4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.4. Ảnh hưởng của auxin vào môitrường ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả
chuyển gen
Quá trình chuyển ựoạn T-DNA ựạt hiệu quả cao khi ựối tượng là các tế bào mô phân sinh ựang phân chia, ựặc biệt là khi tế bào ựang ở pha S (pha ADN ựang nhân ựôi). Nồng ựộ cao của auxin trong môi trường ựồng nuôi cấy có tác dụng kắch thắch gia tăng tỉ lệ các tế bào ựang ở pha S , từ ựó gia tăng tần số biến nạp gen (Pena et al, 2004). Tuy nhiên, mỗi giống cam quýt lại có mức ựộ mẫn cảm ựối với nồng ựộ auxin khác nhau. Do ựó trong thắ nghiệm này chúng tôi tiến hành ựồng nuôi cấy có bổ sung NAA theo các nồng ựộ khác nhau (không bổ sung, 2 mg/l, 4 mg/l). Sau 3 ngày ựồng nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển mẫu sang môi trường tái sinh chồi, tiếp ựó là môi trường chọn lọc chứa 50 mg/l kanamycine. Tiến hành theo dõi: tỉ lệ mẫu tái sinh chồi, tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc. Kết quả ựược thể hiện ở bảng 4.4a, 4.4b, biểu ựồ 4.4a và 4.4b.
Từ kết quả thu ựược ở bảng 4.4a, 4.4b, biểu ựồ 4.4a và 4.4b ta thấy, khi môi trường ựồng nuôi cấy không bổ sung NAA thì mẫu có hiệu quả tái sinh chồi cao nhất. Quýt đường Canh 69,0% (chuyển gen INO-iaaM) 67,0% (chuyển gen INO-rolB). Cam Vinh 68,0% (chuyển gen INO-iaaM) và 63,6%
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 61 (chuyển gen INO-rolB). Khi môi trường ựồng nuôi cấy có bổ sung 4mg/l NAA có tỉ lệ tái sinh chồi thấp nhất. đối với quýt đường Canh là 61,0% (chuyển gen INO-iaaM) và 56,6% (chuyển gen INO-rolB). đối với cam Vinh ựạt 51,0% (chuyển gen INO-iaaM) và 54,3% (chuyển gen INO-rolB). Với cây cam, quýt khi môi trường nuôi cấy có nồng ựộ NAA cao (4 mg/l) có tác dụng kắch thắch sự hình thành callus, nhưng lại ức chế sự tái sinh chồi của mẫu.
Bảng 4.4a. Ảnh hưởng của auxin ựến phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và sống sót trên môi trường chọn lọc của quýt đường Canh
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường tái sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc Gen chuyển Nồng ựộ NAA (mg/l) Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) 0 69,0 6 9,0 16,3 16,3 2 64,0 64,0 18,6 18,6 iaaM-INO 4 61,0 61,0 14,3 14,3 CV% 3,6 LSD0,05 2,3 0 67,0 67,0 17,6 17,6 2 63,3 63,3 19,6 19,6 rolB-INO 4 56,6 56,6 15,3 15,3 CV% 4,6 LSD0,05 2,0
Bảng 4.4b. Ảnh hưởng của auxin trong môi trường ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và sống sót trên môi
trường chọn lọc của cam Vinh
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường tái sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc Gen chuyển Nồng ựộ NAA (mg/l) Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) 0 68,0 68,0 15,6 15,6 2 64,0 64,0 17,0 17,0 iaaM-INO 4 51,0 51,0 13,3 13,3 CV% 4,0 LSD0,05 1,6 0 63,6 63,6 16,3 16,3 2 60,6 60,6 18,3 18,3 rolB-INO 4 54,3 54,3 14,0 14,0 CV% 3,0 LSD0,05 1,0
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 62
Biếu 4.4 a. Ảnh hưởng bổ sung auxin vào môi trường ựồng nuôi cấy ựến khả năng tái sinh chồi và sống sót trên môi trường chọn lọc gen của mẫu quýt
đường Canh (từ trái qua phải, chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB)
Biếu 4.4 a. Ảnh hưởng bổ sung auxin vào môi trường ựồng nuôi cấy ựến khả năng tái sinh chồi và sống sót trên môi trường chọn lọc gen của mẫu cam
Vinh (từ trái qua phải, chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB)
0 mg 2 mg 4mg 0 mg 2 mg 4mg
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 63 Việc bổ sung NAA vào môi trường ựồng nuôi cấy có tác dụng tăng hiệu quả chuyển gen. Tỷ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc ựối với trường hợp không bổ sung NAA lần lượt là 16,3%, 17,6% (chuyển gen và INO-rolB vào quýt đường Canh). 15,6%, 16,3 % (chuyển gen INO-
iaaMvà INO-rolB vào cây cam Vinh). Khi bổ sung NAA với nồng ựộ 2mg/l
và 4mg/l tỷ lệ mẫu chồi sống sót trên môi trường chọn lọc ựối với cây quýt đường Canh lần lượt là 18,6% và 14,3% (chuyển gen INO-iaaM), 19,6% và 15,3% (chuyển gen INO-rolB). đối với cam Vinh, tỷ lệ mẫu chồi sống sót lần lượt là 17,0% và 13,3% (chuyển gen INO-iaaM), 18,3% và 14,0% (chuyển
gen INO-rolB). Như vậy bổ sung 2mg/l hiệu quả biến nạp gen cao hơn 4mg/l
và không bổ sung NAA ở mức có ý nghĩa ựối với cả 2 giống chuyển gen. Nồng ựộ 2 mg/l NAA là mức hợp lắ, vừa ựủ ựể dung hòa ựược hai yếu tố, một mặt có tác dụng kắch thắch hoạt ựộng phân bào, gia tăng tỉ lệ các tế bào ựang ở pha S, mặt khác cũng không ảnh hưởng nhiều ựến khả năng tái sinh chồi của mẫu như ựối với nồng ựộ 4 mg/l NAA. Kết quả thu ựược tương tự như với kết quả nghiên cứu của Pena (2004) trên giống Carrizo citrange hay của Dias et al (2000) trên các bộ phận của Citrus. Kết quả tương tự cũng ựược báo cáo ở nhiều loài cây không thuộc Citrus như cây Thuốc Lá (Villemon, 1997), cây Hoa Hướng Dương (Suttle, 1991) và cây đậu (Jacobsen, 1995).
Nhận xét: Bổ sung 2mg/l NAA vào môi trường ựồng nuôi cấy thu ựược tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc là cao nhất. Do ựó việc bổ sung 2mg/l NAA vào môi trường ựồng nuôi cấy là nồng ựộ NAA là thắch hợp nhất cho hoạt ựộng biến nạp gen vào trụ trên lá mầm cây quýt đường Canh và cam Vinh thông qua Agrobacterium tumefaciens.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 64
Hình 4.6. Ảnh hưởng của việc bổ sung NAA vào môi trường ựồng nuôi cấy ựến khả năng tái sinh chồi của mẫu.
A.4 (không có NAA). B.4 (2mg/l NAA). C4 và D4 (4mg/l NAA), nhiều mẫu có hiện tượng tạo calus mạnh, nhưng lại kém tạo chồi.