Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.5. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh đến khả năng tái sinh và hiệu
sinh và hiệu quả chuyển gen
Tế bào thực vật có tính tồn năng, có khả năng phản phân hóa. Do đó từ một tế bào chuyên biệt, khi gặp điều kiện thuận lợi có khả năng tái tạo thành cây hồn chỉnh. Những tế bào càng chun hóa thì khả năng phản phân hóa càng khó khăn. Qua nhiều bài báo cáo từ các tác giả khác nhau, chúng tôi đã thống nhất vật liệu dùng cho chuyển gen cho quýt Đường canh là đoạn epocotyl. Tuy nhiên để ni cấy mơ thành cơng thì vai trị của các hormon thực vật vô cùng quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lý của chúng.
Xytokinin có tác dụng kích thích mạnh mẽ sự phân chia tế bào, phân hóa chồi. Auxin có tác dụng sinh lý rất nhiều lên q trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tượng tầng. Tuy nhiên với bất kì hiện tượng sinh trưởng phát triển nào cũng đều được điều chỉnh bởi sự cân bằng của hai hay nhiều hooc môn quyết định. Trong nuôi cấy mô thực vật, tác dụng tương hỗ giữa cytokinin với auxin đóng một vai trị đặc biệt trong việc hình thành và phân hóa cơ quan của mơ ni cấy. Tỷ lệ nồng độ auxin / cytokinin cao trong mơi trường ni cấy thì cảm ứng sinh rễ, sinh củ mạnh. Ngược lại khi tỷ lệ này thấp thì cảm ứng sinh chồi tăng lên. Nhưng đối với nuôi cấy mô trên đối tượng cam quýt là cây thân gỗ, cây hai lá mầm và các đặc tính sinh lý khác nữa nên khó ra rễ từ chồi nuôi cấy mô. Tỷ lệ và thành phần hormon qua các nghiên cứu trên các đối tượng cam quýt khác nhau thì khác nhau. Vì vậy chúng tơi đưa ra các công thức khác nhau về thành phần cũng như liều lương hooc mơn để tìm ra một mơi trường thích hợp cho ni cấy mơ sau khi đã thực hiện những thao tác chuyển gen trên quýt Đường canh.
Bảng 9. Ảnh hưởng của BAP và IAA đến khả năng tái sinh chồi ở quýt Đường canh
CT BAP (mg/l) IAA (mg/l) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ mẫu ra chồi (%) Số chồi/
mẫu (chồi) Ghi chú Thời gian theo dõi 4 tuần 4 tuần 6 tuần 8 tuần 8 tuần 8 tuần
ĐC 0 0 86.1 8.3 11.1 11.1 1 - 1 1 0 83.3 11.1 16.6 19.5 1.5 + 2 2 0 86.1 8.3 16.6 19.5 1.5 + 3 3 0 83.3 22.2 30.6 30.6 1.6 + + + 4 1 0.2 80.6 11.1 22.2 27.7 1.3 + + 5 2 0.2 89.0 16.6 30.6 38.9 2.1 + + + 6 3 0.2 80.6 8.3 16.6 25.0 1.6 + +
Môi trường sử dụng : MS + 8 g/L agar + 30g/L sucrose, pH 5.7 Chú thích :
- : Chồi nhỏ, yếu, mẫu cấy chuyển màu vàng nhạt + : Chồi nhỏ, yếu, mẫu cấy xanh nhạt.
+ + : Chồi sinh trưởng chậm, nhỏ, mẫu cấy xanh
+ + + : Chồi xanh, sinh trưởng tốt, hình thái bình thường, mẫu cấy xanh. Kết quả bảng trên cho thấy :
•Nếu mơi trường có ổ sung hormon sinh trưởng thì đều cho tỷ lệ sống trên 80%, mẫu cấy xanh. Cịn cơng thức đối chứng khơng bổ sung hormon sinh trưởng tỷ lệ mẫu sống 86.1%, chồi nhỏ yếu, mẫu cấy vàng nhạt. Nồng độ 2mg/L BAP và 0.2 mg/L IAA cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất (89%).
•Trong mơi trường nuôi cấy không bổ sung 0.2 mg/L IAA, sử dụng nồng độ BAP khác nhau cho tỷ lệ tái sinh chồi khác nhau. Khi không bổ sung hoặc với
lượng nhỏ BAP từ 1 – 2 mg/L thì tỷ lệ mẫu ra chồi thấp (11.1 - 19.5%). Với nồng độ BAP 3 mg/L cho kết quả chồi tái sinh cao chiếm 30.6%, chồi xanh, sinh trưởng tốt, hình thái bình thường. Như vậy BAP có tác dụng kích thích phân hóa chồi ở nồng thích hợp nhất là 3mg/L.
•Khi kết hợp BAP các nồng độ khác nhau với nồng độ nhỏ 0.2 mg/L IAA, kết quả cho thấy sự tái sinh chồi khác nhau. Nồng độ BAP thấp (1mg/L) hoặc cao (3mg/L) đều cho khả năng tái sinh chồi kém (27.7 và 25.0 %) còn kết hợp với 2 mg/L BAP cho hiệu quả tái sinh chồi cao hơn rất nhiều 38.9%.
•Kết hợp hai nồng độ BAP 2mg/L và IAA 0.2 mg/L không những cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao mà số chồi trung bình trên mẫu (2.1 chồi) lớn hơn các nồng độ nghiên cứu khác, cho chồi xanh, sinh trưởng bình thường. Mẫu trong cơng thức đối chứng không bổ sung hormon và các công thức 1 mg/L BAP; 2 mg/L BAP; 3 mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA không những đều cho tỷ lệ chồi thấp hơn mà số chồi trung bình trên mẫu thấp (1 – 1.5 chồi), chồi nhỏ và yếu.
Như vậy kết hợp 2mg/L BAP và 0.2 mg/L IAA trên nền môi trường MS cho hiệu quả tái sinh chồi cao. Khi kết hợp BAP nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn với 0.2 mg/L IAA thì ức chế sự hình thành và phát triển của chồi. Vì vậy trong mơi trường tái sinh chọn lọc trên nền môi trường MS bổ sung 2mg/L BAP và 0.2 mg/L IAA là tốt nhất ở quýt Đường Canh.
3 mg/L BAP 2 mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA
1 mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA 1 mg/L BAP
3 mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA 2 mg/L BAP
Qua kết quả nghiên cứu của các thí nghiệm trên, chúng tơi đưa ra quy trình chuyển gen mẫn cảm auxin nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo quả không hạt ở quýt Đuờng canh như sau :