Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3. Ảnh hưởng của Acetosyringone (AS) đến sự biến nạp của vi khuẩn
Sự tiếp xúc với các hợp chất giải phóng của mơ thực vật tổn thương đã làm cho các vùng vir của Ti-plasmid phiên mã. Trong quá trình này, một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là Acetosyringone (AS). Khi vi khuẩn Agrobacterium gặp dịch tiết phản ứng của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc Acetosyringone tinh khiết, sản phẩm của gen vir A (có thể liên kết được với màng) sẽ nhận diện và tương tác với Acetosyringone truyền tín hiệu ngoại bào vào nội bào làm hoạt hóa các vùng gen vir khác. Acetosyringone có tác dụng là vậy nhưng trên các đối tượng thực vật khác nhau thì sử dụng với nồng độ khác nhau. Vì vậy chúng tơi tiến hành thí nghiệm này thu được kết quả ở bảng và đồ thị sau với chỉ tiêu theo dõi là hiệu quả tạo chồi và hiệu quả biến nạp.
Bảng 7. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến tái sinh chồi và hiệu quả chuyển gen.
CTTD
Mẫu sống (%)
Tỷ lệ mẫu ra chồi (%) Số chồi/ mẫu
(chồi) (%) chồi GUS
+ Ghi chú
CT AS
(μM/L) 4 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần 8 tuần
ĐC 72.3 5.6 11.1 8.3 1 0 +
1 0 80.3 11.1 25.0 30.6 1.4 0 +++
2 50 72.3 13.9 16.7 25.0 1.3 0 ++
3 100 69.7 11.1 22.2 25.0 1.3 0 ++
Môi trường đồng nuôi cấy: MS + 1mg/L BAP + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar, pH5.7 Chú thích: ĐC : Không lây nhiễm
+ : Chồi yếu, nhỏ + + : Chồi to, thấp
+ + + : Chồi to, cao hơn, mẫu cấy xanh
Qua đồ thị và bảng trên cho thấy:
• Tỷ lệ mẫu sống sau 4 tuần ni cấy ở công thức không bổ sung AS cao nhất chiếm 80.3%. Ở các nồng độ AS là 50 μM/L và 100 μM/L cho tỷ lệ mẫu sống thấp hơn chiếm 72.3 % và 69.7 %. Công thức đối chứng không lây nhiễm dưới tác động của kháng sinh gentamycin và mẫu bị yếu và chết, tỷ lệ sống cịn lại là 72.3%.
• Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi sau 8 tuần nuôi cấy ở nồng độ AS là 50 và 100 μM/L đều cho tỷ lệ mẫu ra chồi thấp hơn nhiều so với công thức 1 không bổ sung AS với kết quả thu được là 30.6 %.
• Hình thái chồi của mẫu cấy đồng nuôi cấy không bổ sung AS cho chồi cao, to, mẫu cấy xanh, trung bình 1.4 chồi trên mẫu. Khi có xuất hiện AS ở 2 nồng độ trên cho tỷ lệ chồi tái sinh thấp hơn (25 %), trung bình số chồi trên mẫu là 1.3 chồi, chồi thấp hơn.
• Kết quả kiểm tra gen gus không cho thấy dấu hiệu sự chuyển gen của vi khuẩn. Tuy nhiên điều này cũng chưa kết luận được đã chuyển được gen hay chưa. Vì có rất nhiều ngun nhân dẫn tới kết quả có thể gen đã chuyển được nhưng khơng biểu hiện. Có thể là do khơng có sự tương đồng genome giữa tế bào ký chủ và đoạn DNA ngoại lai nên DNA ngoại không xen vào được. Hoặc đoạn DNA ngoại bị phá hủy bởi enzyme trong tế bào cây ở giai đoạn sợi đơn. Cũng có thể khi DNA mục tiêu đã xen vào nhưng gen gus bị đột biến không hoạt động hoặc
với lượng bản sao DNA ngoại nhỏ tạo ít enzyme glucuronidase dẫn đến xảy ra phản ứng sinh màu của hóa chất X-gluc nhưng khơng tạo màu xanh đăc trưng ...
Kết luận: Với đối tượng là quýt Đường canh thì khơng cần phải bổ sung
Acetosyringone vào môi trường đồng nuôi cấy, tức là hợp chất hấp dẫn vi khuẩn sinh ra từ mô bị thương đã vừa đủ và không cần phải bổ sung hợp chất ngoại sinh nữa. Sự giải phóng hợp chất phenolic bởi thực vật đã đủ cho sự hấp dẫn vi khuẩn,
vì vây nếu bổ sung thêm AS kết hợp với hợp chất phenolic nội sinh có thể làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn, ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi của mẫu cấy.