Chuyển gen mẫn cảm auxin ino rolb và sinh auxin ino iaam hoạt động đặc thù bầu nhuỵ vào giống quýt đường canh (citrus reticulata) và cam vinh (citrus sinensis) thông qua agrobacterrium tumefaciens

B GIO DC V O TO TRNG I HC NễNG NGHIP H NI ==== ==== TNG VN HI CHUYN GEN MN CM AUXIN INO-ROLB V SINH AUXIN INO-IAAM HOT NG C TH BU NHY VO GING QUíT NG CANH (CITRUS RETICULATA) V CAM VINH (CITRUS SINENSIS) THễNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUN VN THC S NễNG NGHIP Chuyên ngành : Cụng ngh sinh hc Mã số : 60.42.80 Ngời hớng dẫn khoa học: PGS.TS PHAN HU TễN H NI 2012 LI CAM OAN Tụi xin cam ủoan rng s liu v kt qu nghiờn cu lun ny l trung thc v cha h ủc s dng ủ bo v mt hc v no Tụi xin cam ủoan rng mi s giỳp ủ cho vic hon thnh lun ny ủó ủc cm n v cỏc thụng tin trớch dn lun ủó ủc ch rừ ngun gc H Ni, ngy thỏng nm 2012 Tỏc gi Tng Vn Hi Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip i LI CM N hon thnh lun cao hc ny, tụi ủó nhn ủc s quan tõm, giỳp ủ v to mi ủiu kin thun li ca Cỏc c quan, quý Thy Cụ, Gia ủỡnh, bn bố, ủng nghip sut quỏ trỡnh hc v nghiờn cu: Lun ủc thc hin khuụn kh ca ủ ti ủc lp cp Nh nc Trc ht ủc by t lũng cm n chõn thnh ti B Khoa hc v Cụng ngh, ch nghim ủ ti ủó cho phộp tụi thc hin nghiờn cu ny Vi lũng kớnh trng v bit n sõu sc tụi gi ti PGS.TS Phan Hu Tụn- Trng B mụn Sinh hc phõn t v Cụng ngh Sinh hc ng dng, Trng hc Nụng Nghip H Ni ủó tn tỡnh hng dn, ch bo, giỳp ủ v ủng viờn tụi quỏ trỡnh thc hin lun Tụi xin by t lũng bit n chõn thnh, sõu sc ủn cỏc thnh viờn b mụn B mụn Sinh hc phõn t v Cụng ngh Sinh hc ng dng, Trng i hc Nụng Nghip H Ni ủó to ủiu kin, nhit tỡnh giỳp ủ, truyn ủt nhng kinh nghim quý bỏu cho tụi sut quỏ trỡnh thc hin ủ ti Cui cựng tụi xin gi li cm n chõn thnh ủn gia ủỡnh, bn bố nhng ngi ủó luụn ủng viờn, khớch l tụi sut quỏ trỡnh hc v hon thin lun H Ni, ngy thỏng nm 2012 Tỏc gi Tng Vn Hi Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip ii MC LC LI CAM OAN i LI CM N ii MC LC iii DANH MC CC CH VIT TT vi DANH MC CC BNG vii DANH MC CC HèNH viii DANH CC BIU x M U 1.1 t ủ 1.2 Mc ủớch v yờu cu TNG QUAN TI LIU 2.1 Khỏi quỏt v cõy n qu cú mỳi 2.1.1 Ngun gc 2.1.2 Phõn loi 2.1.3 Giỏ tr ca cõy n qu cú mỳi 2.2 Tỡnh hỡnh sn xut v tiờu th qu cú mỳi nc v trờn th gii 2.2.1 Tỡnh hỡnh sn xut v tiờu th qu cú mỳi trờn th gii 2.2.2 Tỡnh hỡnh sn xut v tiờu th qu cú mỳi nc 2.3 C ch di truyn hỡnh thnh tớnh khụng ht cõy cam quýt 2.3.1 Bt dc ủc v bt dc cỏi 2.3.2 T bt tng hp 2.3.3 Hin tng trinh sn 2.4 Cỏc hng nghiờn cu to ging cõy n qu cú mỳi khụng ht trờn th gii 2.5 Vai trũ ca auxin v cỏc hormon khỏc ủn s phỏt trin ca qu 2.6 To qu vụ phi v vai trũ ca auxin 12 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip iii 2.7 Nghiờn cu to ging vụ phi bng chuyn gen sinh v mn cm vi auxin 14 2.8 Nhng nghiờn cu nc v to ging cõy n qu cú mỳi khụng ht 16 2.9 K thut chuyn gen v ng dng ca nú chn ging thc vt 17 2.9.1 Tim nng ca k thut chuyn gen to ging thc vt 17 2.9.2 Cỏc phng phỏp chuyn gen thc vt 17 2.9.3 Chuyn gen thc vt nh Agrobacterium 19 2.10 Cỏc phng phỏp sng lc v ủỏnh giỏ cõy chuyn gen 26 2.10.1 Sng lc cõy chuyn gen bng húa cht chn lc 26 2.10.2 Phõn tớch cõy chuyn gen cú cha gen GUS bng nhum mụ t bo 27 2.10.3 Phõn tớch cõy chuyn gen bng k thut sinh hc phõn t 29 2.11 Cỏc nghiờn cu nc v trờn th gii v nh hng ca cỏc yu t ủn hiu qu bin np gen vo cõy cam quýt nh Agrobacterium 30 2.11.1 Mu cy 30 2.11.2 Dch huyn phự vi khun v thi gian lõy nhim 31 2.11.3 Mụi trng pha loóng vi khun v mụi trng cm ng mu 31 2.11.4 Cỏc yu t giai ủon ủng nuụi cy 32 2.12 Nhng nghiờn cu v mụi trng tỏi sinh chi, chn lc chi chuyn gen, kộo di chi v tỏi sinh r 34 VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 35 3.1 Vt liu nghiờn cu 35 3.1.1 Vt liu chuyn gen 35 3.1.2 Vector 35 3.1.3 Húa cht v thit b 36 3.2 Ni dung nghiờn cu 36 3.3 Phng phỏp nghiờn cu 37 3.3.1 To vt liu chuyn gen 37 3.3.2 Phng phỏp to dch huyn phự vi khun cha vector mang gen 38 3.3.3 Phng phỏp cm ng mu, lõy nhim khun v ủng nuụi cy 39 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip iv 3.3.3 Phng phỏp khun v tỏi sinh chi 40 3.3.4 Phng phỏp chn lc cõy chuyn gen 40 3.4 Bc ủu th nghim chuyn gen INO-iaaM vINO-rolB vo tr trờn lỏ mm ging cam Vinh v quýt ng Canh nh Agrobacterium tumefaciens 41 3.5 Phng phỏp kim tra cõy chuyn gen bng cht X-Gluc 43 3.6 B trớ thớ nghim v cỏc ch s theo dừi 43 3.7 X lý s liu 44 3.8 a ủim v thi gian nghiờn cu 44 KT QU V THO LUN 45 4.1 Ti u húa quy trỡnh chuyn gen sinh auxin (INO-iaaM) v mn cm auxin (INO-rolB) vo tr trờn lỏ mm cõy quýt ng Canh v cam Vinh thụng qua Agrobacterium tumefaciens 45 4.1.1 nh hng ca nhit ủ ủng nuụi cy ủn hiu qu bin np gen 45 4.1.2 nh hng ca vic b sung acetosyringone vo mụi trng ủng nuụi cy ủn hiu qu bin np gen 51 4.1.3 nh hng ca thi gian ủng nuụi cy ủn hiu qu chuyn gen 55 4.1.4 nh hng ca auxin vo mụi trng ủng nuụi cy ủn hiu qu chuyn gen 60 4.2 Bc ủu th nghim chuyn gen sinh v mn cm auxin hot ủng ủc thự bu nhy vo quýt ng Canh v cõy cam Vinh thụng qua Agrobacterium tumerfacies 64 4.3 Thớ nghim vi ghộp chi chuyn gen lờn gc bi 70 KT LUN V KIN NGH 71 5.1 Kt lun 71 5.2 Kin ngh 71 TI LIU THAM KHO 73 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip v DANH MC CC CH VIT TT AS Acetosyrigone BAP 6-benzyl adenine purin bp Base pair CaMV35S-P Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor Cef cefotaxime 2,4-D Dichlorophenoxy acetic acid GA3 Gibberellic axid GUS - Glucuronidase gene IBA Indole-3-butyric acid Km Kanamycine Gm gentamycine LB Luria and Bertani MS Murashige & Skoog (1962) MT Murashige and Tucker (1969) NAA -Naphthalene acetic acid nptII Neomycine phosphotransferase (gen khỏng kanamcine) IBA Indole-3-butiric acid T-ADN Transfer ADN Ti-plasmid Tumor inducing plasmid Vir Virulence region X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip vi DANH MC CC BNG Bng 4.1a nh hng ca nhit ủ ủng nuụi cy ủn s phỏt trin ca khun lc, kh nng tỏi sinh chi v kh nng sng sút ca mu quýt ng canh trờn mụi trng chn lc gen 46 Bng 4.1b nh hng ca nhit ủ ủng nuụi cy ủn s phỏt trin ca khun lc, kh nng tỏi sinh chi v kh nng sng sút ca mu cam Vinh trờn mụi trng chn lc gen 47 Bng 4.2a nh hng AS ủn s phỏt trin ca khun lc, kh nng tỏi sinh chi v kh nng sng sút ca mu quýt ng Canh 52 Bng 4.2b nh hng AS ủn s phỏt trin ca khun lc, kh nng tỏi sinh chi v kh nng sng sút ca mu cam Vinh 53 Bng 4.3a nh hng thi gian ủng nuụi cy ủn s phỏt trin ca khun lc, kh nng tỏi sinh chi v kh nng sng sút trờn mụi trng chn lc ca quýt ng Canh 56 Bng 4.3b nh hng thi gian ủng nuụi cy ủn s phỏt trin ca khun lc, kh nng tỏi sinh chi v kh nng sng sút trờn mụi trng chn lc ca cam Vinh 56 Bng 4.4a nh hng ca auxin ủn phỏt trin ca khun lc, kh nng tỏi sinh chi v sng sút trờn mụi trng chn lc ca quýt ng Canh 61 Bng 4.4b nh hng ca auxin mụi trng ủng nuụi cy ủn s phỏt trin ca khun lc, kh nng tỏi sinh chi v sng sút trờn mụi trng chn lc ca cam Vinh 61 Bng 4.5a Kt qu ủỏnh giỏ kh nng tỏi sinh chi, kh nng sng sút ca cỏc mu trờn mụi trng chn lc v t l mu chi cú biu hin gen GUS chuyn gen iaaM-INO v rolB-INO vo quýt ng Canh 66 Bng 4.5b Kt qu ủỏnh giỏ kh nng tỏi sinh chi, kh nng sng sút ca cỏc mu trờn mụi trng chn lc v t l mu chi cú biu hin gen GUS chuyn gen iaaM-INO v rolB-INO vo cam Vinh 66 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip vii DANH MC CC HèNH Hỡnh 2.1 S ủ sinh v mu cm auxin/GA bu nhy(Rotino et al, 1997).16 Hỡnh 2.2 Cu to Ti- plasmid 21 Hỡnh 2.3 A- Cu to ủon T-DNA B- Hai trỡnh t biờn RB v LB 22 Hỡnh 2.4 S ủ th hin vai trũ ca cỏc gen vir 23 Hỡnh 2.5 A- Quỏ trỡnh to phc T-complex 24 Hỡnh 2.7 C ch to phn ng mu xanh lam ủc trng ca gen GUS 28 Hỡnh 2.8 C ch hot húa h thng gen vir ca acetosyringone 33 Hỡnh 3.1 Vector pDU04.1004 v pDU04.4522 cha gen sinh v mn cm vi auxin 35 Hỡnh 3.2 Cõy mm tun tui 37 Hỡnh 4.1 nh hng ca nhit ủ ủng nuụi cy ủn s phỏt trin ca Agrobacterium tumefaciens v mu sau ba ngy ủng nuụi cy trờn Cam Vinh 50 Hỡnh 4.2 nh hng ca nhit ủ ủng nuụi cy ủn kh nng tỏi sinh chi cõy cam Vinh 50 Hỡnh 4.3 nh hng ca vic b sung acetosyringone vo mụi trng ủng nuụi cy ủn kh nng sng sút ca mu trờn mụi trng chn lc 55 Hỡnh 4.4 nh hng ca thi gian ủng nuụi cy ủn s phỏt trin ca khun lc 59 Hỡnh 4.5 nh hng ca thi gian ủng nuụi cy ủn s tỏi sinh chi ca mu (CV) 60 Hỡnh 4.6 nh hng ca vic b sung NAA vo mụi trng ủng nuụi cy ủn kh nng tỏi sinh chi ca mu 64 Hỡnh 4.7 Mu chi sng sút trờn mụi trng chn lc chuyn gen sinh v mu cm vi auxin vo tr trờn lỏ mm ging quýt ng Canh 68 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip viii Hỡnh 4.8 Mu chi sng sút trờn mụi trng chn lc chuyn gen sinh v mu cm vi auxin vo tr trờn lỏ mm ging cam Vinh 68 Hỡnh 4.9 Mu chi b cht trờn mụi trng chn lc cha 50mg/lớt kanamycine 69 Hình 4.10 Các mức độ biểu gen GUS (GUS- GUS+), phản ánh tỉ lệ tế bào không nhận đợc gen biến nạp/ tế bào nhận đợc gen biến nạp 69 Hỡnh 4.11 nh 15 lỏ (t 15 chi) nhum mu xanh lam ủc trng ca gen GUS thu ủc bin np 300 mu 69 Hỡnh 4.12 Thớ nghim vi ghộp 70 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip ix S ủ túm tt cỏc bc tin hnh quy trỡnh chuyn gen INO-iaaM v INO-rolB vo thõn mm nh Agrobacterium tumefaciens ủỏnh giỏ hiu qu quy trỡnh chuyn gen xõy dng ủc, chỳng tụi ủó tin hnh thớ nghim chuyn gen INO-iaaM v INO-rolB cho 300 ủon epicotyls (tr trờn lỏ mm)/ mi gen/ging Sau cho lõy nhim khun vũng 20, tin hnh ủng nuụi cy trờn mụi trng MS cú b sung cht kớch thớch (100 àM AS + mg/l NAA + 1mg/l BA), ủng nuụi cy 220C, ngy Tip ủn cy chuyn sang mụi trng tỏi sinh chi v mụi trng chn lc Nhng mu chi no cũn sng sút sau thỏng trờn mụi trng chn lc s ủc kim tra gen GUS, bng cỏch mi chi ct ly mt lỏ v ủem lỏ ủú ngõm dung dch ủm cú cha cht X-Gluc Kt qu ủc th hin bng 4.5a v 4.5b Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 65 Bng 4.5a Kt qu ủỏnh giỏ kh nng tỏi sinh chi, kh nng sng sút ca cỏc mu trờn mụi trng chn lc v t l mu chi cú biu hin gen GUS chuyn gen iaaM-INO v rolB-INO vo quýt ng Canh Mu tỏi sinh chi sau Mu chi cũn sng sút T l mu chi cú biu S lng 2,5 thỏng trờn mụi sau thỏng trờn mụi hin mu xanh lam mu trng tỏi sinh chi trng chn lc ca gen GUS S lng T l S lng T l S lng T l (mu) (%) (chi) (%) (mu chi) (%) iaaM-INO 196 65,3 56 18,6 13 4,3 rolB-INO 220 73,3 61 20,3 17 5,6 (mu) Bng 4.5b Kt qu ủỏnh giỏ kh nng tỏi sinh chi, kh nng sng sút ca cỏc mu trờn mụi trng chn lc v t l mu chi cú biu hin gen GUS chuyn gen iaaM-INO v rolB-INO vo cam Vinh Mu tỏi sinh chi sau Mu chi cũn sng sút T l mu chi cú biu S lng 2,5 thỏng trờn mụi sau thỏng trờn mụi hin mu xanh lam mu trng tỏi sinh chi trng chn lc ca gen GUS S lng T l S lng T l S lng T l (mu) (%) (chi) (%) (mu chi) (%) iaaM-INO 183 61,0 52 17,3 12 4,0 rolB-INO 198 66,0 59 19,6 14 4,6 (mu) i vi chuyn gen vo quýt ng Canh, t 300 mu bin np mi gen ủó thu ủc 56 (chuyn gen INO-iaaM) v 61(chuyn gen INO-rolB) mu chi cũn sng sút sau thỏng trờn mụi trng chn lc, chim ln lt 18,6% v 20,3% Tuy nhiờn ch cú 13 mu chi (chuyn gen INO-iaaM) v 17 mu chi (chuyn gen INo-rolB) cú biu hin mu xanh lam ủc trng ca gen GUS chim ln lt 4,3% v 5,6% Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 66 i vi cam Vinh, t 300 mu bin np mi gen thu ủc 52 chi (chuyn gen INO-iaaM) v 59 mu chi (chuyn gen INO-rolB) sng sút trờn mụi trng chn lc, chim ln lt l 17,3 v 19,6% Trong s ủú ch cú 12 mu chi (chuyn gen INO-iaaM) v 14 mu chi (chuyn gen INO-rolB) cú biu hin gen GUS, chim ln lt l 4,0% v 4,6% Qua ủõy chỳng tụi khng ủnh rng quy trỡnh chuyn gen sinh auxin INO-iaaM v mn cm vi auxin INO-rolB hot ủng ủc thự bu nhy vo tr trờn lỏ mm (epycotyl) ca hai ging quýt ng Canh v cam Vinh nh Agrobacterium tumefaciens ủt t l chuyn gen thnh cụng l 4,3% (chuyn gen INO-iaaM), 5,3% (chuyn gen INO-rolB) trờn ủi tng l quýt ng Canh 4,0% (chuyn gen INO-iaaM) v 4,6% (chuyn gen INO-rolB) trờn ủi tng l Cam Vinh Nhng mu chi no cú biu hin GUS+ s ủc chuyn sang mụi trng kộo di chi v tỏi sinh r hoc vi ghộp ủ to cõy chuyn gen hon chnh Kt qu ny cng tng t vi kt qu nghiờn cu ca Yu et al (2002) trờn ging Xuegan Tuy nhiờn, hiu qu chuyn gen m chỳng tụi thu ủc cũn thp hn so vi cỏc kt qu nghiờn cu trờn th gii nh: hiu qu bin np gen ca ging cam ngt Bingtan l 10% (Duan, 2006), ging cam ngt Natal l 11,6%, ging cam ngt Valencia l 13,8% v ging Rangpur lime l 19,3% (Ameilida, 2003), ging cam ngt Valencia l 23,8% (Boscariol, 2003) i chiu kt qu thu ủc bng 4.5a v 4.5b ca quy trỡnh chuyn gen ủó ủc ti u húa vi cỏc kt qu thu ủc cỏc thớ nghim ti u húa phn 4.1 cho thy, t l mu chi cũn sng sút sau thỏng trờn mụi trng chn lc cú cha 50mg/l kanamycine ca ca quy trỡnh chuyn gen ủó ủc ti u húa l cao nht (t l chi cũn sng sút trờn mụi trng chn lc ca cỏc thớ nghim 4.1.1, 4.1.2, 4.1.3 v 4.1.4 cha ủc ti u húa thp hn so vi ủiu kin ủó ủc ti u húa Do ủú, hiu qu bin np gen thu ủc Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 67 quy trỡnh ủó ủc ti u húa l cao nht Cú th gii thớch kt qu ny l cỏc cht b sung vo mụi trng ủng nuụi cy nh acetosyringone (100àM) v NAA (2mg/l) ủó cú tỏc dng tng hiu qu chuyn gen, ủng nuụi cy nhit ủ 220C v thi gian ngy l thớch hp nht cho chuyn gen Vỡ vy, cú th khng ủnh xõy dng thnh cụng quy trỡnh chuyn gen sinh v mn cm vi auxin vo tr trờn lỏ mm cõy quýt ng Canh v cam Vinh nh Agrobacterium tumefaciens Hỡnh 4.7 Mu chi sng sút trờn mụi trng chn lc chuyn gen sinh v mn cm vi auxin vo tr trờn lỏ mm ging quýt ng Canh Hỡnh 4.8 Mu chi sng sút trờn mụi trng chn lc chuyn gen sinh v mn cm vi auxin vo tr trờn lỏ mm ging cam Vinh Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 68 Hỡnh 4.9 Mu chi b cht trờn mụi trng chn lc cha 50 mg/lớt kanamycine Hình 4.10 Các mức độ biểu gen GUS (GUS- GUS+), phản ánh tỉ lệ tế bào không nhận đợc gen biến nạp/ tế bào nhận đợc gen biến nạp 10/03/2012 Hỡnh 4.11 nh 15 lỏ (t 15 chi) nhum mu xanh lam ủc trng ca gen GUS thu ủc bin np 300 mu Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 69 4.3 Thớ nghim vi ghộp chi chuyn gen lờn gc bi Kt thỳc bc s ủ phn 4.2 chỳng tụi tin hnh vi ghộp m khụng cn qua bc Nh chỳng ta ủó bit vic r ca cõy cam quýt nuụi cy invitro rt khú khc phc chỳng tụi tin hnh ghộp cỏc chi ủó bin np gen nờn gc bi Ht cõy bi di ủc trng khay, sau thỏng tui tin hnh thao tỏc vi ghộp Ct ngn cõy bi sau ủú ghộp chi bin np vo, qun vt ghộp bng giy parafim, sau tun tin hnh ủỏnh giỏ Chỳng tụi tin hnh ghộp chi mi loi nờn gc bi Kt qu ủt 100% t l sng sút Nh vy vi ghộp ủó khc phc ủc bc to r ng nghim, rỳt ngn thi gian cng nh cụng sc giai ủon ny Cht lng cõy vi ghộp bao gi cng khe hn chi tỏi sinh r (Prof.Dandekar, 2009) Hỡnh 4.12 Thớ nghim vi ghộp (Gc ghộp bi thỏng tui, Chi sau tun ghộp) Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 70 KT LUN V KIN NGH 5.1 Kt lun 1- Xõy dng ủc quy trỡnh chuyn gen sinh auxin (INO-iaaM) v mn cm vi auxin (INO-rolB) vo ging quýt ng Canh v cam Vinh thụng qua Agrobacterium tumefaciens C58 trờn c s xỏc lp cỏc ủiu kin ti u húa cỏc yu t giai ủon ủng nuụi cy: + ng nuụi cy 220C, ngy l thớch hp ủ nõng cao hiu qu bin np gen + Mụi trng ủng nuụi cy cú b sung 100àM acetosyringone v 2mg/l NAA mang li hiu qu bin np gen cao 2- Bc ủu ủó chuyn thnh cụng gen sinh (INO-iaaM) v mn cm vi auxin (INO-rolB) hot ủng ủc thự bu nhy vo tr trờn lỏ mm ca ging quýt ng Canh v cam Vinh thụng qua vi khun Agrobacterium tumefaciens C58 mang plasmid nh th pDU04.1004 v pDU04.5422 vi hiu qu l 4,3% (chuyn gen INO-iaaM), 5,3% (chuyn gen INO-rolB) trờn ủi tng l quýt ng Canh 4,0% (chuyn gen INO-iaaM) v 4,6% (chuyn gen INO-rolB) trờn ủi tng l Cam Vinh 4- Xỏc ủnh ủc phng phỏp vi ghộp phự hp vi cỏc chi chuyn gen, to cõy kho, rỳt ngn ủc thi gian to r ca chi ng nghim 5.2 Kin ngh p dng quy trỡnh ny chuyn gen vo tr trờn lỏ mm ca ging quýt ng Canh v cam Vinh thụng qua Agrobacterium tumefaciens tng hiu qu chuyn gen cn tip tc tin hnh nghiờn cu thờm cỏc yu t khỏc nh: tui mu, mt ủ vi khun, thi gian lõy nhim, nng ủ cefotaxime v kanamycine, Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 71 Do thi gian lm thớ nghim cú hn, nờn nghiờn cu ny, chỳng tụi mi dng bc ( chn lc cõy chuyn gen v kim tra gen GUS v vi ghộp) Kin ngh tip tc tin hnh kim tra gen bin np cõy chuyn gen bng phng phỏp PCR s dng cp mi ủc trng v phng phỏp Southern blotting ủ xỏc ủnh ủc s bn coppy chuyn np Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 72 TI LIU THAM KHO Ting Vit Lờ Trn Bỡnh, 2008 Phỏt trin cõy trng chuyn gen Vit Nam Nxb Vin Khoa hc v K thut Vit Nam Lờ Trn Bỡnh, H Hu Nh v Lờ Th Mui, 1997 Cụng ngh sinh hc thc vt ci tin ging cõy trng (Giỏo trỡnh cho cao hc nụng nghip), Nxb H Ni Ngụ Hng Bỡnh v cng s, 2005 Kt qu ủỏnh giỏ bỡnh tuyn cõy bi (Phỳc Trch v Thanh H) vựng duyờn hi Trung, Tp NN v PT nụng thụn Bỡnh Ca, 1996 Kh nng v trin vng phỏt trin cõy Quýt v mt s cõy n qu cú mỳi khỏc vựng Bc Quang H Giang, Lun ỏn tin s, trng HNNI H Ni Nguyn Hu ng, 2003 Cõy n qu cú mỳi nhit ủi, Nxb Ngh An Lờ Tn c, Nguyn Hu H, Nguyn Vn Uyn, 2003 To cõy Hng chuyn gen khỏng sõu thụng qua Agrobacterium tumefaciens, Hi ngh cụng ngh sinh hc ton Quc Nguyn Hu Hong , 2006 Tớnh u vit ca chuyn gen thc vt thụng qua Agrobacterium tumefaciens Chu Hong H , 2010 ti Nghiờn cu to ging cõy cam quýt khỏng bnh virus ph rng bng chuyn gen ủon thụng qua Agrobacterium tumefaciens Nguyn Nh Khanh , 2010 Giỏo trỡnh Phytohormon dành cho hc viờn cao hc Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 73 10 Ló Tun Ngha, V c Quang, Trn Duy Quý, 2004 C s lý thuyt v ng dng cụng ngh chuyn gen chn to ging cõy trng, Nxb Nụng Nghip 11 Tin Phỏt, inh Th Phũng, Chu Hong H, 2008 ỏnh giỏ nh hng ca thi gian lõy nhim khun ti hiu qu chuyn gen vo cõy bụng Agrobacterium tumefaciens, Tp Cụng ngh sinh hc 12 Tin Phỏt, Nguyn Chi Mai, ng Hũa Hiu, Lờ Vn Sn, Chu Hong H v Lờ Trn Bỡnh, 2007 Xõy dng quy trỡnh tỏi sinh chi trc tip t thõn mm cõy cam Snh phc v chuyn gen, Tp Cụng ngh sinh hc 13 Nguyn Vn Phỳ v Nguyn Bo V , 2008 Kho sỏt mt s yu t cú liờn quan ủn s ht trờn cõy cam Snh, Hi ngh khoa hc :Cõy n trỏi quan trng ca ng Bng Sụng Cu Long 14 Nguyn Quang Thch, Nguyn Th Lý Anh, 2006 Giỏo Trỡnh cụng ngh sinh hc nụng nghip, Nxb Nụng Nghip 15 Nguyn c Thnh, 2000 Nuụi cy mụ t bo thc vt- Nghiờn cu v ng dng, Nxb Nụng Nghip 16 Lờ Duy Thanh , 2003 C s di truyn chn ging thc vt, Nxb Khoa hc v K thut H Ni 17 Phan Hu Tụn, 2010 Giỏo trỡnh sinh hc phõn t, Nxb Nụng nghip 18 Tụn Tht Trỡnh, 2000 Cõy cam quýt Tỡm hiu v cỏc loi cõy n qu cú trin vng xut khu, Nxb Nụng Nghip 19 Phm Th Bớch Thy v Nguyn Bo Ton, 2008 S to phụi soma quýt ng Canh t nuụi cy phụi tõm, Tp CNSH Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 74 20 H Th Thỳy, 2005 Nghiờn cu ủc tớnh khụng ht v phng phỏp to dũng bi cõy n qu cú mỳi, Lun ỏn tin s sinh hc trng HQG H Ni 21 Trn Th Tc, V Mnh Hi v ỡnh Ca, 1996 Cỏc vựng trng cam quýt chớnh Vit Nam, Tp Nụng Nghip 22 Nng Vnh , 2005 Cụng ngh t bo thc vt ng dng, Nxb Nụng Nghip 23 Nng Vnh, 2008 Cõy n qu cú mỳi Cụng ngh sinh hc chn to ging, Nxb Nụng Nghip Ting Anh 24 Alida et al, 2008 Evolution of selection strateges alternative to nptII in genetic transformation ũ Citrus Plant Cell rep, 27: 105-115 25 Acciarri, N., F Restaino, G Vitelli, D Perrone, M Zottini, T Pandolfini, A Spena and G.L Rotino, 2002 Genetically modified parthenocarpic eggplants: improved fruit productivity under both greenhouse and open field cultivation BMC Biotechnology, 2:4 26 Almeida Weliton et al , 2003 Agrobacteriummediated transformation of Citrus sinensis and Citrus limonia epicotyl segments Scientia Agricola, 60: 23-29 27 Binh X N., Wakana A., Park S M., Nada Y And Fukudome I, 2001 Pollen tube bihaviors in self-incompatible and self-compatible citrus cultivars Journal of Faculty of Agriculture, Kyushu University, pp 443 457 28 Boscariol et al, 2003 The use of the Mannose selection system to recover transgenic sweet orange plants Plant Cell rep, 22: 122-128 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 75 29 Bond JE.and Roose ML, 1998, Agrobacterium-mediated transformation of the commercially important Citrus cultivar Washington navel orange Plant Cell Reports, 18: 229-234 30 Carmi, N., Y Salts, B Dedicova, S Shabtai and R Barg (2003) Induction of parthenocarpy in tomato via specific expression of the rolB gene in the ovary Planta 217: 726-735 31 Changhe Y, Shu H, Paul L and Gmitter, 2002 Factors affecting Agrobacterium mediated transformation and regeneration of sweet orange and citrange Plant Cell rep, 19: 889-903 32 Cervera et al, 1998 Agrobacteriummediated transformation of citrange: factors affecting transformation and regeneration Plant Cell Rep, 16: 271-278 33 Dandekar , 2009, Lectures: Agrobacterium-Mediated Plant Transformation 34 Guitierrez M, Luth D and Moore A, 1997 Factors affecting Agrobacterium mediated transformation in citrus and production of sour orange plants expressing the coat protein gene of citrus tristera virus Plant Cell rep, 16: 745-753 35 Garcias Luis A, Bordons and Guardiola, 1999 Explant orientation and polarity determine the morphogenic response of epicotyl segments of troyer citrange Annals of Botany, 84: 715-723 36 Ghorbel et al, 2000 High effeciency genetic transformation of sour orange and production of transgentic trees containing the coat protein gen of Citrus tristeza virus Tree Physiology, 20: 183-189 37 Gmitter F.G, 1995 Germplasm, Genetics and Biotechnology for mandarin cultivar development Symposium sur Mandarines : 785-790 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 76 38 Hidaka, T and Omura, M ,1993, Transformation of Citrus protoplasts by electroporation Jpn Soc Hort Sci, 2: 371-376 39 Knaeyoshi et al., 1994 A simple and efficient gene transfer system of trifoliate orange Plant Cell rep, 13: 541-545 40 Kobayashi S Ogawara T, Saito W., Nakamura Y., and Amura M.,1997 Production of triploid somatic hybrid in Citrus Soc Hort Sci, 66: 453-458 41 Li DD, Shi W, Deng XX, 2002 Agrobacterium mediated transformation of embryongenic calluses of Ponkan mandarin and the regeneration of plants containing the chimeric ribonuclease gene Plant Cell rep, 21: 153-158 42 Li DD et al., 2003 Factor influencing Agrobacterium mediated embryogenic callus transformation of Valencia sweet orange (Citrus sinensis) containg the pTA29 barnase gene Tree Physiology, 23: 209-215 43 Luth and Moore, 1999 Transgenic grapefruit plants obtained by Agrobacterium tumerfaciens - mediated transformatio Plant Cell, Tissue and Organ Cult, 57: 219-222 44 Meister, R.J., Williams, L.A., Monfared, M.M., Gallagher, T.L., Kraft, E.A., Nelson, C.G., and Gasser, C.S., 2004 Definition and interactions of a positive regulatory element of the ArabidopsisINNER NO OUTER promoter Plant Journal 37:426-438 45 Mezzetti et al., 2002 Genetic engineering of parthenocarpic fruit development in strawberry Acta Hort, 567: 101-106 46 Monselise, S.P ,1979 The use of growth regulators in citriculture Hort Sci, 11: 151-162 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 77 47 Moore et al., 1992 Agrobacterium-mediated transformation of Citrus stem segments and regeneration of transgenic plants Plant Cell Rep, 11: 238-242 48 Nitsch, J.P , 1970 Hormonal factors in growth and development Academic Press, London, 1: 427-472 49 Pena et al, 1995 High efficiency Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of Citrus Plant Sci, 104:183-194 50 Pena et al, 2003 Agrobacterium meadiated transformation of Citrus Plant Sci, 154:483-494 51 Pena et al, 2004 Early Events in Agrobacterium meadiated Genetic Annals of Botany, 94: 67-74 52 Robert J et al, 2004 Definition and interaction of apositive regulatory element of the Arabidopsis inner no outer promoter The plant Journal, 37: 426 432 53 Rotino et al., 1997 Genetic engineering of parthenocarpic plants Nature Biotechnology, 15: 398 401 54 Ross, J., and D ONeill., 2001 New interactions between classical plant hormones Trends Plant Sci 6: 2-4 55 Opabode J, 2006 Agrobacterium Mediated transformation off plants: emerging factors that influence efficiency Biotechnology and Molecular Biology Review, 1: 12-22 56 Stanton B.Gelvin (2000): Agrobacterium and plant genes involved in T-dna transfer and integration Molecular Biology Review, 12: 112222 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 78 57 Talon et al., 1992 Gibberellins and parthenocarpic ability in developing ovaries of seedless mandarins Plant physiol, 99: 157-165 58 Varoquaux et al.,2000 Less is better: new approaches for seedless fruit production TIBTECH, 18: 233-242 59 Yao J-L et al., 1996 Transformation of Citrus embryogenic cells using particle bombardment and production of transgenic bembryos Plant Sci, 113: 175-183 60 Yoa et al, 1996): Transformation of Citrus embryogenic cells using particle bombardment and production of transgenic bembryos Plant, 113 : 175-183 61 Wilson, W.C., 1983 The use of exogenous growth regulators on Citrus Boca Raton, 1: 207-232 62 Weliton Antonio Bastos, Alexandra Pavan and Adriana Pinheiro, 2003 Agrobacterium- mediated transformation off Citrus sinensis and Citrus limonia epicotyl segments Scientia Agricola, 60: 23-29 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 79 [...]... nhụy vào giống quýt ðường Canh (Citrus reticulata) và cam Vinh (Citrus sinensis) thông qua Agrobacterium tumefaciens 1.2 Mục ñích và yêu cầu * Mục ñích Chuyển thành công gen sinh auxin INO- iaaM và mẫn cảm auxin INOrolB hoạt ñộng ñặc thù bầu nhụy vào giống quýt ðường Canh và cam Vinh thông qua Agrobacterium tumefaciens C58 nhằm tạo dòng cam không hạt * Yêu cầu + Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ và. .. biến nạp gen vào trụ trên lá mầm (epicotyl) giống quýt ðường Canh và cam Vinh + Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất (acetosyringon, NAA) bổ sung vào môi trường ñồng nuôi cấy ñến hiệu quả biến nạp gen vào thân mầm (epicotyl) giống quýt ðường Canh và cam Vinh + Bước ñầu thực hiện chuyển gen sinh và mẫn cảm auxin hoạt ñộng ñặc thù bầu nhụy vào giống quýt ðường Canh và cam Vinh nhờ Agrobacterium tumefaciens. .. gen trực tiếp sinh auxin ñể tạo quả không hạt, ngày nay người ta còn sử dụng gen mẫn cảm với auxin ñể tạo ra tính vô phối ở cây Gen mẫn cảm auxin rolB ñược tách ra từ Agrobacterium rhizogennes, sau ñó gắn promotor hoạt ñộng ñặc thù bầu nhụy (INO) tạo ra gen mẫn cảm auxin hoạt ñộng ñặc thù bầu nhụy (INO- rolB) , rồi chuyển gen ñó vào cây ñể tạo ra tính vô phối ở cây chuyển gen [30] Gen INO- rolB ñóng vai... Agrobacterium tumefaciens Gen mẫn cảm auxin rolB ñược tách từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Hai gen này ñược gắn với promoter INO tách ra từ cây Arabidopsis hoạt ñộng ñặc thù bầu nhụy Khi tổ hợp gen sinh auxin INO- iaaM hoạt ñộng sẽ kích thích bầu nhụy sinh auxin và to ra, hay tổ hợp gen INO- rolB hoạt ñộng, chỉ cần một lượng auxin nhỏ sản xuất ở ñâu ñó trong cây cũng có thể kích thích ñể bầu nhụy phân chia và. .. bé và méo mó làm giảm chất lượng và năng suất [4,5,21,13] ðiều này có liên quan ñến khả năng cung cấp auxin ñể kích thích bầu nhụy phân chia tế bào phát triển thành quả Giống cam Vinh quả còn tương ñối nhiều hạt, làm giảm giá trị thương phẩm và khả năng tiêu thụ Xuất phát từ những cơ sở nêu trên, chúng tôi tiến hành ñề tài Chuyển gen mẫn cảm auxin INO- rolB và sinh auxin INO- iaaM hoạt ñộng ñặc thù bầu. .. ñóng vai trò làm tăng tính mẫn cảm của mô bầu nhụy ñối với auxin Vì thế hiệu quả của nó tương tự như ñối với gen INO- iaaM [30] Nhưng một sự khác biệt quan trọng giữa gen rolB với gen iaaM là ở chỗ trong cây chuyển gen hoạt ñộng của gen rolB mang tính tại tế bào, còn gen iaaM sau khi tạo ra IAA thì IAA sẽ di chuyển từ mô có biểu hiện của gen iaaM ñến các mô hoặc tế bào khác xung quanh dẫn ñến làm hình... tạo giống cây vô phối, sử dụng phương pháp chuyển gen sinh auxin và gen mẫn cảm auxin hoạt ñộng ñặc thù bầu nhụy Hướng nghiên cứu này ñã ñược các nhà khoa học trên thế giới áp dụng thành công trên nhiều ñối tượng như: cà, cà chua, dâu tây, dưa hấu, một số cây ăn quả có múi…[6] Nhờ phát triển công nghệ chuyển gen, hiện nay người ta ñã tách ñược nhiều gen từ các loại sinh vật khác nhau Gen sinh auxin iaaM. .. 300.000 tấn quả cam quýt từ Trung Quốc Vì vậy, việc tạo nguồn giống sạch bệnh và không hạt là một yêu cầu cấp bách trong chọn tạo giống cam quýt ở nước ta hiện nay Tại huyện Khoái Châu và Văn Giang (Hưng Yên), Gia Lâm (Hà Nội) ñã và ñang trồng hai giống cam, quýt rất nổi tiếng là cam Vinh và quýt ðường Canh Vì hai giống này có năng suất cao, ngọt, thơm, mẫu mã quả ñẹp và thường thu hoạch vào dịp giáp... tìm và tách ñược một loại promoter hoạt ñộng ñặc thù bầu nhụy từ Arabidopsis thaliana (promoter INO) ðây ñang là hướng nghiên cứu chủ yếu ñể tạo quả vô phối và không hạt Vì gen sinh auxin INO- iaaM chỉ hoạt ñộng ñặc thù ở bầu nhụy của cây chuyển gen nên tạo quả vô phối có mẫu mã quả ñẹp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 14 Không dừng ở việc sử dụng gen. .. sự thụ phấn hay thụ tinh [48] Quan ñiểm này gần ñây ñược kiểm chứng qua thí nghiệm chuyển gen sinh auxin hoạt ñộng ñặc thù bầu nhụy Sự phát triển của quả vô phối ñược quan sát thấy trên cây thuốc lá và cây cà, trong các cây này có chứa gen iaaM lấy từ vi khuẩn Pseudomonas synringae gắn vào promoter DefH9 tách từ cây hoa mõm chó Antirrhinum majus [53] Những cây chuyển gen ñã tạo ñược quả không hạt mà ... hnh ủ ti Chuyn gen mn cm auxin INO-rolB v sinh auxin INO-iaaM hot ủng ủc thự bu nhy vo ging quýt ng Canh (Citrus reticulata) v cam Vinh (Citrus sinensis) thụng qua Agrobacterium tumefaciens 1.2... 45 4.1 Ti u húa quy trỡnh chuyn gen sinh auxin (INO-iaaM) v mn cm auxin (INO-rolB) vo tr trờn lỏ mm cõy quýt ng Canh v cam Vinh thụng qua Agrobacterium tumefaciens 45 4.1.1 nh hng... vo thõn mm (epicotyl) ging quýt ng Canh v cam Vinh + Bc ủu thc hin chuyn gen sinh v mn cm auxin hot ủng ủc thự bu nhy vo ging quýt ng Canh v cam Vinh nh Agrobacterium tumefaciens Trng i hc Nụng