Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.4. Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi
Trong thời gian đồng nuôi cấy, vi khuẩn thực hiện chức năng chuyển gen của mình. Giai đoạn này, giới tác động của các hợp chất phenolic do tế bào thực vật bị thương sinh ra kích thích vùng gen vir của vi khuẩn hoạt động. Lúc này đoạn T-DNA được cắt ra khỏi vector, chuyển sang tế bào thực vật. Trong tế bào thực vật, sợi đơn DNA ngoại thành sợi đôi và xen vào genome tế bào. Auxin trong môi trường đồng ni cấy có một vai trị rất quan trọng là kích thích phân chia, làm cho tỷ lệ tế bào thực vật phân chia ở pha S nhiều hơn trong thời gian đồng nuôi cấy. Pena (2004) đưa ra kết quả nghiên cứu cho rằng tế bào thực vật ở pha S sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự xen của DNA ngoại lai.
Qua nghiên cứu chúng tôi thu được kết quả ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy đến khả năng tái sinh và hiệu quả biến nạp như sau:
Bảng 8. Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy đến khả năng tái sinh và hiệu quả biến nạp của vi khuẩn.
CTTD Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu ra chồi (%) Số chồi / mẫu (chồi) % chồi GUS+ Ghi chú
CT 4 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần 8 tuần
1 86.1 13.8 19.5 25.0 1.1 0 Chồi nhỏ, cao
2 80.6 13.9 22.2 27.8 1.3 0 Chồi nhỏ, nhiều
3 83.3 16.7 25.0 33.3 1.6 0 Chồi mập
Chú thích:
(1) (ĐC) : MS + 8g/L agar + 30g/L Sucrose. pH 5.7
(2) : MS + 1 mg/L BAP + 8g/L agar + 30g/L Sucrose. pH 5.7
(3) : MS + 2 mg/L BAP + 0.5 mg/L Ki + 1 mg/L NAA + 8g/L agar + 30g/L Sucrose. pH 5.7
Kết quả bảng trên cho thấy:
• Trên các mơi trường đồng ni cấy bổ sung các chất hormon khác nhau cho tỷ lệ tái sinh chồi khác nhau. Cơng thức đối chứng khơng bổ sung chất kích thích sinh trưởng cho tỷ lệ tạo chồi thấp chỉ 25%. Môi trường đồng nuôi cấy bổ sung 1mg/L BAP cho tỷ lệ tạo chồi lớn hơn là 27.8%. Trong khi đó bổ sung 2 mg/L BAP, 0.5 mg/L Ki, 1mg/L NAA cho tỷ lệ ra chồi lớn hơn hẳn (33.3%).
• Môi trường bổ sung cả auxin và cytokinine (CT3) phát sinh chồi sớm hơn. Ngay thời gian 4 tuần sau nuôi cấy, số mẫu phát sinh chồi chiếm 16.7%, sau 6 tuần nuôi cấy số mẫu ra chồi chiếm 25%, và sau 2 tháng ni cấy mơ thì đạt 33.3% mẫu ra chồi. Không những ra chồi sớm, tỷ lệ mẫu ra chồi cao, mơi trường này cho kết quả trung bình số chồi trên mẫu (1.6 chồi) lớn hơn môi trường không bổ sung chất kích thích sinh trưởng và bổ sung BAP với nồng độ 1mg/L.
• Kết quả nhuộm cho thấy khơng có sự biểu hiện của gen gus. Điều này nói lên sự chuyển gen không thành công của vi khuẩn. Tuy nhiên có khả năng là gen đã chuyển được nhưng lại khơng biểu hiện. Có thể số mẫu tái sinh thành chồi quá ít (cao nhất là 33.3%, tức khoảng 12 chồi / một công thức), mà xác suất chuyển gen thành cơng của vi khuẩn rất nhỏ, vì vậy chưa đánh giá được khả năng chuyển gen. Cũng có thể mẫu đã được chuyển gen nhưng lại ở dạng thể khảm, không biểu hiện ở chồi nên khi kiểm tra bằng hóa chất nhuộm khơng phát hiện thấy.
• Kết luận: Mơi trường đồng ni cấy thích hợp trong chuyển gen quýt Đường Canh là MS + 2 mg/L BAP + 0.5 mg/L Ki + 1 mg/L NAA + 8g/L agar + 30g/L Sucrose. pH 5.7
b a
c
Hình 9. Chồi tái sinh khi đồng ni cấy ở các môi trường khác nhau
Chú thích:
• Đồng ni cấy mơi trường MS khơng bổ sung hormon. • Đồng ni cấy mơi trường MS + 1mg/L BAP.
• Đồng ni cầy mơi trường MS + 2 mg/L BAP + 0.5 mg/L Ki + 1 mg/L NAA + 8g/L agar + 30g/L Sucrose. pH 5.7