3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3. Phương pháp cảm ứng mẫu, lây nhiễm khuẩn và ựồng nuôi cấy
* Cảm ứng mẫu
Dung dịch cảm ứng mẫu là môi trường có áp suất thẩm thấu cao, thành phần môi trường gồm: MS + 8% sucarose, pH = 5.8. Các ựoạn trụ trên lá mầm (epycotyl) ựược ngâm vào dung dịch cảm ứng trong 30 phút, giúp tăng hiệu quả biến nạp
* Lây nhiễm khuẩn chuyển gen
Cho các ựoạn epicotyl nhúng ngập trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 20 phút, mục ựắch là giúp cho vi khuẩn bám vào mẫu.
* đồng nuôi cấy
đồng nuôi cấy là giai ựoạn diễn ra quá trình biến nạp, chuyển ựoạn T- DNA từ vi khuẩn gắn vào genome của thực vật. Vì vậy, các yếu tố trong giai ựoạn này có ảnh hưởng lớn tới hiệu quả chuyển gen. Do ựó trong ựề tài này chúng tôi tập trung nghiên cứu bốn yếu tố: nhiệt ựộ, nồng ựộ AS, thời gian và nồng ựộ NAA ựể tìm ra giá trị tối ưu cho biến nạp gen.
Môi trường ựồng nuôi cấy là môi trường MS + 1mg/l BA + (0 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l, 3 mg/l và 4 mg/l) NAA + (0 ộM, 50 ộM, 100 ộM, 150 ộM, 200 ộM) AS + 3% sucarose + 0,8% agar, pH = 5,8. Các ựoạn epicotyl sau khi lây nhiễm khuẩn sẽ ựược cấy ựặt vào các bình có chứa 40ml môi trường, mỗi bình khoảng 7-10 mẫu. Sau ựó các bình này ựược ựặt trong tủ ổn nhiệt, với ba mức
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 nhiệt ựộ (220C, 250C và 280C), ựặt trong ựiều kiện tối và ựồng nuôi cấy theo ba mức thời gian (2 ngày, 3 ngày và 4 ngày).
3.3.4. Phương pháp rửa khuẩn và tái sinh chồi
* Rửa khuẩn
Sau ựồng nuôi cấy, các ựoạn epicotyl ựược rửa khuẩn và thấm khô bốn lần (2 lần bằng nước cất vô trùng và 2 lần bằng dung dịch có chứa kháng sinh cefotaxime 500mg/l). Trong mỗi lần rửa các mẫu ựược gắp vào trong các bình chứa 100ml nước hay dung dịch kháng sinh, lắc nhẹ 10Ỗ, sau ựó gắp mẫu ra ựặt lên giấy thấm vô trùng, nhằm thấm khô và loại bỏ bớt vi khuẩn bám trên bề mặt mẫu. Sau bốn lần rửa và thấm khô như trên về cơ bản các vi khuẩn bám trên bề mặt mẫu ựã bị rửa trôi do nước hay bị chết bởi kháng sinh cefotaxime.
* Tái sinh chồi
Các ựoạn epicotyl sau khi ựược rửa khuẩn ựược ựặt nằm ngang trong bình cấy có chứa 40ml môi trường/bình. Mỗi bình cấy 7-10 mẫu (càng về sau số mẫu trên mỗi bình càng giảm), ựể bình vào trong tủ nuôi cấy ở ựiều kiện 270C, ựộ ẩm 60-70%, 4 tuần ựầu không bật ựèn ựể kắch thắch sự tạo callus ở 2 ựầu của ựoạn cấy, ựến tuần thứ 5 các mẫu bắt ựầu nẩy chồi thì bật ựèn với chế ựộ chiếu sáng 200lux và 16 giờ/ ngày. Cứ 4-6 tuần cấy chuyển một lần, tùy theo mức ựộ bị tái nhiễm khuẩn. Sau 2,5 tháng thì có ựến 60- 70% các mẫu tái sinh chồi, mỗi mẫu có khoảng 1-6 chồi, chồi dài 0,5 -1,5cm, có 1 Ờ 3 lá. Mẫu ắt chồi thì chồi to, dài và ngược lại. Môi trường tái sinh chồi là MS + (1- 2 mg)/l BA + 30g/l saccarose + 8g/l agar, PH =5,8, ựây là môi trường tái sinh tốt nhất ựã ựược các tác giả kết luận.
3.3.4. Phương pháp chọn lọc cây chuyển gen
Thành phần môi trường nuôi cấy ựể chọn lọc cây chuyển gen là môi trường MS + (1-2 mg)/l BA + 50 mg/l kanamycin , pH=5,8.
Sau khoảng 2,5 tháng nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi, tiến hành cấy chuyển các mẫu ựã tái sinh chồi (gồm cả chồi nhận ựược và không nhận
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41 ựược gen biến nạp) sang môi trường chọn lọc có bổ sung 50mg/l kanamycine. Trong môi trường này, những mẫu chồi nào nhận ựược ựoạn T-DNA, trong ựó có gen kháng kanamycine thì vẫn tiếp tục sống, còn các chồi khác sẽ có hiện tượng chuyển mầu dần từ xanh sang vàng và cuối cùng bị chết. Sau khoảng 2 tháng chỉ còn khoảng 15-20% số chồi là còn sống sót, nhiều cây trong ựó là cây ựã nhận ựược gen ựắch INO-iaaM hoặc INO-rolB.
3.4. Bước ựầu thử nghiệm chuyển gen INO-iaaM vàINO-rolB vào trụ trên lá mầm giống cam Vinh và quýt đường Canh nhờ Agrobacterium trên lá mầm giống cam Vinh và quýt đường Canh nhờ Agrobacterium tumefaciens
Từ kết quả thu ựược trong các thắ nghiệm nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào trụ trên lá mầm cây quýt đường Canh và Cam Vinh (Thắ nghiệm 1, 2, 3 và 4), chúng tôi xây dựng quy trình chuyển gen vào thân mầm của giống cam Vinh nhờ Agrobacterium tumefaciens.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
Sơ ựồ tóm tắt các bước tiến hành chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB vào trụ trên lá mầm cây quýt đường Canh và cam Vinh nhờ Agrobacterium
tumefaciens
3. Cờm ụng mÉu, lẹy nhiÔm vộ ệăng nuềi cÊy
Mềi tr−êng ệăng nuềi cÊy, nhiỷt ệé vộ thêi gian ệăng nuềi cÊy ệ−ĩc xẹy dùng dùa vộo kạt quờ cựa cịc thÝ nghiỷm 1, 2, 3 vộ 4.
5. Chản lảc cẹy chuyÓn gen vộ kiÓm tra gen GUS
- Mềi tr−êng chản lảc: MS+1-2mg/l BA +50mg/l kanamycin - GUS+
: cã mộu xanh lam ệẳc tr−ng
4. Rỏa khuÈn vộ tịi sinh chăi
- dd rỏa khuÈn: 500mg/l cef
- Mềi tr−êng tịi sinh chăi: MS+1-2mg/l BA + 400mg/l cef
1.TỰo vẺt liỷu chuyÓn gen
- Khử trùng: dd Johnson 10%, 10 phút
- Mềi tr−êng gieo hỰt MS
- ậoỰn epicotyl dội 1cm lộm mÉu
2. TỰo dỡch huyÒn phỉ vi khuÈn
- Nuềi trến LB ệẳc - Nuềi trến LB láng - OD600=0,7
6. KĐo dội chăi
MS+1mg/l NAA + 0,1mg/l GA3
7. Tịi sinh rÔ hoặc vi ghép
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43 Sau ựó tiến hành thử nghiệm chuyển gen sinh auxin và mẫn cảm với auxin hoạt ựộng ựặc thù bầu nhụy vào trụ trên lá mầm của cây quýt đường Canh và cam Vinh nhờ Agrobacterium tumefaciens, qua ựó sẽ kiểm nghiệm ựược tắnh hiệu quả của quy trình, cũng như phần nào ựánh giá ựược tỉ lệ chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB thông qua kiểm tra gen GUS.
3.5. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng chất X-Gluc
Cắt mỗi chồi còn sống một lá, sau ựó ựem ngâm ủ trong dung dịch ựệm có chứa X-Gluc, ựặt trong tủ ổn nhiệt ở 370C. Sau 48 giờ ủ, ựem mẫu ra ngâm vào dung dịch cồn 700 ựể rửa hết diệp lục (rửa 2-3 lần, mỗi lần cách nhau 3-5 tiếng), rồi tiến hành quan sát và chụp ảnh. Những lá hay chồi nào không nhận ựược gen biến nạp thì không có màu xanh (GUS-). Còn những mẫu nào có màu xanh lam ựặc trưng (GUS+) là cây ựã nhận ựược gen ựắch INO- iaaM
hoặc INO-rolB. Những cây có biểu hiện gen GUS+ sẽ ựược cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi, rồi ựến môi trường tái sinh rễ hoặc vi ghép và cuối cùng chuyển ra vườn ươm.
3.6. Bố trắ thắ nghiệm và các chỉ số theo dõi
* Bố trắ thắ nghiệm: Mỗi công thức thắ nghiệm 100 mẫu/lần, nhắc lại 3 lần
* Các chỉ số theo dõi:
- Giai ựoạn ựồng nuôi cấy
+ Tỉ lệ sống và màu sắc của mẫu. + đặc ựiểm khuẩn lạc.
- Giai ựoạn tái sinh chồi
+ Tỉ lệ mẫu bị tái nhiễm khuẩn.
+Tỉ lệ mẫu sống, tỉ lệ mẫu có xuất hiện chồi và số chồi trung bình/mẫu.
- Giai ựoạn nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và phân tắch gen GUS
+ Tỉ lệ số mẫu chồi còn sống sót (số chồi còn sống sót/ số mẫu cấy). + Màu sắc chồi và lá.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
3.7. Xử lý số liệu
- Xử lý số liệu bằng Excel và bằng phần mềm IRRI start 4.0
3.8. địa ựiểm và thời gian nghiên cứu
- địa ựiểm: Khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường đại học Nông
Nghiệp Hà Nội.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen sinh auxin (INO-iaaM) và mẫn cảm auxin (INO-rolB) vào trụ trên lá mầm cây quýt đường Canh và cam auxin (INO-rolB) vào trụ trên lá mầm cây quýt đường Canh và cam Vinh thông qua Agrobacterium tumefaciens
4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả biến nạp gen.
Nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy là một trong những yếu tố ảnh hưởng ựến sự phát triển của vi khuẩn, khả năng tái sinh của mẫu và hiệu quả biến nạp gen (Almeida et al, 2003). Tuy nhiên, nhiệt ựộ tối ưu cho hoạt ựộng biến nạp gen lại khác nhau giữa các giống cam quýt. Ở thắ nghiệm này, các mẫu sau khi cho nhiễm khuẩn ựược tiến hành ựồng nuôi cấy với các nhiệt ựộ khác nhau (220C, 250C, 280C). Sau 3 ngày ựồng nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển mẫu sang môi trường tái sinh chồi (kéo dài 2,5 tháng), rồi môi trường chọn lọc chứa 50mg/l kanamycine (kéo dài 2 tháng). Trong quá trình này tiến hành theo dõi: tỉ lệ khuẩn lạc phát triển quá mạnh phủ kắn mẫu làm cho mẫu bị chết, tỉ lệ mẫu tái sinh chồi, tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc. Kết quả ựược tổng hợp ở bảng 4.1a, 4.1b, biểu ựồ 4.1a và 4.1b.
Từ kết quả thu ựược ở bảng 4.1a, 4.1b, biểu ựồ 4.1a và 4.1b cho thấy, nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy có ảnh hưởng lớn ựến sự phát triển của vi khuẩn, khả năng tái sinh của mẫu và tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc. Khi nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy giảm từ 280C xuống 220C có tác dụng kìm hãm sự hình thành các khuẩn lạc phát triển, tăng khả năng tái sinh chồi và tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc có kanamycine. đối với quýt đường canh, ở 280C tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc thấp nhất, chỉ ựạt 3,3% (chuyển gen INO-iaaM) và 3,6% (chuyển gen INO-rolB). Tiếp theo ở 250C tăng dần lên 8,6% (chuyển gen INO-iaaM) và 6% (chuyển gen INO- rolB). Còn ở 220C tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc ựạt cao nhất 14,6% (chuyển gen INO-iaaM) và 17% (chuyển gen INO-rolB). Tương tự, ựối
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46 với chuyển gen vào cam Vinh, tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc thấp nhất ở 280C, ựạt 4,0% (chuyển gen INO-iaaM) và 4,6% (chuyển gen gen
INO-rolB). Tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc cao nhất ở 220C, ựạt
15,3% (chuyển gen INO-iaaM) và 17,3% (chuyển gen INO-rolB).
Sự tăng tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc phản ánh hiệu quả biến nạp gen khi giảm nhiệt ựộ. Như vậy, hiệu quả biến nạp gen thấp nhất ở nhiệt nhiệt ựộ cao 280C, tăng dần ở 250C và ựạt cao nhất ở nhiệt ựộ thấp 220C ựối với cả quýt đường Canh và cam Vinh.
Bảng 4.1a. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và khả năng sống sót của mẫu quýt
đường canh trên môi trường chọn lọc gen
Khuẩn lạc phủ kắn mẫu
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường
tái sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn
lọc Gen chuyển Nhiệt ựộ (0C) Số lượng (khuẩn lạc) Tỉ lệ (%) Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) 28 7,3 7,3 15,3 15,3 3,3 3,3 25 5,0 5,0 34,0 34,0 8,6 8,6 iaaM-INO 22 0 0,00 64,6 64.6 14,6 14,6 CV% 3,40 4,20 LSD0,05 8,3 5,6 28 6,6 6,6 10,0 10,0 3,6 3,6 25 4,0 4,0 32,6 32,6 6,0 6,0 rolB-INO 22 0 0,00 60,0 60,0 17,0 17,0 CV% 2,6 2,3 LSD0,05 9,1 4,0
đồng nuôi cấy ở nhiệt ựộ cao 280C có hiệu quả quả biến nạp gen thấp là vì:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47 khuẩn lạc lớn phủ kắn mẫu, do ựó làm giảm sức sống và khả năng tái sinh của mẫu, thậm chắ gây chết mẫu ngay sau 3 ngày ựồng nuôi cấy (ựối với những mẫu có vi khuẩn phủ kắn mẫu). Sự phát triển quá mạnh của vi khuẩn còn gây khó khăn cho quá trình rửa và diệt khuẩn, dẫn ựến làm tăng hiện tượng mẫu bị tái nhiễm khuẩn nhiều lần, khi ựó càng làm cho tỉ lệ mẫu bị mất khả năng tái sinh chồi tăng lên.
+ Theo Almeida et al (2003), nhiệt ựộ cao trên 290C ảnh hưởng ựến quá trình chuyển ựoạn T-DNA từ Agrobacterium vào bộ gen của tế bào thực vật. Lý do là hệ thống protein vir, ựặc biệt là protein virA rất mẫn cảm với nhiệt ựộ cao, chúng bị bất hoạt ở 290C và biến tắnh ở 320C. Chắnh ựiều này giải thắch tại sao bệnh khối u do Agrobacterium thường không xuất hiện vào mùa hè.
Bảng 4.1b. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và khả năng sống sót của mẫu cam Vinh
trên môi trường chọn lọc gen
Khuẩn lạc phủ kắn mẫu
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường
tái sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn
lọc Gen chuyển Nhiệt ựộ (0C) Số lượng (khuẩn lạc) Tỉ lệ (%) Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) 28 8,3 8,3 14,0 14,0 4,0 4,0 25 2,3 2,3 31,3 31,3 7,6 7,6 iaaM-INO 22 0 0,00 67,0 67,0 15,3 15,3 CV% 4,0 3,6 LSD0,05 7,6 5,2 28 7,6 7,6 12,0 12,0 4,6 4,6 25 3,6 3,6 34,0 34,0 6,6 6,6 rolB-INO 22 0 0,00 64,0 64,0 17,3 17,3 CV% 4,3 4,6 LSD0,05 10,3 8,6
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48 + Ở nhiệt ựộ này vi khuẩn phát triển ở mức vừa phải (không thấy xuất hiện những khuẩn lạc trùm phủ kắn mẫu), mật ựộ khuẩn vừa ựủ ựể thực hiện quá trình chuyển gen và ắt ảnh hưởng ựến sức sống và khả năng tái sinh của mẫu.
+ Theo Almeida thì nhiệt ựộ tối ưu cho hoạt tắnh của protein virA là 220C- 230C.
Kết quả này tương tự với những thông báo của Alemeida (2003) trên ựối tượng Citrus sinensis và Citrus limonia, hay của Ghorbel (2000), trên một số ựối tượng khác không thuộc chi Citrus như: Phaseolus acutifolius và
Nicotiana tabacum là 220C (Dillen et al, 1997), Lycopersium sculentum là
22-240C (Costa et al, 2000).
Biểu ựồ 4.1a. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến tỷ lệ tái sinh chồi và tỷ lệ mẫu sống của quýt đường Canh trên môi trường chọn lọc (từ trái qua phải gen INO-
iaaM, INO-rolB)
280C 250C 220C 280
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 49
Biểu ựồ 4.1b. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến tỷ lệ tái sinh chồi và tỷ lệ mẫu sống của cam Vinh trên môi trường chọn lọc (từ trái qua phải
gen INO-iaaM, INO-rolB)
Nhận xét: đồng nuôi cấy ở 220C có tỉ lệ tái nhiễm khuẩn thấp, khả năng tái sinh chồi cao và tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc là cao nhất ựối với cả quýt đường Canh và cam Vinh. Do ựó 220C là nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy thắch hợp nhất cho hoạt ựộng chuyển gen vào trụ trên lá mầm cây quýt đường Canh và cam Vinh thông qua Agrobacterium tumefaciens. đồng nuôi cấy ở 220C ựược lựa chọn trong các thắ nghiệm tiếp theo.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 50
Hình 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của Agrobacterium tumefaciens và mẫu sau ba ngày ựồng nuôi cấy trên Cam Vinh
Avộ B- ẻ 28OC cã nhọng khuÈn lỰc phự trỉm kÝn mÉu vộ mÉu cã hiỷn t−ĩng chạt.
C- ẻ 250C khuÈn lỰc t−ểng ệèi khị dộy, mÉu hểi yạu.
D- 22OC khuÈn lỰc lộ lắp mộng máng bao quanh mÉu, mÉu cưn t−ểi hển cờ.
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến khả năng tái sinh chồi cây cam Vinh.
E- ở 280C nhiều mẫu có hiện tượng mất khả năng tái sinh chồi, do bị tái nhiễm khuẩn nhiều lần. G- ở 250C chồi nhỏ. H- ở 220C chồi nhiều và lớn