3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. Phương pháp tạo dịch huyền phù vi khuẩn chứa vector mang gen
Chủng Agrobacterium tumerfacies C58 giống gốc chứa 2 vector mang 2 gen sinh và mẫn cảm với auxin là có hạn và ở trạng thái tiềm sinh, nên trước khi ựem lây nhiễm chuyển gen ta cần phải tiến hành nuôi cấy, nhân nhanh nhằm ựảm bảo ựủ số lượng phục vụ cho lây nhiễm chuyển gen. Quá trình này gồm các giai ựoạn sau:
- Giai ựoạn I: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường LB ựặc
Môi trường LB ựặc, gồm các thành phần: 10 g/l yeast extract + 5 g/l NaCl + 10 g/l Pepton + 15 g/l agar, pH = 7.
Lấy vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 tái tổ hợp từ ống giữ chủng gốc ựang bảo quản trong tủ lạnh sâu -800C ra ngoài và ựặt vào trong bốc cấy. đợi cho ựến khi nó tan chảy thì lấy 100ộl vi khuẩn cấy vạch trên 1 ựĩa pettri chứa 30ml môi trường LB ựặc ựã thanh trùng và có bổ sung 50mg/l gentamycine, ựể chống sự xâm nhiễm của các vi khuẩn khác. Chú ý: kháng sinh gentamycine cho vào ngay sau khi hấp, nhưng trước khi môi trường bị ựông lại, nhiệt ựộ tốt nhất là khoảng 40-450C ựể tránh kháng sinh bị biến tắnh. Nuôi vi khuẩn trong tủ ấm ở nhiệt ựộ 270C trong 48 giờ, khi ựó quan sát sẽ thấy xuất hiện khuẩn lạc mầu trắng sữa.
- Giai ựoạn II: Nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng
Lấy một vòng vi khuẩn từ ựĩa petri cấy vào bình tam giác loại 250ml có chứa 50ml môi trường LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh gentamycine nồng ựộ 50mg/l. Chú ý, chỉ nên cho 50 ml/bình vì nếu nhiều quá sẽ khó lắc ựều và vi khuẩn phát triển cũng sẽ chậm hơn. Bình nuôi cấy ựược ựặt trong máy lắc với tốc ựộ 180rpm, nhiệt ựộ 270C, trong khoảng thời gian 24h, lúc ựó quan sát thấy dịch có hiện tượng vẩn ựục.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
- Giai ựoạn III:Tạo dịch huyền phù vi khuẩn
Sau giai ựoạn II mật ựộ vi khuẩn thường cao hơn mật ựộ tối ưu cho lây nhiễm. Vì vậy ta phải tiến hành ựo chỉ số OD600, rồi tiến hành li tâm với tốc ựộ 6000vòng/phút ựể thu sinh khối vi khuẩn và dùng môi trường pha loãng vi khuẩn {môi trường MS +3%sucrose + (0 ộM, 100 ộM, 200 ộM) acetosyringone}, pH =5.8 cho ựến khi chỉ số OD600= 0,7 sẵn sàng dùng ựể lây nhiễm chuyển gen.