen vào giữa của các vùng bờ của T-DNA Nó sẽ

được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật

Cơ sở của phương pháp

Phương pháp này dựa trên cơ chế gây u vết thương của vi khuẩn

A.tumefaciens Khi cây bị thương, vi khuẩn đã thâm nhập vào chỗ bị thương và

gây khối u Tiến hành phân tích thành phần các chất trong khối u thì thấy có nhiềuchất lạ Phân tích hóa sinh các hợp chất đó thì phát hiện các phức hợp arginin-xetoaxit, những hợp chất không có ở thực vật, vi khuẩn đã sử dụng những hợpchất đó trong quá trình đồng hóa Như vậy vi khuẩn đã chuyển vào trong tế bàothực vật tác nhân gây u và những tác nhân đó tổng hợp nên những hợp chất mới(Trần Quốc Dung, 2006)

Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thuộc bộ Rhizobiales, họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium, loài Agrobacterium tumerfaciens (Smith và

Townsend, 1907)

Agrobacterium tumefacium là vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các khối u

ở thực vật khi xâm nhiễm qua vết thương Tác nhân gây khối u chính là

Ti-plasmid có trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Ti-Ti-plasmid là một Ti-plasmid

có kích thước từ 2 - 200kb Trên Ti-plasmid có đoạn T-ADN được giới hạn bởi bờtrái và bờ phải có trình tự nucleotid tương tự nhau T-DNA là đoạn nucleotid cókích thước 25kb và mang 2 loại gen: loại gen gây u mã hóa cho một enzyme liênquan đến tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên

quan tới tổng hợp opine

T-DNA là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể

và gây ra bệnh u Trên Ti-plasmid còn có vùng vir gồm 6 nhóm từ virA đến virG

chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp và phân giảiopine

Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens:

Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các hợp chất kích thích gen virA và virG vùng gen vir của T-plasmid hoạt động Gen virA tạo nên protein thụ cảm kết hợp hợp chất của gen virG đi đến màng tế bào nhận tín hiệu từ tế bào thực vật.

Phức hợp này cùng với chất phenolic (như Acetocyringone) kích thích yếu tố

phiên mã tạo điều kiện cho vùng gen vir hoạt động: virD tạo nên protein cắt, cắt

bờ trái và bờ phải của đoạn T-DNA; virE tạo phức hợp protein, bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA bị cắt; virB tạo lỗ ở màng tế bào vi khuẩn cho đoạn T-DNA

ra khỏi tế bào

Khi vào tế bào thực vật, dưới tác động của enzyme phân giải protein thì vỏprotein bao quanh T-DNA bi phân hủy Sợi đơn T-DNA chuyển thành sợi đôi vàgắn vào DNA tế bào chủ qua chỗ đứt Sau đó là cơ chế sửa sai và ghép nối DNAbởi enzyme ligase tạo nên DNA tái tổ hợp

Sản phẩm gen virE2 tạo protein gắn kết sợi đơn để bảo vệ T-DNA trong nhân tế bào virF hoạt động trong tế bào thực vật tạo protein điều hòa chu kỳ tế

bào và kéo dài pha S của tế bào thực vật, tạo điều kiện tốt cho sự xen đoạn DNA (Dandekar, 2009)

T-Hình 1: Cơ chế chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

(Dandekar, 2009)

2.2.3 Các phương pháp đánh giá cây chuyển gen

• Đánh giá nhờ môi trường chọn lọc

Chọn lọc tế bào là thiết lập các điều kiện nuôi cấy để tế bào đó sinh trưởng vàphát triển tốt hơn Môi trường chọn lọc là môi trường chứa các chất ức chế sinhtrưởng hoặc các chất chọn lọc ở nồng độ mà tế bào không mang gen chuyển sẽchết, còn tế bào mang gen chuyển có khả năng kháng được Môi trường chọn lọc

có thể có kháng sinh, chất diệt cỏ, muối hoặc kim loại nặng… Để chọn lọc các tếbào mang gen chuyển nạp, người ta đưa vào vector chuyển nạp các gen chọn lọc

như gentamycin, nptII, hpt, bar, strep, cat…

• Đánh giá cây chuyển gen nhờ phương pháp PCR

Đây là phương pháp sử dụng cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao

từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase

Quy trình đánh giá cây chuyển gen nhờ phương pháp PCR:

Cây chuyển gen → Chuẩn bị mẫu → tách chiết DNA → PCR → điện di đọc kếtquả

• Đánh giá cây chuyển gen nhờ phương pháp lai Western blot

Western blot bao gồm các bước sau:

• Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE một hoặc haichiều

• Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trínhư đã phân tích trên gel

• Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (kháng thể đặc hiệu,bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quantâm)

• Ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp có enzyme (alkalin phosphatase hoặchorseradish peroxidase) đi kèm Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấpgiống như kháng thể sơ cấp bám vào protein

• Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme

• Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sángphát ra do enzyme (Nguyễn Quang Thạch, 2005)

• Đánh giá cây chuyển gen nhờ phương pháp lai Southern blot

Nguyên tắc của phương pháp là dùng mẫu dò đã biết để xác nhận sự hiệndiện của DNA tương đồng trong mẫu

Southern blot gồm các bước sau

• Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp

• Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose

• Làm biến tính DNA: có thể nhúng bản gel trong dung dịch NaOH 0.5M,DNA sợi kép sẽ được tách thành sợi đơn Chỉ DNA sợi đơn mới được chuyển lênmàng lai.

• Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai nitrocellulose, thực hiện lai với mẫu

dò đánh dấu để kiểm tra những đoạn DNA trên màng có trình tự bổ sung với mẫudò

• Sau khi kết thú phản ứng, màng lai được rửa sạch các mẫu dò không thamgia phản ứng

• Phát hiện vị trí lai nhờ phóng xạ tự ghi (Nguyễn Quang Thạch, 2005)

• Đánh giá cây chuyển gen nhờ sự có mặt của gen gus

Hình 2 Phản ứng sinh màu của hóa chất X-gluc

Những cây chuyển gen chứa gen mục tiêu và gen chỉ thị gus, gen gus sẽ

được biểu hiện bởi enzyme b-glucuronidase (GUS) Khi mô thực vật được nhuộmbởi hóa chất sinh màu X-gluc những mô chứa gen gus sẽ biến thành màu xanh.Trong plasmid thiết kế có chứa cả gen mục tiêu và gen chỉ thị Do đó kiểm tra sựxuất hiện của gen chỉ thị có thể kết luận là đã thành công Phép thử GUS cho kết

quả rõ ràng, an toàn trong các phòng thí nghiệm, dễ thực hiện và không đắt tiền(Susan và c ng s , 2002).

2.3 Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới tạo quả không hạt.

2.3.1 Các nghiên cứu tạo quả không hạt trên thế giới

Hạt là đặc tính khộng mong muốn của nhiều loại quả bởi vì có thể chúngcứng hoặc dai, vị đắng và nhiều hạt còn tích tụ nhiều hợp chất độc hại cho cơ thểcon người Hạt và khoảng trống của hạt còn thay thế phần mô quả ăn được Tínhkhông hạt của quả là một đặc tính hấp dẫn ở các loài, cam quýt có số hạt trên quảlớn, xoài có hạt to hoặc như đu đủ và dưa tây có khoảng trống hạt lớn Đối với càchua thì hạt có ảnh hưởng đến vị quả, hạt nhỏ, cứng khó tiêu hóa cho người vàđộng vật Còn hạt trong quả cây có múi cũng là một đặc tính không mong muốn,làm giảm chất lượng thương phẩm của quả và tính tiện lợi sử dụng đối với ngườitiêu dùng và chế biến nước quả Vì thế ngay từ 3000 năm trước công nguyên

người Ai cập và Hy lạp cổ đại đã mong muốn tạo được quả citrus không hoặc có ít

citrus do giao phấn nên hầu hết các gen đều tồn tại ở trạng thái dị hợp tử do vậy

người ta chỉ có thể dễ dàng chọn lọc được các gen trội Vì thế muốn chọn lọc đượcgen lặn đột biến phải tiến hành tự thụ cây M1 thu lấy hạt, trồng thành đời sau rồikiểm tra đánh giá các cây về tính trạng mong muốn làm như vậy phải tốn rất nhiềuthời gian và công sức

• Một chiến lược tạo giống tam bội bằng dung hợp tế bào trần hoặc lai hữutính lưỡng bội và tứ bội, tạo giống tam bội không hạt bằng nuôi cấy nội nhũ hạtnon (Gmitter và cộng sự, 1990) và dung hợp tế bào trần giữa cây nhị bội với câyđơn bội (Kobayashi và cộng sự, 1997) Thành công của kỹ thuật này phụ thuộctrước hết vào thành công của kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần sau đó là kỹ thuật chọnlọc tế bào dung hợp tam bội có đặc điểm mong muốn

•Tạo cây tứ bội bằng xử lý đột biến in vitro bằng colchicine, rồi lai cây nhị

bội với cây tứ bội sau đó cứu phôi có thể tạo cây tam bội Tuy nhiên phương phápnày gặp một số khó khăn do: 1) Thiếu nguồn gen các giống tứ bội có khả năngphối hợp cao để lai với cây nhị bội cho con lai tam bội không hạt, năng suất cao vàchất lượng tốt, 2) Các phôi tam bội hình thành sau khi lai thường bị kìm hãm pháttriên bởi mối bất hòa giữa nội nhũ và phôi, để phá vỡ mối bất hòa thì cần phải tiến

hành kỹ thuật cứu phôi non tam bội in vitro 3) Cây tam bội thường cho nhiều quả

nhỏ, dễ bị rụng hàng loạt nên thường cho năng suất thấp (Gmitter, 1995)

Như vậy các phương pháp gây và chọn lọc tạo cây cam quýt không hạt khácnhau, mỗi phương pháp do có ưu và nhược điểm riêng xét theo khả năng và thờigian thành công, biểu hiện của tính trạng thu được và giá trị sử dụng của vật liệuchọn giống tạo thành Vì thế cần xây dựng một phương pháp nhằm tạo nhanh cácgiống cam quýt không hạt trên cơ sở sử dụng các giống vô phối hoặc một phần cótính vô phối, đang trồng phổ biến và thích ứng tốt

Tuy nhiên sự hình thành hạt là một quá trình cần thiết cho sự phát triển quả:

sự phát triển của hạt thúc đẩy sự giãn nở tế bào theo hướng tổng hợp auxin và cácphân tử chưa biết khác Sự tích lũy các chất chuyển hóa với sự phát triển phôi điềukhiển tỷ lệ phân chia tế bào trong mô quả, ngoài ra số lượng hạt phụ thuộc kíchthước và trọng lượng cuối cùng của quả Như vậy, tính tạo quả không hạt là hìnhthành quả được mà không làm thay đổi chất lượng của quả

Thời gian gần đây, các phương pháp biến nạp di truyền được ứng dụng rộngrãi trong các chương trình cải tiến di truyền chi citrus và thay thế các phương pháp

chọn giống truyền thống Các nhà khoa học đã đưa ra một đề xuất táo bạo, mộthướng nghiên cứu mới nhằm tập trung những cố gắng để tạo ra bằng được quảkhông hạt, không qua quá trình thụ phấn hoặc thụ tinh tạo thành công nhiều giốngdưa hấu không hạt, nho khô không hạt, cà và cà chua không hạt bằng công nghệchuyển gen và đã chứng tỏ được khả năng của thao tác di truyền để hiện thựcmong muốn này (Varoquaux và cộng sự, 2000) Vấn đề cơ bản của công nghệchuyển gen là phải làm sao tạo được quả không hạt nhưng vẫn duy trì được sựphát triển của quả một cách bình thường để cho năng suất và chất lượng tốt Quy luật trong tự nhiên đó là thường quá trình phát triển của quả luôn gắnliền với việc tạo hạt, không kết hạt thì quả không phát triển được, làm cho quả bịthui hay bị rụng Quá trình có thể tóm tắt xẩy ra như sau: hoa được thụ phấn, sau

đó là quá trình thụ tinh xẩy ra, tạo nên hợp tử, từ đó hạt được hình thành, hạt sinh

ra hấp thụ và kích thích bầu nhuy phát triển thành quả Sơ đồ dưới đây nêu quátrình phát triển của quả hạt bình thường và các hướng chiến lược tạo quả khônghạt (hình 3)

Parthenocarpy

Stenospermocarpy

Hình 3 Chiến lược tạo quả không hạt

Trong tự nhiên có hai quá trình xẩy ra có thể tạo được quả không hạt đó là: 1)hiện tượng vô phối hay trinh sản (parthenocarpy) là hiện tượng quả phát triểnkhông cần xẩy ra quá trình thụ tinh vì thế quả không có hạt, 2) là trường hợp hạt bị

thui trong quá trình phát triển sớm của quả và như thế cũng tạo được quả khônghạt hoặc hạt bị lép và teo đi (stenospermocarpy) Đây là trường hợp tạo quả dưahấu tam bội không hạt là do trong cây quá trình phân bào giảm nhiễm xẩy ra bấtbình thường, còn trong trường hợp ở cây nho là do có một số sai sót nào đó xẩy ratrong quá trình phát triển của nội nhũ dẫn đến làm thui hạt

Hiện tượng vô phối được quan sát thấy ở rất nhiều loài cây trồng trong tựnhiên thí dụ như ở giống quýt Satsuma của Nhật bản, đây là một giống có hạt phấnbất dục do đó quả phát triển được nhưng không có hạt Một giống quýt không hạtkhác được phát hiện có tên là Clementine, tính không hạt ở giống này là do tính tựbất hợp của hạt phấn gây nên (Talon và cộng sự, 1992) Tuy nhiên, vấn đề chínhquan sát thấy ở nhiều giống có tính vô phối tự nhiên thường là có tỷ lệ kết quảthấp và kích thước quả nhỏ hơn so với bình thường Vì thế đối với kiểu vô phối ởgiống Satsuma thì người ta phải khắc phục bằng cách thụ phấn bổ sung, còn đốivới giống Clementine thì người ta phải phun thêm một số chất điều tiết sinhtrưởng nhóm gibberellin (GA), cytokinin hay auxin Riêng đối với auxin có vai tròlàm tăng kích thước và khối lượng quả Vì thế vấn đề đặt ra đối với cây họ camquýt là làm sao tạo được quả không hạt bằng cách kích thích tạo tính vô phối màkhông cần thụ phấn bổ sung và như thế sẽ không ảnh hưởng đến tỷ lệ đậu quả,kích thước và khối lượng quả

Hoạt động của các chất điều tiết sinh trưởng có trong bầu nhụy đóng vai tròquan trọng làm kích thích quá trình kết quả và phát triển của quả sau thụ phấn vàthụ tinh Nhiều ý kiến cho rằng sở dĩ có hiện tượng vô phối tự nhiên xẩy ra là doliều lượng các chất điều tiết sinh trưởng trong bầu nhụy được tăng lên đã gây kíchthích quá trình kết tạo quả trong khi không cần có sự thụ phấn hay thụ tinh(Gillaspy và cộng sự, 1993) Quan điểm này gần đây đã được kiểm chứng thôngqua thí nghiệm chuyển gen biểu hiện sản xuất đặc thù theo mô được trình bầy ở(Hình 4) Sự phát triển của quả vô phối được quan sát thấy trên cây thuốc lá và cây

cà, trong các cây này có chứa gen iaaM lấy từ vi khuẩn Pseudomonas syringae

kết hợp với promoter DefH9 tách từ cây hoa mõm chó Antirrhinum majus (Rotino

và cộng sự, 1997) Những cây chuyển gen đã tạo được quả không hạt mà khôngcần thụ tinh thậm trí ngay cả ở điều kiện môi trường khó khăn cho quá trình kếtquả so với cây không được chuyển gen Chứng tỏ có sự tăng cường việc tổng hợpauxin trong bầu nhụy xẩy ra ở giai đoạn phát triển sớm, với lượng đủ lớn để có thểthay thế được việc thụ tinh, cho phép quả phát triển tiếp tục trong khi không cóquá trình thụ tinh thực xẩy ra (Hình 4) Cây cà chuyển gen này đã được đánh giáqua ba thí nghiệm trên đồng ruộng và hai thí nghiệm trong nhà kính đều cho năngsuất cao hơn hẳn cây đối chứng không chuyển gen, hơn thế nữa chúng còn biểuhiện cho chất lượng cao hơn (Acciarri 2002)

Hình 4 Sơ đồ sinh và mẫn cảm auxin/GA ở bầu nhụy (Rotino và cộng sự,

2.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Các giống cây ăn quả hiện trồng ở nước ta, trong đó có nhiều giống truyềnthống như bưởi Năm Roi, Phúc Trạch, Da xanh, Đoan Hùng, Diễn và nhiều giốngcam quýt khác đang trồng như cam Sành (Hà giang, Tuyên Quang), cam Xã đoài

(Nghệ An), cam Vân du (Thanh hoá); quýt vàng vỏ giòn, quýt chum (Hà giang)

vv Tuy nhiên, các giống này phần lớn đều có nhiều hạt đã làm giảm chất lượngquả và khó có thể xuất khẩu ra một số thị trường khó tính như Mỹ, Nhật Bản vàChâu Âu, vì thế cần thiết phải tìm cách làm cho quả của các giống này không hoặc

có ít hạt

Trong số các giống đang trồng hiện nay có một số giống có tính vô phốikhông hạt như Satsuma B.S (Mỹ), Cam Navel (Mỹ), giống Persian lime (Mỹ), cácgiống này nếu trồng cách ly thì hoàn toàn không có hạt, nếu trồng xen với giốngkhác thì có ít hạt đến không hạt như giống Persian lime, chúng đều có đặc điểmbất dục đực, do hạt bị teo đi hoặc không có khả năng nẩy mầm (Đỗ Năng Vịnh vàcộng sự 2005) Cũng theo nhóm tác giả Đ.N Vịnh còn phát hiện một số giốngtrong điều kiện trồng cách ly và trồng xen đều có ít hạt như giống cam Hamlin có2.0 - 2,8 hạt/quả, cam Valencia Olinda (2,0 - 3,2 hạt/quả), cam Đường canh (2,0 –5,96 hạt/quả) Trong điều kiện trồng xen bưởi Năm Roi có trung bình 0,4 hạt/quả,cam Sông con có 2,5 hạt/quả và quýt Chum có 6,2 hạt/quả Tuy nhiên các giốngtrên đều có nguồn gốc từ nước ngoài, vào Việt nam chưa thích ứng tốt và cho năngsuất thấp do tỷ lệ đậu quả thấp, nếu được chuyển gen sản sinh hoặc phản ứng đặcthù bầu nhụy vào sẽ có khả năng cho năng suất cao hơn và trong tương lai sẽ đượctrồng mở rộng ra sản xuất hơn

Nghiên cứu chọn tạo giống cam quýt không hạt ở Việt Nam chủ yếu theo conđường tìm kiếm các đột biến tự nhiên và nhập nội giống từ nước ngoài như đãtrình bầy ở trên Ngô Xuân Bình (2005) đã nghiên cứu khá sâu về cơ chế tự bấthợp ở cây có múi tạo quả không hạt Công trình này cho thấy tự bất hợp là do cơchế ức chế sinh trưởng ống phấn của vòi nhụy được thụ phấn bởi hạt phấn có cùngkiểu alen

Viện Di truyền Nông nghiệp do PGS.TS Đỗ Năng Vịnh đã và đang thựchiện đề tài chọn tạo giống cam chanh quýt bưởi không hạt bằng con đường gây đabội rồi từ đó chọn lọc và tạo cây tam bội và đã thu được một số dòng đa bội đang

khảo nghiệm, bước đầu cho một số kết quả khá khả quan Tạo dòng tứ bội bằng xử

lý colchicine tế bào invitro Đánh giá mức bội thể bằng máy đo độ bội thể (Flowcytomettry) chọn dòng tứ bội sử dụng làm vật liệu lai với thể lưỡng bội tạo giốngtam bội không hạt Một hướng tạo cây tam bội khác, tác giả sử dụng là nuôi cấyhạt nhỏ, hạt lép từ các giống địa phương trên nền môi trường MT bổ sung các chấtkích thích sinh trưởng, sau 30 ngày đem đánh giá hình thái và đo độ bội thể chọnlọc dòng tam bội Ngoài ra, dung hợp tế bào trần nhị bội với tế bào trần đơn bộitạo dòng tam bội không hạt cũng được tác giả và cộng sự thực hiện

Trường Đại học Thái nguyên do PGS.TS Ngô Xuân Bình đang thực hiện

đề tài chọn tạo giống cây citrus không hạt bằng gây tạo và chọn lọc các dòng đột

có tính vô phối không ổn định, mức độ vô phối khác nhau, và cũng có thể không

cho quả Hướng chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium trong

chọn giống cam quýt đã được ứng dụng phổ biến trên thế giới cho nhóm cây cómúi

Lây nhiễm là thao tác tạo điều kiện tiếp xúc của mẫu với vi khuẩn, để vikhuẩn bám vào mẫu và thực hiện việc chuyển gen Thời gian lây nhiễm khác nhauảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn khác nhau Almeida và cộng sự

(2003) đã tiến hành thí nghiệm chuyển gen đoạn epicotyl của Citrus cinensis và Citrus limonia trong các thời gian là 5, 10, 20 và 40 phút Tác giả đã đưa ra kết

quả lây nhiễm mẫu với vi khuẩn trong 20 phút cho hiệu quả biến nạp tốt nhất.Năm 2003, Pena và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm tạo cam ngọt và quýt Carrizochuyển gen thành công khi thời gian lây nhiễm là 15 phút

Trong giai đoạn đồng nuôi cấy, nhiệt độ có vai trò quan trọng tới hiệu quảchuyển gen Dillen (1997) đã báo cáo không có sự khác biệt ở nhiệt độ 19 và 230Ctới hiệu quả chuyển gen, nhưng lại cho kết quả GUS+ thấp khi đồng nuôi cấy ở

250C Tác giả đã cho rằng nhiệt độ giai đoạn này ảnh hưởng đến sự ổn định của DNA xen vào Ghorbel (2000) đưa ra nhiệt độ trong khoảng 22 - 260C thuận lợicho chuyển gen của Agrobacterium khi sử dụng mẫu cấy là đoạn thân

T-Thời gian đồng nuôi cấy là khoảng thời gian mẫu cấy và vi khuẩn đượcnuôi cấy trong cùng một môi trường Thời gian này tính từ sau khi lây nhiễm mẫuvới vi khuẩn, mẫu được đặt trong môi trường đồng nuôi cấy cho đến khi đem đi

rửa khuẩn Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có bản chất là vi khuẩn gây bệnh

thực vật nên ngoài tác dụng chuyển gen nó còn có ảnh hưởng xấu đến khả năngsống và tái sinh của thực vật Do vậy, thời gian đồng nuôi cấy thích hợp sẽ tạođiều kiện cho vi khuẩn xâm nhiễm và tiến hành quá trình chuyển gen vào mô thựcvật, đồng thời giúp cho bước diệt khuẩn dễ dàng Tuy nhiên trên từng đối tượng

mô khác nhau cho kết quả tốt khác nhau Khawale và cộng sự (2006) tiến hànhđồng nuôi cấy trong 2 ngày cho kết quả cao trên đối tượng mẫu cấy là lá mầm(cotyledon) Almeida và cộng sự (2003) đưa ra kết quả đồng nuôi cấy 3 ngày trênđối tượng là đoạn trụ trên lá mầm (epicotyl)

Thành phần môi trường đồng nuôi cấy có vai trò quan trọng, tạo điều kiệncho vi khuẩn xâm nhập và thực hiện chuyển gen thành công Pena và cộng sự(2003), đưa ra môi trường đồng nuôi cấy thích hợp cam ngọt Valencia là môitrường giàu auxin bao gồm thành phần môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D, 2mg/L IAA, 1 mg/L 2i-P, Almeida và cộng sự (2003) đã dùng môi trường EME bổ

sung 25 g/L sucrose và 1.0 mg/L BAP với cam ngọt, bổ sung 2.0 mg/L BAP vớichanh Rangpur.

Nguồn mẫu cấy đưa vào chuyển gen theo nghiên cứu của Khawale và công sự(2006) trên đối tượng quýt Nagpur mandarin là đoạn lá mầm cotyledon từ hạt chín.Nghiên cứu sử dụng đoạn thân có đốt (internodal) là vật liệu biến nạp như nghiên cứucủa Pesrez-Molphe và Ochoa-Alejo tạo sản phẩm chanh lime chuyển gen Đa số cácnghiên cứu sử dụng đoạn trụ trên lá mầm epicotyl làm nguồn mẫu lây nhiễm và thuđược thành công trong biến nạp Kết quả nghiên cứu của Pẽnna và cộng sự (2003)cũng đã công bố dùng đoạn epicotyl làm vật liệu chuyển gen Hạt thu từ quả chín rửasạch nhớt và khử trùng bằng hóa chất, gieo hạt trong điều kiện tối trong 2 tuần, sau đóchuyển ra điều kiện 16h chiếu sáng trong 1 tuần Cắt đoạn mẫu cấy từ cây con vôtrùng này

Nghiên cứu chuyển gen của Li và cộng sự (3/2003) trên đối tượng callus

cam ngọt Valencia (C sinensis (L) Osbeck) thông qua vi khuẩn A tumefaciens

đưa ra hiệu quả biến nạp cao khi 4 ngày tiền nuôi cấy callus trong môi trườnglỏng, đồng nuôi cấy thực hiện trong 3 ngày ở 190C hơn là ở 230C hoặc 280C, bổsung 100 μM AS làm tăng khả năng biến nạp của vi khuẩn và không callus nào cósức đề kháng nếu môi trường đồng nuôi cấy thiếu AS

Theo Henzi (2000) thì bổ sung AS vào dung dịch lây nhiễm hoặc môi

trường đồng nuôi cấy làm tăng sự biểu hiện của gen vir và làm tăng phạm vi và tỉ

lệ biến nạp Các tác giả Cervera (1998a) thu được cây chuyển gen khi sử dụng AS

ở nồng độ 100μmol/L trên cây cam ngọt Pineapple, Luth và Moore (1999) trên đốitượng Duncan grapefruit, Bond và Roose (1998) sử dụng nồng độ 200μmol/L trêncam ngọt Washiton navel Tuy nhiên, AS lại không cần thiết trong một vài loại mô

bị thương khi mà các hợp chất phenolic đã đủ cho gen vir hoạt động Almeida và

cộng sự cũng cho kết quả AS không cần thiết cho sự biến nạp đoạn epicotyl và khi

sử dụng ở hai nồng độ 100 hoặc 200 μmol/L đều không cho kết quả biến nạp tốthơn so với đối chứng vì các hợp chất phenolic giải phóng ra đủ cho sự biến nạp.Kết quả này cũng được công bố bởi Pena (1995a) trên đối tượng Carrizo citrange

Sự thành công của chuyển gen bao gồm sự kết hợp ổn định của DNA ngoạilai trong genome của cây chủ và tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ tế bào đã chuyểngen Hai quá trình độc lập này tạo giới hạn sự thành công cây chuyển gen Nhiềuloài cam quýt có tần số tái sinh thấp và vô hiệu Trong chi Citrus đoạn epicotyl vàinternodal được sử dụng rộng rãi tái sinh cây theo hướng phát sinh cơ quan hìnhthành chồi hoặc phát sinh gián tiếp thông qua dạng callus từ mẫu cấy.

Garcias-Luis và cộng sự (1986) đã thu được nghiên cứu về ảnh hưởng củakiểu gen, điều kiện nuôi cấy, môi trường xác định và phương pháp tái sinh Cáctác giả đã chỉ ra rằng bổ sung cytokinin 6-benzylaminopurin (BAP) là một sự cầnthiết của tái sinh chồi trong khi sự đóng góp của auxin là phần nhỏ Trong nuôicấy mô, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò rất quan trọng Kết quả nghiêncứu năm 2006 của Duan và cộng sự cho biết các callus hình thành ở hai đầu mẫu,

sự hình thành chồi tăng khi nồng độ BA tăng, tuy nhiên kết hợp IAA với BA ởnồng độ 0.2mg/l IAA với 2.0mg/l BA số lượng chồi lên tối đa tới 8, 9 chồi trênmột mẫu cấy nhưng ở nồng độ BA là 1.0 mg/L và 3.0 mg/L thì số chồi giảm Điềunày khác với các báo cáo trước đây, khi mà có sự đóng góp có ý nghĩa của auxintrong việc hình thành chồi Điều đó cho thấy các kiểu gen khác nhau và nồng độkhác nhau của hormon dẫn đến kết quả khác nhau

Ngoài ra, các nghiên cứu về kiểu cắt đoạn thân làm mẫu cấy đều cho kếtquả làm ảnh hưởng đến sự hình thành chồi, số lương chồi tái sinh tăng khi miềncắt mở rộng (Yu, 2002) Sự biến nạp xảy ra hầu hết ở các tế bào đang phân chianhư callus tượng tầng hình thành ở các đầu cắt của mẫu cấy (Cervera, 1998).Ngoài kiểu cắt ngang và cắt dọc thì cắt xiên cũng được nghiên cứu bởi Duan,

2006 Kết quả cho thấy cắt xiên và dọc có thể tăng miền tiếp xúc của đoạn epicolylvới vi khuẩn và hình thành callus và tái sinh chồi hơn kiểu cắt ngang Cắt dọc cho

số lượng chồi trên một mẫu cấy nhiều, kiểu cắt xiên cho chồi ít hơn và ít nhất làkiểu cắt ngang Tuy nhiên phần lớn chồi tái sinh từ mẫu cấy cắt dọc thì yếu và nhỏhơn chồi tái sinh từ cắt xiên

Sử dụng giống Agrobacterium tốt mang vector chứa gen mục tiêu, gen chỉ thị

và gen chọn lọc; điều kiện lây nhiễm và đồng nuôi cấy tốt, xác lập được môitrường nuôi cấy tạo sản phẩm chuyển gen cây cam quýt cao Ngoài ra, sử dụngnguồn vật liệu, sự phát hiện các tế bào chuyên hóa cho biến nạp trong mẫu cấy, sửdụng các gen chỉ thị chuyên dùng và nhanh tạo ra cây chuyển gen hoàn chỉnhthông qua vi ghép các chồi chuyển gen lên các cây gốc ghép khỏe trước tiên làinvitro và sau đó là trong nhà kính rẽ tạo ra sản phẩm chuyển gen cam quýt ổnđịnh và tốt

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

• Quýt Đường canh

Cây con 3 tuần tuổi: hạt tươi của giống

quýt Đường canh tách từ quả chín được khử

trùng và gieo trong điều kiện in vitro trên môi

trường rắn MS + 30g/L saccarose + 8 g/L agar

Thời gian nuôi cấy hạt khoảng từ 3 tuần (2

tuần tối, 1 tuần sáng)

Hình 5 Cây con 3 tuần tuổi

• Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 chứa plasmid pDU04.4522 (dài 20681 bp) mang gen mẫn cảm auxin rolB, promotor hoạt động đặc

thù bầu nhụy INO, gen chỉ thị GUS Vi khuẩn đang được bảo quản trong tủ lạnh sâu-800C

Hình 6 Cấu trúc vector pDU04.4522

3.2 Phương pháp

Hình 7 Sơ đồ quá trình thực hiện đề tài.

• Phương pháp gieo hạt

Trước khi tiến hành thí nghiệm, hạt được đưa ra và để ở nhiệt độ phòngkhoảng 30 phút, bóc bỏ lớp vỏ bên ngoài sau đó khử trùng bề mặt hạt với dungdịch 0.75% NaOCl + 0.1%Tween 20 trong 10 phút sau đó rửa 5 lần trong nước cất

vô trùng nếu khử trùng bằng dung dịch tạo từ viên sủi khử trùng y tế johnson thìkhông cần rửa lại bằng nước cất vô trùng Gieo một hạt vào một ống nghiệm chứamôi trường MS + 30g/L saccarose + 8 g/L agar Để trong tối khoảng 2 tuần.Chuyển ra phòng nuôi cấy mô khoảng 1 tuần với chế độ sáng 16h, nhiệt độ 20 –

260C, ẩm độ 60 – 70 %

• Phương pháp chuẩn bị mẫu cấy

Khủ trùng buồng cấy 15 phút trước khi thưc hiện thao tác cắt mẫu cấy Lấyđoạn thân epicotyl dài 1cm làm vật liệu cho chuyển gen Cắt vát 2 đầu và dùngdao khía tạo lỗ trên mẫu

• Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn

* Nuôi vi khuẩn trong môi trường rắn: Lấy vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens chủng C58 tái tổ hợp đang bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C đưa ra để

ở nhiệt độ phòng Lấy 100µl vi khuẩn vào đĩa pettri chứa môi trường nuôi cấy vikhuẩn LB chứa kháng sinh Gentamycin nồng độ 30mg/L

Thành phần môi trường LB Cho 1 lit môi trường

Lấy 1 vòng vi khuẩn trong đĩa Petri cho vào 100mL dung dịch nuôi YMBchứa trong bình tam giác, môi trường chứa kháng sinh Chế độ nuôi lỏng lắc quađêm khoảng từ 16-20h Đo OD ở bước sóng 600nm để xác định mật độ vi khuẩntrước khi đem lây nhiễm đạt 0,8.

• Phương pháp lây nhiễm mẫu với vi khuẩn

Đoạn epicotyl khoảng 1cm được nhúng ngập trong dịch vi khuẩn đã nuôi ởtrên, sau đó lấy ra làm khô trên giấy thấm vô trùng rồi đặt vào môi trường đồngnuôi cấy

• Môi trường đồng nuôi cấy: Mẫu sau khi cho nhiễm khuẩn được chuyển sang

môi trường đồng nuôi cấy MS + 30g/L saccarose + 8g agar + 1mg/L BAP, pH 5.7trong thời gian 3 ngày trong điều kiện tối, rồi chuyển sang môi trường tái sinhchồi

• Phương pháp rửa khuẩn

Dung dịch rửa khuẩn là môi trường MS hoặc nước đường hấp khử trùng, bổsung kháng sinh cefotacime nồng độ 300mg/L

Gắp mẫu bỏ vào lọ chứa nước cất vô trùng, lắc trong khoảng 15-20 giây, tiếptục rửa khuẩn trong nước cất 2 lần nữa Lặp lại thao tác rửa này trong dung dịchrửa vi khuẩn đã chuẩn bị ở trên

Gắp mẫu ra giấy thấm vô trùng, thấm khô và đặt vào môi trường tái sinh

• Nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi:

Môi trường tái sinh chồi là MS + 3 mg/l BAP + 8 g/l agar, bổ sung 30 mg/LGentamycin và 300 mg/L cefotaxime Thời gian nuôi cấy trong môi trường táisinh 2 - 4 tuần, trong điều kiện 16h chiếu sáng ở nhiệt độ 260C, ẩm độ 60-70%.Mỗi đĩa Petri đặt 4 mẫu Sau 3 tuần cấy chuyển một lần

• Phương pháp test gen GUS (Jefferson, 1987)

• Chuẩn bị 1 mL dung dịch đệm (0,1M Tris-HCl, 50µM NaCl, pH = 7),

• Lấy 10µL dung dịch X-gluc glucuronide) (dung dịch này được chuẩn bị như sau 50mg X-gluc hòa tan trong1mL DMSO (Dimethyl Sulfoxide))

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-• Cho mẫu vào dung dịch đệm ủ qua đêm ở nhiệt độ 37°C trong bóng tối

Để dễ dàng quan sát, ta có thể loại bỏ diệp lục bằng cách ngâm mẫu vào trong bểchứa cồn 70% 2h trước khi quan sát Nếu thấy mẫu xuất hiện các mô màu xanhlam đặc trưng chứng tỏ các mô này đã được biến nạp và chứa gen GUS

3.3 Nội dung nghiên cứu

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần,mỗi công thức 36 mẫu

TN1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm chủng vi khuẩn đến khả năng chuyển gen của Agrobacterium

CT Thời gian (ngày)

ĐC Không lây nhiễm

TN4 Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy đến khả năng tái sinh và biến nạp của vi khuẩn.

CT Môi trường

1 (ĐC) MS + 8g/L agar + 30g/L Sucrose pH 5.7

2 MS + 1mg/L BAP + 8g/L agar + 30g/L Sucrose pH 5.7

3 MS + 2 mg/L BAP + 0.5 mg/L Ki + 1 mg/L NAA + 8g/L agar +

Môi trường sử dụng: MS + 8g/L agar + 30g/L Sucrose pH 5.7

3.4 Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu

- Các chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ mẫu mọc khuẩn (%) = Tổng số mẫu mọc khuẩn / 36 x 100

Tỷ lệ mẫu sống sau rửa khuẩn (%) = Tổng số mẫu sống / 36 x 100

Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = Số mẫu ra chồi / 36 x 100

Số chồi / mẫu = Tổng số chồi / tổng số mẫu ra chồi

Tỷ lệ mẫu chuyển gen (%) = Số chồi cho GUS+/ số chồi đem kiểm tra x100

- Số liệu được xử lý bằng thống kê sinh học chương trình Excel và phần mềmIRRISTAT 4.0

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp của vi khuẩn.

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn sống trong đất, thường gây

bệnh khối u hình chóp và bệnh lông rễ ở chủ yếu là thực vật 2 lá mầm thông quavết thương ở rễ Thực hiện thao tác lây nhiễm là tạo điều kiện tiếp xúc giữa vikhuẩn và mẫu bắt đầu cho quá trình xâm nhiễm tiếp theo của vi khuẩn Tuy nhiêncần có thời gian để vi khuẩn bám vào khắp mẫu tạo khả năng tiếp xúc đồng đềutrên mẫu Nếu thời gian lây nhiễm ngắn quá, lượng vi khuẩn trên bề mặt mẫu ítdẫn tới khả năng xâm nhập vào các mô không đồng đều, hiệu quả chuyển genthấp Đồng thời nếu lây nhiễm mẫu với vi khuẩn lâu quá thì lượng vi khuẩn bámtrên mẫu quá nhiều, gây nhiễm khuẩn nặng và khả năng rửa khuẩn sau này sẽ khókhăn Thí nghiệm này được thực hiện trong 3 khoảng thời gian lây nhiễm khácnhau là 15 phút, 20 phút và 25 phút, nhằm tìm ra thời gian lây nhiễm cho kết quảchuyển gen tốt nhất Kết quả theo dõi tỷ lệ mọc khuẩn trong 3 ngày đồng nuôi cấy

ở các thời gian lây nhiễm khác nhau thu được bảng sau:

Bảng 1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến tỷ lệ mọc khuẩn trong thời

gian đồng nuôi cấy.

Lây nhiễm 15 phút Lây nhiễm 20 phút