Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp của vi khuẩn
Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn sống trong đất, thường gây bệnh khối u hình chóp và bệnh lơng rễ ở chủ yếu là thực vật 2 lá mầm thông qua vết thương ở rễ. Thực hiện thao tác lây nhiễm là tạo điều kiện tiếp xúc giữa vi khuẩn và mẫu bắt đầu cho quá trình xâm nhiễm tiếp theo của vi khuẩn. Tuy nhiên cần có thời gian để vi khuẩn bám vào khắp mẫu tạo khả năng tiếp xúc đồng đều trên mẫu. Nếu thời gian lây nhiễm ngắn quá, lượng vi khuẩn trên bề mặt mẫu ít dẫn tới khả năng xâm nhập vào các mô không đồng đều, hiệu quả chuyển gen thấp. Đồng thời nếu lây nhiễm mẫu với vi khuẩn lâu quá thì lượng vi khuẩn bám trên mẫu quá nhiều, gây nhiễm khuẩn nặng và khả năng rửa khuẩn sau này sẽ khó khăn. Thí nghiệm này được thực hiện trong 3 khoảng thời gian lây nhiễm khác nhau là 15 phút, 20 phút và 25 phút, nhằm tìm ra thời gian lây nhiễm cho kết quả chuyển gen tốt nhất. Kết quả theo dõi tỷ lệ mọc khuẩn trong 3 ngày đồng nuôi cấy ở các thời gian lây nhiễm khác nhau thu được bảng sau:
Bảng 1. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến tỷ lệ mọc khuẩn trong thời gian đồng nuôi cấy.
Công thức
Thời gian lây nhiễm
(phút)
Tỷ lệ mẫu mọc khuẩn sau lây nhiễm (%) Ghi chú (sau 2 ngày đồng
nuôi cấy)
1 ngày 2 ngày 3 ngày
ĐC 0 0 0 0 Sạch khuẩn
1 15 8 83 100 Vòng khuẩn nhỏ
2 20 17 89 100 Vòng khuẩn vừa
Lây nhiễm 25 phút Không lây nhiễm
Hình 8. Ảnh mẫu cấy trong mơi trường đồng ni cấy khi lây nhiễm ở các thời gian khác nhau
Kết quả ở bảng trên cho thấy:
•Ngày thứ nhất sau khi lây nhiễm vi khuẩn bắt đầu phát triển nhưng chỉ xuất hiện ở một số lọ ở các công thức khác nhau, chiếm tỷ lệ 8% khi lây nhiễm 15 phút, còn lây nhiễm 20 và 25 phút cho tỷ lệ mọc khuẩn lúc này là 17%. Sang ngày thứ 2 khuẩn mọc ở phần lớn mẫu đạt trên 80%, cao nhất là công thức 3 với thời
gian lây nhiễm 25 phút là 95%, lây nhiễm ở thời gian 15 phút và 20 phút cho tỷ lệ khuẩn mọc thấp hơn (83% và 89%).
•Ngày thứ 3, 100% các mẫu ở tất cả các cơng thức đều có khuẩn mọc. Tuy nhiên hình thái khuẩn mọc trên mẫu ở các công thức khác nhau là khác nhau: phần lớn cơng thức lây nhiễm 15 phút vịng khuẩn nhỏ, chỉ bao phủ xung quanh mẫu; lây nhiễm 20 phút khuẩn lan rộng ra xa mẫu; còn lây nhiễm 25 phút phần lớn khuẩn lan rộng, mọc dày hơn công thức 2 rất nhiều.
Vậy khi lây nhiễm mẫu với vi khuẩn xét về tỷ lệ khuẩn mọc đồng đều, vi khuẩn không nhiều quá mức thì lây nhiễm 20 phút là hợp lý.
Tiếp tục theo dõi tỷ lệ mẫu sống sau 2 lần rửa khuẩn. Sau đồng nuôi cấy 3 ngày tiến hành rửa khuẩn chuyển mẫu sang mơi trường diệt khuẩn có bổ sung kháng sinh. Sau lần rửa khuẩn này 2 tuần theo dõi thì tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn ở cơng thức 3 vẫn cịn, mẫu vẫn có khuẩn phủ đầy, có một số mẫu có hiện tượng vàng thâm lại và chết. Rửa khuẩn lần 2 được tiến hành sau đó và theo dõi tỷ lệ sống sau 2 tuần rửa khuẩn. Lần này tỷ lệ sống của mẫu yếu đi dưới tác động của thao tác rửa khuẩn mẫu chết đáng kể. Kết quả theo dõi thu được ở bảng sau:
Bảng 2. Tỷ lệ mẫu sống sau rửa khuẩn
CT
Thời gian lây nhiễm
(Phút)
Tỷ lệ mẫu sống sau 2 lần rửa
khuẩn (%) Ghi chú
sau 2 lần rửa khuẩn
Lần 1 Lần 2
ĐC 0 83.30 75.00 Mẫu vàng, yếu
1 15 94.67 80.33 Mẫu xanh đẹp
2 20 80.33 72.33 Mẫu xanh đẹp
3 25 75.00 67.00 Mẫu xanh, nhỏ.
Qua bảng trên ta thấy rằng:
•Sau 2 lần rửa khuẩn số mẫu sống ở công thức 3 thấp hơn chiếm 67% trong khi ở cơng thức 1 và 2 số mẫu sống cịn lại 80.33 và 72.33%. Đồng thời ta thấy mẫu chết dần theo thời gian do ảnh hưởng của việc rửa khuẩn và sự tồn tại của vi khuẩn trên mẫu. Vì vậy thời gian lây nhiễm 15 - 20 phút là thích hợp vì cho
mẫu cấy xanh và đẹp. Cịn ở 25 phút lây nhiễm do vi khuẩn phát triển nhiều, vì vậy này mà sức sống mẫu cũng giảm sút.
•Trên mơi trường đối chứng, không lây nhiễm với vi khuẩn nên không tiến hành rửa khuẩn, tuy nhiên mẫu sống còn lại với tỷ lệ 75%, có hiện tượng mơ bị ức chế, vàng và yếu dần có thể do môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh gentamycine gây độc cho mô.
Theo dõi tỷ lệ khuẩn mọc sau khi lây nhiễm trong thời gian đồng nuôi cấy và theo dõi tỷ lệ sống sau 2 lần rửa khuẩn trên chưa đánh giá đầy đủ khả năng biến nạp của vi khuẩn và hiệu quả của cơng việc chuyển gen. Vì vậy sau khoảng gần 4 tuần ni cấy mô, theo dõi thấy chồi bắt đầu nhú lên từ hai đầu mẫu cấy và tại những vị trí bị thương trên mẫu. Kết quả tỷ lệ phát sinh chồi và tỷ lệ chuyển gen sau khi nhuộm gen gus như sau:
Bảng 3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến sự tái sinh chồi và hiệu quả chuyển gen. CT Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu ra chồi (%) Số chồi/ mẫu (Chồi) Tỷ lệ GUS+ / số chồi nhuộm (%) Hình thái mẫu cấy và chồi tái
sinh
4 tuần 6 tuần 8 tuần 8 tuần
ĐC 0 8.3 8.3 8.3 1 0 +
CT1 15 11.1 19.4 22.2 1.5 0 + +
CT2 20 19.4 27.8 36.1 2.1 0 + + +
CT3 25 11.1 19.4 25.0 1.3 0 + +
Ghi chú: Môi trường sử dụng là MS + 3 mg/L BAP + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar, pH 5.7
+ + + : Mẫu cấy xanh, chồi tái sinh sinh trưởng tốt, mầu xanh, hình thái bình thường + + : Mẫu cấy xanh, chồi tái sinh sinh trưởng chậm, lá xanh nhạt, chồi nhỏ
+ : Mẫu cấy vàng yếu, chồi tái sinh sinh trưởng chậm, chồi chỉ nhú lên rất nhỏ Kết quả bảng trên cho thấy:
•Lây nhiễm 20 phút thì cho số mẫu ra chồi nhiều hơn (19%) sau 4 tuần nuôi cấy, sau 6 tuần số mẫu ra chồi tiếp tục tăng chiếm tỷ lệ 27.8%, chồi phát triển nhanh đạt chồi cao, mập sau 2 tháng nuôi cấy và tỷ lệ mẫu tạo chồi lúc này là 36.1%.
•Trong khi đó lây nhiễm thời gian 15 phút và 25 phút tỷ lệ tái sinh chồi thấp hơn. Tốc độ mẫu phát sinh chồi chậm. Tỷ lệ mẫu ra chồi sau 2 tháng nuôi cấy ở thời gian lây nhiễm 15 phút là 22.2%, ở 25 phút là 25 %. Số chồi trên mẫu chỉ đạt trung bình 1.3 chồi với cơng thức 1, và 1.5 chồi ở cơng thức 3.
• Đối với cơng thức đối chứng khơng những mẫu ra chồi ít (8.3%), chồi nhỏ, mẫu vàng nhạt và yếu mà số chồi trên mẫu cũng ít. Đây là kết quả của mơi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh Gentamycine có tác dụng ức chế mơ khơng được biến nạp. Số chồi trên mẫu trung bình ở cơng thức 2 đạt 2.08 (chồi) chứng tỏ khi lây nhiễm mẫu 20 phút sức sống của mẫu có thể tốt hơn lây nhiễm ở thời gian ngắn và lâu hơn.
Kết quả kiểm tra gen gus khơng thấy biểu hiện của gen này. Có thể xảy ra hai khả năng là: một là không chuyển được gen vào mô do tỷ lệ chuyển gen rất thấp mà số chồi tạo được mang kiểm tra lại ít, hai là khả năng gen đã chuyển được vào nhưng không hoạt động hay số bản copy chuyển vào q ít khơng đủ tạo ra enzyme glucuronidase phản ứng với hố chất X-gluc dẫn đến khơng biểu hiện màu. Vì vậy chưa thể kết luận được là đã chuyển được hay chưa.
c d
Chú thích:
• Thời gian lây nhiễm 15 phút • Thời gian lây nhiễm 20 phút • Thời gian lây nhiễm 25 phút • Khơng lây nhiễm với vi khuẩn