2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.11.4. Các yếu tố trong giai ựoạn ựồng nuôi cấy
2.11.4.1. Nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy
Nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy có ảnh hưởng ựến hiệu quả biến nạp gen vì : nó có ảnh hưởng ựến sự phát triển của vi khuẩn và khả năng sống của mẫu, ựến hoạt tắnh của hệ thống protein vir (ựặc biệt là vir A) và tắnh ổn ựịnh của ựoạn T-DNA xen vào (Sanlas, 2001). Nhiều nghiên cứu cho thấy khi tiến hành ựồng nuôi cấy trong ựiều kiện nhiệt ựộ tương ựối thấp có tác dụng kắch thắch và làm tăng tần số chuyển gen, nhiệt ựộ ựó thường dao ựộng 190C-250C là thắch hợp nhất. Tuy nhiên chúng còn biến ựổi theo từng giống cam quýt: cam ngọt Valencia là 190C [41], [42], cam ngọt Bingtang là 230C (Yan-Xin Duan, 2006), kết quả của Alemeida (2003) trên ựối tượng Citrus sinensis và Citrus limonia là 230C Ờ 270C và các nghiên cứu của Ghorbel (2000) chỉ ra nhiệt ựộ ựó là 220C-260C ựối với giống cam chua.
2.11.4.2. Nồng ựộ acetosyringone bổ sung vào môi trường nuôi cấy
Acetosyringone (C10H12O; M=196,2) là một hợp chất của phenol, ựược cây tiết ra khi chúng bị tổn thương. Chất này có tác dụng thu hút vi khuẩn
Agrobacterium và xúc tiến quá trình chuyển ựoạn và gắn T-DNA vào bộ gen
của cây thông qua hoạt hóa hệ thống gen vir. Nên ựây là một chất bắt buộc và cần thiết cho hoạt ựộng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Có những giống cây có khả năng tự tiết ựủ lượng acetosyringone cho quá trình hoạt hóa hệ thống gen vir thì không cần bổ sung AS vào môi trường ựồng nuôi cấy (Vắ dụ ở giống Carrizo Citrange) [50]. Tuy nhiên, rất nhiều cây ựòi hỏi phải bổ sung Acetosyringone vào môi trường ựồng nuôi cấy ựể tăng hiệu quả chuyển gen. Tùy loại cây mức ựộ bổ sung nồng ựộ AS là có khác nhau: cam ngọt Pineapple [32] và bưởi Duncan là 100 ộM AS [47], cam ngọt Navel Washington và cam ngọt Hamlin cho kết quả cao nhất ở nồng ựộ AS là 200 ộM [29].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Hình 2.8. Cơ chế hoạt hóa hệ thống gen vir của acetosyringone
(Nguồn: Dandekar, 2009) 2.11.4.3. Thời gian ựồng nuôi cấy
Thời gian ựồng nuôi cấy có ảnh hưởng ựến hiệu quả biến nạp gen vì: nó có ảnh ựến sự phát triển của vi khuẩn và khả năng tái sinh của mẫu.
đa số các nghiên cứu của nhiều tác giả Pena et al (2003), Yan Xin Duan (2006) và Yan-Xin Duan (2006), trên ựối tượng ựoạn epicotyl của các giống cam quýt ựều chỉ ra rằng thời gian ựồng nuôi cấy thắch hợp là 3 ngày, trong ựiều kiện tối. Tuy nhiên, khi mẫu cấy là lá mầm thì chỉ cần 2 ngày (Khawale et al, 2006).
2.11.4.4. Nồng ựộ auxin bổ sung vào môi trường ựồng nuôi cấy
Các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả (Pena et al-2003; Cervera
et al -1998,Ầ) trên ựoạn epicotyl của cây citrus ựã chỉ ra rằng: việc bổ sung
auxin vào môi trường ựồng nuôi cấy có tác dụng tăng tần số chuyển gen. Nguyên nhân là do trong môi trường ựồng nuôi cấy giầu auxin ựã gia tăng số các tế bào mô phân sinh ựang ở pha S (pha nhân ựôi ADN). điều này là cần thiết cho quá trình gắn ựoạn T-DNA vào bộ NST của cây.
Pena và cộng sự (2003), tiến hành ựồng nuôi cấy ựoạn epicotyl của cây
cam carrizo Citrange theo ba công thức hormon khác nhau (không có
hormon, 1 mg/lBA, 2 mg/l IAA+1mg/l 2-isopentenyl-adenine + 2 mg/l 2,4D), cho thấy hiệu quả chuyển gen cao nhất ở công thức giầu auxin.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 Các nghiên cứu trên nhiều ựối tượng khác cũng thấy rằng, các tế bào kắ chủ ở pha S là cần thiết ựối với sự chuyển ựoạn T-DNA: tế bào lá mầm của cây thuốc lá petunia (Villemon et al, 1997), trên ựoạn hypocotyl của cây hoa Hướng Dương (Suttle, 1991), ựoạn epicotyl của cây đậu (Jacobsen,1995), trên các bộ phận của Citrus (Dias et al, 2000), cây cải Arabidopsis (Changhe Y et al, 2002).