Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn
khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Thao tác lây nhiễm là bước đầu tạo điều kiện tiếp xúc giữa vi khuẩn và tế bào thực vật. Sau đó mẫu được thấm khơ và đặt vào môi trường đồng nuôi cấy trong điều kiện tối, nhiệt độ 24-260C tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển tốt. Giai đoạn này là quá trình biến đổi trong tế bào vi khuẩn. Sự hoạt động của vùng gen
vir dưới tín hiệu của tế bào thực vật bị thương, cắt và vận chuyển đoạn T-DNA ra
khỏi tế bào vi khuẩn. Vì vậy cần có thời gian để vi khuẩn biến đổi và thực hiện chức năng biến nạp của mình. Nhưng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là loại gây bệnh cho cây nên thời gian đồng ni cấy cả vi khuẩn với mẫu dài thì có khả năng làm tổn thương đến mẫu cấy, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sau này của mẫu. Ngược lại thời gian đồng ni cấy ngắn, số vector ít, số đoạn T-DNA được cắt ra và chuyển vào cây ít dẫn đến hiệu quả chuyển gen thấp.
Qua theo dõi tỷ lệ mọc khuẩn sau các ngày đồng nuôi cấy đã thu được các số liệu bảng sau:
Bảng 4. Tỷ lệ mọc khuẩn trong thời gian đồng nuôi cấy
CT
Thời gian (ngày)
Tỷ lệ mẫu mọc khuẩn sau lây nhiễm (%)
Hình thái vịng khuẩn 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày
ĐC 0 0 0 0 Sạch khuẩn
CT1 2 8 86 --- --- Lớp khuẩn mỏng, nhỏ
CT3 4 17 83 100 100 Khuẩn dày, lan rộng Kết quả bảng trên cho thấy:
•Sau một ngày đồng ni cấy đã thấy vi khuẩn phát triển nhưng tỷ lệ mọc khuẩn rất ít (17%). Sang ngày thứ 2 đồng ni cấy thì khuẩn vẫn mọc chưa hết ở tất cả các mẫu: chiếm tỷ lệ 86% với công thức 1; 89% ở công thức 2 và 83% ở công thức 3. Hầu như sang ngày thứ 3 khuẩn đã mọc hết số mẫu còn lại.
•Sau 2 ngày đồng ni cấy thì trên bề mặt mẫu cấy xuất hiện lớp vi khuẩn mỏng, nhỏ. Sau 3 ngày lớp vi khuẩn ở cơng thức 2 dày lên. Sau 4 ngày thì vi khuẩn lan rộng và dày lên rất nhiều.
•Vậy thời gian đồng ni cấy càng dài thì vi khuẩn càng mọc nhiều hơn, bám chắc và ăn sâu mào mẫu hơn.
Sau 2 ngày Sau 2 ngày
Sau 4 ngày Sau 3 ngày
Hình 8. Vi khuẩn mọc trong thời gian đồng nuôi cấy
Để biết được khả năng sống của mẫu dưới tác động của thời gian đồng ni cấy khác nhau có khác nhau khơng. Chúng tôi theo dõi tỷ lệ mẫu sống sau hai lần rửa khuẩn. Sau khi rửa khuẩn khoảng 2 tuần theo dõi và thu được kết quả sau:
Bảng 5. Tỷ lệ mẫu sống sau hai lần rửa khuẩn
CT
Thời gian đồng nuôi cấy (ngày)
Tỷ lệ mẫu sống sau 2 lần rửa
khuẩn (%) Ghi chú
Lần 1 Lần 2
ĐC 83.3 72.3 Mẫu yếu, hóa nâu
CT1 2 94.7 80.3 Mẫu xanh, sạch khuẩn
CT2 3 86.0 69.7 Mẫu xanh, sạch khuẩn
CT3 4 83.3 67.7 Mẫu yếu, vẫn cịn khuẩn.
Mơi trường đồng nuôi cấy: MS + 1mg/L BAP + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar, Ph = 5.7 Môi trường tái sinh: MS + 3 mg/L BAP 30 g/L sucrose + 8 g/L agar, pH = 5.7
Kết quả bảng trên cho thấy:
• Đồng ni cấy thời gian lâu làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu. Khi đồng nuôi cấy thời gian dài (4 ngày) tỷ lệ mẫu chết lớn, tỷ lệ mẫu sống còn 67.7 %, mẫu sống vẫn còn nhiễm khuẩn và hơi vàng yếu. Khi đồng ni cấy thời gian 2, 3 ngày thì sau 2 lần rửa khuẩn mẫu tươi xanh và sạch khuẩn.
• Thao tác rửa khuẩn cũng ảnh hưởng đến sức sống mẫu cấy. Số mẫu sống giảm đi sau lần rửa khuẩn thứ 2 so với lần 1 ngoài nguyên nhân do mẫu nhiễm khuẩn quá lâu còn do nguyên nhân nữa là do tác động của thao tác rửa khuẩn làm sức sống mẫu giảm.
Như vậy, đồng nuôi cấy ở thời gian 2 hoặc 3 ngày là phù hợp cho sự sống của mẫu. Vì thời gian sống chung với vi khuẩn lâu thì mẫu sẽ bị vi kuẩn xâm nhập sâu vào bên trong, gây hại cho mơ dẫn đến mơ yếu hơn và có thể chết.
Để nghiên cứu hiệu quả biến nạp của vi khuẩn khi đồng nuôi cấy ở các khoảng thời gian khác nhau có khác nhau hay khơng, hay nói đúng hơn là hiệu quả
biến nạp của vi khuẩn và tái sinh của mẫu sẽ bị ảnh hưởng như thế nào trong thời gian đồng nuôi cấy. Chúng tôi đã theo dõi chỉ tiêu tỷ lệ mẫu ra chồi và tỷ lệ chồi cho GUS+ và thu được bảng số liệu sau:
Bảng 6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả tái sinh chồi và hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn
CT Thời gian (ngày) Tỷ lệ mẫu ra chồi (%) Số chồi/ Mẫu (chồi) GUS+/số chồi nhuộm (%) Ghi chú
4 tuần 6 tuần 8 tuần 8 tuần
ĐC 5.5 8.3 8.3 1 0 +
CT1 2 11.1 25.0 33.3 1.6 0 + + +
CT2 3 16.6 22.2 25.0 1.3 0 + +
CT3 4 8.3 13.8 16.6 1.5 0 + +
Chú thích:
+ + + : Mẫu cấy xanh, chồi tái sinh xanh, sinh trưởng tốt
+ + : Mẫu cấy xanh, chồi tái sinh sinh trưởng chậm, lá xanh nhạt, chồi bé + : Mẫu cấy vàng yếu, chồi tái sinh sinh trưởng chậm, chồi nhỏ Kết quả bảng trên cho thấy:
• Thời gian đồng nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mẫu cấy. Sau 4 tuần nuôi cấy mô, chồi bắt đầu mọc lên tuy nhiên phát triển rất chậm. Đến tuần thứ 6 tỷ lệ mẫu ra chồi khi đồng nuôi cấy trong 2 ngày xuất hiện nhiều hơn hẳn các công thức khác, đạt 25 %. Cuối tuần thứ 8 đạt mức cao nhất là 33.3%.
• Ở cơng thức đối chứng (khơng lây nhiễm), tỷ lệ mẫu ra chồi ít, mẫu yếu, chồi bé và phát triển kém hiệu quả ra chồi chỉ đạt 16.6 %. Các công thức 2 và 3 khi đồng nuôi cấy trong 3 và 4 ngày đều cho hiệu quả ra chồi thập hơn công thức 1 rất nhiều, chiếm tỷ lệ 25% và 15%.
• Đồng ni cấy thời gian 2 ngày cho chồi phát triển tốt, chồi xanh, trung bình 1.6 chồi trên mẫu. Trong khi đó mẫu cấy đồng ni cấy trong thời gian dài 3 hoặc 4 ngày thì cho chất lượng chồi thấp hơn: chồi phát triển chậm, bé, lá xanh nhạt, số chồi trung bình trên mẫu ở thồi gian đồng ni cấy 3 ngày là 1.3 chồi, ở thời gian đồng nuôi cấy 4 ngày là 1.5 chồi.
• Cơng thức đối chứng tỷ lệ ra chồi rất it, chồi nhỏ, mẫu cấy vàng yếu. Kết quả kiển tra khi nhuộm chồi với X-gluc cho thấy khơng có sự biểu hiện của gen chỉ thị gus. Có thể số chồi tái sinh tạo ra quá ít, tỷ lệ chuyển gen lại quá nhỏ nên chưa đánh giá được hiệu quả chuyển gen ở các thời gian đồng ni cấy khác nhau có khác nhau hay khơng.
Dựa vào các kết quả trên có thể kết luận rằng: đồng ni cấy thời gian 2 ngày là thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn tạo điều kiện cho mẫu cấy khỏe và phát sinh chồi tốt.