2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.9.2. Các phương pháp chuyển ge nở thực vật
Một trở ngại lớn giữa chuyển gen ở thực vật so với chuyển gen ở ựộng vật ựó là thành tế bào. đây là một hàng rào ngăn chặn rất có hiệu quả ựối với sự xâm nhập của các ADN ngoại lai. Mặc dù vậy, người ta cũng tìm ra ựược một số phương pháp ựược áp dụng rất thành công ở thực vật.
1- Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium (Binns, 1990).
đây là phương pháp chuyển gen ựược ựánh giá có hiệu quả nhất trong công nghệ chuyển gen ở thực vật (sẽ ựược trình bày ở mục 2.9.3).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 18
2- Biến nạp trực tiếp qua protoplast (Paszkowski, 1989)
Protoplast có thể coi là một ựối tượng lý tưởng ựể chuyển gen. Do loại tế bào này không còn thành cenluloza nên ADN có thể xâm nhập rất dễ dàng vào bên trong. Một ựiểm nữa là việc tách thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay hóa học ựều tạo ra tổn thương ựối với tế bào và chuyển chúng sang trạng thái có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Ở ựây ADN ựược hấp thụ bằng một quá trình sinh lý ựơn thuần và loại bỏ ựược hạn chế cách ly sinh sản giữa các nhóm thực vật. Vì thế, phương pháp này thường ựược gọi là phương pháp chuyển gen trực tiếp và ựược áp dụng cho những cây mà phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium không thể thực hiện ựược. Quá trình hấp thụ ADN vào protoplast có thể ựược gia tăng nhờ xử lý bằng polyethylene glycol (PEG) hoặc xung ựiện. PEG là chất ái lực với nước rất mạnh, ở nồng ựộ cao, PEG làm cho ADN cần ựược biến nạp không còn ở trạng thái hòa tan trong nước mà bám dắnh vào màng sinh chất của protoplast ựể ựược chuyển vào bên trong. Còn khi xử lý xung ựiện tạo ra trên bề mặt protoplast xuất hiện tạm thời các lỗ có ựường kắnh khoảng 30 nm, qua ựó ADN cần ựược biến nạp có thể chui qua dễ dàng. Tuy nhiên, việc tái sinh các protoplast còn nhiều hạn chế nên nó chưa trở thành phương pháp thông dụng.
3- Chuyển gen bằng súng bắn gen (Sanford, 1988)
Nguyên lắ chung của phương pháp này là sử dụng luồng khắ helium áp lực cao ựể bắn các hạt bụi vàng hoặc volfram ựược bọc ngoài bằng ADN vào khối mô ựặt phắa trước luồng ỘựạnỢ. Bằng dụng cụ này, ta có thể chuyển gen vào tất cả các loại tế bào, mô. Nghĩa là nó có thể cho phép ựưa các gen vào các loại tế bào và vào các vị trắ mong muốn mà không cần những ựiều kiện thắ nghiệm quá phức tạp. đây chắnh là ưu việt lớn nhất của phương pháp này.
4- Phương pháp vi tiêm- microinjection (Schnorf, 1991)
Phương pháp này có một số ựặc ựiểm: Chỉ cho phép ựưa ADN vào một tế bào cho mỗi lần tiêm, lượng ADN ựưa vào là tùy ý, ADN ựược ựưa
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 19 vào ựúng chỗ. Phương pháp này áp dụng có hiệu quả ựối với các tế bào có cấu trúc bé như hạt phấn, phôi non mà các kỹ thuật khác không thể áp dụng ựược [17, 22].