2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.11. Các nghiên cứu ở trong nước và trên thế giới về ảnh hưởng của các yếu
yếu tố ựến hiệu quả biến nạp gen vào cây cam quýt nhờ Agrobacterium 2.11.1. Mẫu cấy
Tuổi của cây mầm có ảnh hưởng tới khả năng tái sinh callus, chồi và rễ, cũng như khả năng biến nạp gen. Nếu cây mầm quá non, mô phân sinh tượng tầng chưa hình thành hoàn chỉnh thì khả năng biệt hóa thành các chồi kém, ựồng thời mẫu dễ bị tổn thương trong quá trình thao tác. Còn nếu cây mầm quá già, mô phân sinh bị hóa gỗ nhiều, làm giảm khả năng tái sinh chồi, cũng như gây khó khăn cho biến nạp gen vì thành cenlulose lúc này dày và bền chắc.
Nhiều nghiên cứu sử dụng nguồn mẫu từ các cây mầm cam quýt có bốn tuần tuổi (hai tuần tối và hai tuần chiếu sáng 16h/ ngày, 260C) cho hiệu quả chuyển gen và tái sinh chồi cao hơn các ựộ tuổi khác. Một số nghiên cứu khác lại sử dụng các mẫu cấy từ các cây mầm cam quýt chỉ hai tuần tuổi nhưng nuôi cấy hoàn toàn trong tối [49].
đa số các nghiên cứu ựều cho rằng sử dụng ựoạn trụ trên lá mầm
(epicotyl), dài 1cm làm nguồn mẫu lây nhiễm thì có khả năng tái sinh chồi và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31 Kiểu cắt mẫu cũng ảnh hưởng tới khả năng tái sinh chồi và hiệu quả biến nạp gen. Yan - Xin Duan (2006) ựã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các kiểu cắt ựến khả năng tái sinh và biến nạp. Kết quả thu ựược là kiểu cắt lệch có số chồi, chất lượng chồi và hiệu quả biến nạp là hợp lắ nhất so với các kiểu cắt khác (cắt bằng có ắt chồi, còn cắt dọc chồi nhiều nhưng yếu).
2.11.2. Dịch huyền phù vi khuẩn và thời gian lây nhiễm
Trong ựa số các nghiên cứu chỉ ra rằng dịch huyền phù thắch hợp ựể lây nhiễm các ựoạn epicotyl ở các giống cam quýt là khi chỉ số OD600 = 0.5 - 0.8. Vì lúc này tế bào vi khuẩn ựang sinh trưởng ở giai ựoạn giữa của pha cấp số (pha log), chúng ựang phân chia và sinh sản mạnh nhất [50].
Thời gian lây nhiễm hợp lý là cần thiết ựể vi khuẩn bám vào mẫu và ựạt ựược mật ựộ thắch hợp nhất cho hiệu quả chuyển gen. Thời gian này biến ựổi theo từng giống cây: ựối với ựoạn epicotyl của giống cam Carrizo thì thời gian hợp lắ nhất là 15 phút [50], giốngcam ngọt Navel Washington là 20 phút [29], giống cam ngọt Valencia là 25 phút, còn ựối với giống cam ngọt Hamlin là 30 phút [42].
2.11.3. Môi trường pha loãng vi khuẩn và môi trường cảm ứng mẫu
Môi trường pha loãng vi khuẩn vừa phải ựảm bảo sức sống cho vi khuẩn và mẫu thực vật, vừa phải tránh gây sốc cho chúng.
Theo Henzi (2004) thì việc bổ sung acetosyringone vào dung dịch pha loãng vi khuẩn có tác dụng hoạt hóa hệ thống gen vir, nên tăng hiệu quả biến nạp gen.
Theo Kayim et al (2005), nghiên cứu trên tám giống cam quýt khác nhau và nhận thấy việc xử lắ mẫu cấy với môi trường cảm ứng có hàm lượng ựường cao (MS+8% sucarose), trong vòng 30 phút trước khi lây nhiễm khuẩn thấy hiệu quả chuyển gen tăng 143% so với ựiều kiện không xử lắ mẫu. Kết quả trên cũng giống với nghiên cứu của Chu Hoàng Hà (2009) trên ựối tượng cây quýt đường Canh và cam Xã đoài.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
2.11.4. Các yếu tố trong giai ựoạn ựồng nuôi cấy
2.11.4.1. Nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy
Nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy có ảnh hưởng ựến hiệu quả biến nạp gen vì : nó có ảnh hưởng ựến sự phát triển của vi khuẩn và khả năng sống của mẫu, ựến hoạt tắnh của hệ thống protein vir (ựặc biệt là vir A) và tắnh ổn ựịnh của ựoạn T-DNA xen vào (Sanlas, 2001). Nhiều nghiên cứu cho thấy khi tiến hành ựồng nuôi cấy trong ựiều kiện nhiệt ựộ tương ựối thấp có tác dụng kắch thắch và làm tăng tần số chuyển gen, nhiệt ựộ ựó thường dao ựộng 190C-250C là thắch hợp nhất. Tuy nhiên chúng còn biến ựổi theo từng giống cam quýt: cam ngọt Valencia là 190C [41], [42], cam ngọt Bingtang là 230C (Yan-Xin Duan, 2006), kết quả của Alemeida (2003) trên ựối tượng Citrus sinensis và Citrus limonia là 230C Ờ 270C và các nghiên cứu của Ghorbel (2000) chỉ ra nhiệt ựộ ựó là 220C-260C ựối với giống cam chua.
2.11.4.2. Nồng ựộ acetosyringone bổ sung vào môi trường nuôi cấy
Acetosyringone (C10H12O; M=196,2) là một hợp chất của phenol, ựược cây tiết ra khi chúng bị tổn thương. Chất này có tác dụng thu hút vi khuẩn
Agrobacterium và xúc tiến quá trình chuyển ựoạn và gắn T-DNA vào bộ gen
của cây thông qua hoạt hóa hệ thống gen vir. Nên ựây là một chất bắt buộc và cần thiết cho hoạt ựộng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Có những giống cây có khả năng tự tiết ựủ lượng acetosyringone cho quá trình hoạt hóa hệ thống gen vir thì không cần bổ sung AS vào môi trường ựồng nuôi cấy (Vắ dụ ở giống Carrizo Citrange) [50]. Tuy nhiên, rất nhiều cây ựòi hỏi phải bổ sung Acetosyringone vào môi trường ựồng nuôi cấy ựể tăng hiệu quả chuyển gen. Tùy loại cây mức ựộ bổ sung nồng ựộ AS là có khác nhau: cam ngọt Pineapple [32] và bưởi Duncan là 100 ộM AS [47], cam ngọt Navel Washington và cam ngọt Hamlin cho kết quả cao nhất ở nồng ựộ AS là 200 ộM [29].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Hình 2.8. Cơ chế hoạt hóa hệ thống gen vir của acetosyringone
(Nguồn: Dandekar, 2009) 2.11.4.3. Thời gian ựồng nuôi cấy
Thời gian ựồng nuôi cấy có ảnh hưởng ựến hiệu quả biến nạp gen vì: nó có ảnh ựến sự phát triển của vi khuẩn và khả năng tái sinh của mẫu.
đa số các nghiên cứu của nhiều tác giả Pena et al (2003), Yan Xin Duan (2006) và Yan-Xin Duan (2006), trên ựối tượng ựoạn epicotyl của các giống cam quýt ựều chỉ ra rằng thời gian ựồng nuôi cấy thắch hợp là 3 ngày, trong ựiều kiện tối. Tuy nhiên, khi mẫu cấy là lá mầm thì chỉ cần 2 ngày (Khawale et al, 2006).
2.11.4.4. Nồng ựộ auxin bổ sung vào môi trường ựồng nuôi cấy
Các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả (Pena et al-2003; Cervera
et al -1998,Ầ) trên ựoạn epicotyl của cây citrus ựã chỉ ra rằng: việc bổ sung
auxin vào môi trường ựồng nuôi cấy có tác dụng tăng tần số chuyển gen. Nguyên nhân là do trong môi trường ựồng nuôi cấy giầu auxin ựã gia tăng số các tế bào mô phân sinh ựang ở pha S (pha nhân ựôi ADN). điều này là cần thiết cho quá trình gắn ựoạn T-DNA vào bộ NST của cây.
Pena và cộng sự (2003), tiến hành ựồng nuôi cấy ựoạn epicotyl của cây
cam carrizo Citrange theo ba công thức hormon khác nhau (không có
hormon, 1 mg/lBA, 2 mg/l IAA+1mg/l 2-isopentenyl-adenine + 2 mg/l 2,4D), cho thấy hiệu quả chuyển gen cao nhất ở công thức giầu auxin.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 Các nghiên cứu trên nhiều ựối tượng khác cũng thấy rằng, các tế bào kắ chủ ở pha S là cần thiết ựối với sự chuyển ựoạn T-DNA: tế bào lá mầm của cây thuốc lá petunia (Villemon et al, 1997), trên ựoạn hypocotyl của cây hoa Hướng Dương (Suttle, 1991), ựoạn epicotyl của cây đậu (Jacobsen,1995), trên các bộ phận của Citrus (Dias et al, 2000), cây cải Arabidopsis (Changhe Y et al, 2002).
2.12. Những nghiên cứu về môi trường tái sinh chồi, chọn lọc chồi chuyển gen, kéo dài chồi và tái sinh rễ gen, kéo dài chồi và tái sinh rễ
Môi trường tái sinh chồi, chọn lọc chồi chuyển gen, kéo dài chồi và tái sinh rễ trong nghiên cứu của các tác giả nước ngoài là môi trường MT + 30 g/l sucarose + hormon + kháng sinh + 8 g/l agar, pH=5,8. Bốn tuần ựầu nuôi cấy trong tối, ựến khi tái sinh chồi thì ựể ra ngoài sáng với chế ựộ chiếu sáng là 16 h/ngày, nhiệt ựộ 270C và ựộ ẩm 60%.
Kháng sinh ựược sử dụng ựể diệt Agrobacterium thường là cefotaxime. Cefotaxim là kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ III, có phổ kháng khuẩn rộng. So với các cephalosporin thuộc thế hệ I và II, thì cefotaxime có tác dụng lên vi khuẩn G- mạnh hơn, bền hơn ựối với tác dụng thủy phân của enzym β- lactamase. Nhưng tác dụng lên các vi khuẩn G+ lại yếu hơn các cephalosporin thuộc thế hệ I. Trong các nghiên cứu của Li, Shi, Deng , 2003 [41, 42] trên cây cam ngọt Bingtang và cam ngọt Valencia ựều sử dụng cefotaxime nồng ựộ 400 mg/l. Còn Pena et al (2004) lại sử dụng môi trường có 500 mg/l Cefetaxime ựối với giống cam carrizo Citrange [51].
Chất kháng sinh ựược sử dụng ựể chọn lọc tế bào mang gen biến nạp thường là kanamycine (với Ti-plasmid có chứa Kmr). Trong các nghiên cứu của Yan-Xin Duan (2006) trên ựối tượng là ựoạn epicotyl của cây cam ngọt Bingtang và của cam ngọt Valencia, hay của Deng (2003) với giống cam ngọt Valencia ựều sử dụng kanamycine ở nồng ựộ 50 mg/l.
Theo Phan Hữu Tôn (2010) ựã chỉ ra môi trường tái sinh chồi thắch hợp nhất cho giống cam Vinh là 1mg/l BA, còn môi trường ra rễ chứa 1mg/l NAA+ 0,5mg/l IAA.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu chuyển gen
Hạt của hai giống quýt đường Canh và cam Vinh
3.1.2. Vector
Vector pDU04.1004 chứa gen sinh auxin và pDU04.4522 chứa gen mẫn cảm với auxin do Trường đại học Califonia, Mỹ và Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp. Hai vector này ựược biến nạp vào Agrobacterium tumerfacies
chủng C58.
Hình 3.1. Vector pDU04.1004 và pDU04.4522 chứa gen sinh và mẫn cảm với auxin
Trên vector pDU04.1004 và pDU4.4522 có chứa gen chọn lọc kháng kháng sinh gentamycin, gen chọn lọc Mas-KAN kháng kanamycin, gen chỉ thị Ubi3- GUS, gen ựắch INO-iaaM và INO-rolB. INO là promoter (INNER
NO OUTER promoter) hoạt ựộng ựặc thù bầu nhụy ựược tách ra từ cây
Arabidopsis.
Trong số các gen thì gen kháng kháng sinh gentamycin không thuộc vùng T-ADN và ựược dùng ựể chọn lọc vi khuẩn mang vector. Còn ba gen
INO- iaaM hoặc INO-rolB, mas-KAN và gen Ubi3-GUS ựều nằm trên ựoạn T-
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36 thuật chuyển gen thì gen mas-KAN dùng ựể chọn lọc tế bào chuyển gen, gen Ubi-GUS dùng ựể kiểm tra các tế bào thực vật ựã nhận ựược gen INO-iaaM
hoặc INO-rolB hay chưa.
Các promoter INO, Mas, Ubi3 ựều có hoạt tắnh mạnh ở tế bào thực vật, riêng promoter Ubi3 có tắnh trội và chỉ hoạt ựộng ở thực vật.
3.1.3. Hóa chất và thiết bị
* Hóa chất
Các hóa chất, môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào (môi trường MS, LB), chất kắch thắch sinh trưởng (NAA, BA, GA3), chất phênol dẫn dụ vi khuẩn AS, một số loại kháng sinh (kanamycin, gentamycin, cefotaxime), X-Gluc. Các hóa chất do các hãng Fermentas (Mỹ), Pro.Lab, Sigma (Mỹ), có trụ sở ựại diện ở Việt Nam cung cấp.
* Thiết bị
Các thiết bị như bốc cấy, nồi hấp, máy ựo pH, máy ựo OD, tủ ổn nhiệt, máy ựiều chỉnh ánh sáng, Ầ do các hãng của Nhật, đức, Mỹ sản xuất.
3.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB vào quýt đường Canh và Cam Vinh.
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung Acetosyringone (AS) vào môi trường ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả chuyển gen
INO-iaaM và INO-rolB vào quýt đường Canh và Cam Vinh.
Nội dung 3:Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB vào quýt đường Canh và Cam Vinh
Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung auxin vào môitrường ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37 Nội dung 5: Bước ựầu chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB hoạt ựộng ựặc thù bầu nhụy vào quýt đường Canh và Cam Vinh trên cơ sở quy trình chuyển gen ựã xây dựng.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Tạo vật liệu chuyển gen
Hạt của 2 giống quýt đường Canh và Cam Vinh ựược gieo trên môi trường MS + 30 g/l Saccaroza + 8 g/l agar, pH = 5,8. Chọn những quả chắn, không bị thối, không nhiễm bệnh, tiến hành tách lấy hạt, ựem hạt rửa sạch bằng nước xà phòng cho hết nhớt, rồi thấm khô bằng giấy. Bóc vỏ hạt và 1/3 vỏ lụa (phần ựầu to), tiếp theo khử trùng phôi hạt bằng dung dịch Johnson 10% trong 5 phút.
Cấy mỗi ống nghiệm một hạt, 2 tuần ựầu ựể trong tối, ở 260C, ựộ ẩm 60% -70%, 2 tuần tiếp theo dùng chế ựộ chiếu sáng 2000 lux, 16h/ ngày.
Hình 3.2. Cây mầm 4 tuần tuổi
Sau 4 tuần cây dài khoảng 8-10 cm, mầu xanh nhạt và lúc này thân mầm chưa hóa gỗ mạnh, các mô chưa biệt hóa hoàn toàn, ựặc biệt là mô phân sinh thượng tầng. điều này tạo ựiều kiện thuận lợi cho quá trình tái sinh callus
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38 và chồi. Tiến hành chọn những cây khỏe mạnh, không bị nhiễm vi sinh vật, cắt ựoạn thân trên lá mầm (epicotyl) thành những ựoạn dài 1cm. đây là vật liệu trực tiếp ựể lây nhiễm khuẩn chuyển gen.
3.3.2. Phương pháp tạo dịch huyền phù vi khuẩn chứa vector mang gen
Chủng Agrobacterium tumerfacies C58 giống gốc chứa 2 vector mang 2 gen sinh và mẫn cảm với auxin là có hạn và ở trạng thái tiềm sinh, nên trước khi ựem lây nhiễm chuyển gen ta cần phải tiến hành nuôi cấy, nhân nhanh nhằm ựảm bảo ựủ số lượng phục vụ cho lây nhiễm chuyển gen. Quá trình này gồm các giai ựoạn sau:
- Giai ựoạn I: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường LB ựặc
Môi trường LB ựặc, gồm các thành phần: 10 g/l yeast extract + 5 g/l NaCl + 10 g/l Pepton + 15 g/l agar, pH = 7.
Lấy vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 tái tổ hợp từ ống giữ chủng gốc ựang bảo quản trong tủ lạnh sâu -800C ra ngoài và ựặt vào trong bốc cấy. đợi cho ựến khi nó tan chảy thì lấy 100ộl vi khuẩn cấy vạch trên 1 ựĩa pettri chứa 30ml môi trường LB ựặc ựã thanh trùng và có bổ sung 50mg/l gentamycine, ựể chống sự xâm nhiễm của các vi khuẩn khác. Chú ý: kháng sinh gentamycine cho vào ngay sau khi hấp, nhưng trước khi môi trường bị ựông lại, nhiệt ựộ tốt nhất là khoảng 40-450C ựể tránh kháng sinh bị biến tắnh. Nuôi vi khuẩn trong tủ ấm ở nhiệt ựộ 270C trong 48 giờ, khi ựó quan sát sẽ thấy xuất hiện khuẩn lạc mầu trắng sữa.
- Giai ựoạn II: Nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng
Lấy một vòng vi khuẩn từ ựĩa petri cấy vào bình tam giác loại 250ml có chứa 50ml môi trường LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh gentamycine nồng ựộ 50mg/l. Chú ý, chỉ nên cho 50 ml/bình vì nếu nhiều quá sẽ khó lắc ựều và vi khuẩn phát triển cũng sẽ chậm hơn. Bình nuôi cấy ựược ựặt trong máy lắc với tốc ựộ 180rpm, nhiệt ựộ 270C, trong khoảng thời gian 24h, lúc ựó quan sát thấy dịch có hiện tượng vẩn ựục.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
- Giai ựoạn III:Tạo dịch huyền phù vi khuẩn
Sau giai ựoạn II mật ựộ vi khuẩn thường cao hơn mật ựộ tối ưu cho lây nhiễm. Vì vậy ta phải tiến hành ựo chỉ số OD600, rồi tiến hành li tâm với tốc ựộ 6000vòng/phút ựể thu sinh khối vi khuẩn và dùng môi trường pha loãng vi khuẩn {môi trường MS +3%sucrose + (0 ộM, 100 ộM, 200 ộM) acetosyringone}, pH =5.8 cho ựến khi chỉ số OD600= 0,7 sẵn sàng dùng ựể lây nhiễm chuyển gen.
3.3.3. Phương pháp cảm ứng mẫu, lây nhiễm khuẩn và ựồng nuôi cấy
* Cảm ứng mẫu
Dung dịch cảm ứng mẫu là môi trường có áp suất thẩm thấu cao, thành phần môi trường gồm: MS + 8% sucarose, pH = 5.8. Các ựoạn trụ trên lá mầm (epycotyl) ựược ngâm vào dung dịch cảm ứng trong 30 phút, giúp tăng hiệu quả biến nạp
* Lây nhiễm khuẩn chuyển gen
Cho các ựoạn epicotyl nhúng ngập trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 20 phút, mục ựắch là giúp cho vi khuẩn bám vào mẫu.
* đồng nuôi cấy
đồng nuôi cấy là giai ựoạn diễn ra quá trình biến nạp, chuyển ựoạn T-