2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.10.2. Phân tắch cây chuyển gen có chứa gen GUS bằng nhuộm mô tế bào
Gen gus là một gen chỉ thị lý tưởng với những ựặc ựiểm sau: sản phẩm của nó là ựộc nhất và không ựộc với tế bào vật chủ, các enzyme chỉ thị của nó có tắnh ổn ựịnh cao, các phương pháp phân tắch sản phẩm của gen này ựơn giản, thuận tiện, rẻ tiền, nhạy và ựặc thù, có khả năng kết hợp với các polypeptit bên ngoài mà vẫn giữ ựược hoạt tắnh enzyme.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28 Gen gus mã hóa cho enzyme β-glucuronidase. Enzyme này là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải cơ chất X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-
indolyl glucuronide) thành một hợp chất trung gian, mà khi bị oxi hóa sẽ tạo
ra chất indigo có màu xanh lam ựặc trưng, dễ nhận biết và rất bền vững. Vì vậy gen gus là gen chỉ thị rất hữu hiệu trong kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. để thuận lợi hơn cho việc sử dụng gen chỉ thị GUS ở thực vật, người ta tiến hành thiết kế vùng cấu trúc intron. Do vậy, trong các bước biểu hiện gen gus tạm thời ở mô thực vật tránh ựược hiện tượng dương tắnh giả do vi khuẩn. Vì khi còn ở trong vi khuẩn Agrobacterium, gen gus nằm trong vùng intron của vector chuyển gen nên không ựược dịch mã thành sản phẩm enzyme và không có phản ứng tạo màu ựặc trưng khi nhuộm trong cơ chất X-gluc. Nguyên nhân là do trong vi khuẩn không có hệ thống ựể loại bỏ các ựoạn intron. Chỉ khi ựược chuyển vào tế bào thực vật, nơi có hệ thống loại bỏ các ựoạn intron nên gen gus ựược phiên mã, dịch mã tạo enzyme β-glucuronidase và có phản ứng mầu ựặc trưng khi nhuộm [14, 15, 22].
Hình 2.7. Cơ chế tạo phản ứng màu xanh lam ựặc trưng của gen GUS
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
2.10.3. Phân tắch cây chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử
2.10.3.1. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)
Kỹ thuật PCR còn ựược gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp, ựược sử dụng cho mục ựắch nhân nhanh một số lượng không hạn chế một ựoạn ADN nhất ựịnh. PCR ựược sử dụng phổ biến ựể kiểm tra, ựánh giá kết quả chuyển gen ở mức phân tử. Ưu ựiểm của phương pháp này là nhanh, nhạy và ựặc biệt là không cần dùng ựồng vị phóng xạ. Tuy nhiên, kỹ thuật này còn bộc lộ một số hạn chế ựáng kể như: mức ựộ ngoại nhiễm cao, khó khuếch ựại những ựoạn ADN có kắch thước lớn, tần số sai sót trong quá trình tổng hợp bởi Taq- polymerase còn cao... Vì vậy, ựây ựược xem là bước ựầu tiên trong ựánh giá sự có mặt của gen chuyển vào cây ở mức phân tử [14, 17].
2.10.3.2. Kỹ thuật lai Southern (southern blotting)
Kỹ thuật lai Southern do Edward Southern phát minh năm 1975. Lai Southern dựa trên khả năng giữ lại các ựoạn ADN ựã qua xử lắ enzym cắt giới hạn trên một màng mỏng ựặc biệt. Màng mỏng này sau ựó ựược ngâm trong dung dịch có chứa ADN mẫu dò ở dạng ựánh dấu. Nếu có mặt gen cần xác ựịnh trên ADN trải trên màng mỏng thì các ựoạn ADN của gen sẽ bắt cặp (lai) với ADN mẫu dò theo nguyên tắc bổ sung và ựược nhận biết qua phóng xạ tự ghi. Kỹ thuật lai Southern nhằm nhận biết sự tồn tại của gen chuyển trong genome của cây chủ [14, 17].
2.10.3.3. Kỹ thuật lai Northern (Northern blotting)
Lai Northern là phương pháp xác ựịnh kắch thước và số lượng các phân tử mARN trong ARN tổng số. để làm việc này, trước hết tách ARN bằng ựiện di trên gel agarose, sau ựó ựược thấm truyền lên màng cellulose.Về nguyên tắc, lai Northern cũng tương tự như lai Southern. điều khác biệt là trong lai Northern, ARN ựược thấm truyền sau ựó lai với ADN hoặc ARN ựánh dấu, còn ở lai Southern ADN ựược thấm truyền và sau ựó ựược lai với ADN ựánh dấu. Kỹ thuật lai Northern nhằm ựánh giá hoạt ựộng phiên mã của gen chuyển khi ựược gắn vào genome của cây chủ [14, 17].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
2.10.3.4. Kỹ thuật lai Western (Western blotting)
Kỹ thuật lai Western là kỹ thuật lai protein với kháng thể ựặc hiệu, sử dụng trong các nghiên cứu protein và enzyme. Protein mẫu sau khi ựược phân tắch bằng ựiện di trên gel acrylamide, sẽ ựược chuyển sang cố ựịnh trên một chất giá thể cũng bằng ựiện di. Chất giá thể thường sử dụng là các loại màng khác nhau như: màng nitrocellulose, diazophenylthio (DPT), diazobenzyloxymethyl (DBM), nylon, Ầ Protein ựã cố ựịnh trên màng sẽ ựược phát hiện bằng phản ứng miễn dịch kép. Kỹ thuật lai Western là bước quan trọng nhằm ựánh giá mức ựộ biểu hiện của gen chuyển khi ựược ựưa vào cây ở mức ựộ protein và thể hiện tắnh trạng [14, 17].