4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung acetosyringone vào môitrường ựồng nuô
nuôi cấy ựến hiệu quả biến nạp gen.
Khi nghiên cứu quá trình chuyển gen nhờ Agrobacterium, người ta nhận thấy rằng khi cây bị tổn thương sẽ tiết ra chất ựộc vết thương, ựó là hợp chất phenolic: Acetosyringone (AS), Hydroxyacetosyringone (OH-AS). Các chất này có tác dụng làm lành vết thương, nhưng ựồng thời cũng thu hút vi khuẩn Agrobacterium tập trung quanh vùng vết thương và hoạt hóa hệ thống gen vir trên Ti-plasmid. Do ựó AS là chất không thể thiếu ựối với hoạt ựộng biến nạp gen của vi khuẩn Agrobacterium (Henzi et al, 2000). Vận dụng ựặc tắnh này, ựể nâng cao hiệu quả chuyển gen nhờ Agrobacterium, người ta thường bổ sung AS vào dung dịch pha loãng vi khuẩn và môi trường ựồng nuôi cấy. Tuy nhiên, phản ứng với AS còn phụ thuộc vào từng giống cam quýt. Trong thắ nghiệm ựối với cây cam Vinh, chúng tôi ựã tiến hành thắ nghiệm bổ sung AS vào dung dịch pha loãng vi khuẩn và môi trường ựồng nuôi cấy theo các nồng ựộ khác nhau (không bổ sung, 100ộM, 150ộM, 200ộM). Sau 3 ngày ựồng nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển mẫu sang môi trường tái sinh chồi, rồi môi trường chọn lọc chứa 50mg/l kanamycine. Trong quá trình này tiến hành theo dõi: tỉ lệ mẫu tái sinh chồi, tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc. Kết quả ựược thể hiện ở bảng 4.2a, 4.2b, biểu ựồ 4.2a và 4.2b.
Từ kết quả thu ựược ở bảng 4.2a, 4.2b cho thấy, việc bổ sung acetosyringone vào môi trường ựồng nuôi cấy là cần thiết và có tác dụng làm tăng hiệu quả biến nạp gen. điều này có thể giải thắch bởi lượng acetosyringone do ựoạn epicotyl của 2 giống quýt đường Canh và cam Vinh tiết ra chưa ựủ lớn ựể ựạt ựến ngưỡng cực thuận cho quá trình hoạt hóa hệ thống protein vir, nên khi ta bổ sung thêm AS vào môi trường ựồng nuôi cấy ựã có tác dụng tăng hiệu quả biến nạp gen.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 52 đối với cây quýt đường Canh, tỷ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc của công thức có bổ sung 100 ộM AS/l là 17,6% (chuyển gen
INO-iaaM) và 18,6% (chuyển gen INO-rolB). Khi tăng nồng ựộ lên 150ộM
AS/L, tỷ lệ mẫu sống là 15,0% (chuyển gen INO-iaaM) và 16,0% (chuyển
gen INO-rolB). Tiếp tục tăng nồng ựộ lên 200ộM AS/l thấy có xu hướng số
mẫu sống trên môi trường chọn lọc giảm, chỉ còn 14% (chuyển gen INO- iaaM) và 14,6% (chuyển gen INO-rolB). đối chứng không bổ sung AS là 14,3% (chuyển gen INO-iaaM) và 14,6% (chuyển gen INO-rolB).
Bảng 4.2a. Ảnh hưởng AS ựến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và khả năng sống sót của mẫu quýt đường Canh
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường tái
sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn
lọc Gen chuyển Công thức Nồng ựộ acetosyringone (ộộộM)ộ Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) đC 0 64,3 64,3 15,0 14,3 1 100 72,6 72,6 17,6 17,6 2 150 66,6 66,6 15,0 15,0 iaaM-INO 3 200 61,3 61,3 14,0 14,0 CV% 3,6 LSD0,05 2,3 đC 0 64,6 64,6 16,6 16,6 1 100 70,0 70,0 18,6 18,6 2 150 67,3 67,3 16,0 16,0 rolB-INO 3 200 66,6 66,6 14,6 14,6 CV% 3,3 LSD0,05 1,6
Tương tự, ựối với chuyển gen vào cây cam Vinh, tỷ lệ mẫu chồi sống sót trên môi trường chọn lọc khi bổ sung 100ộM AS/l là 17,6% (chuyển gen
INO-iaaM) và 18,6% (chuyển gen INO-rolB). Khi tăng lên 150ộM AS/l và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 53 dần, lần lượt là 14,3% và 10,6% (chuyển gen INO-iaaM), 14,6% và 13,0% (chuyển gen INO-rolB).
Bảng 4.2b. Ảnh hưởng AS ựến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và khả năng sống sót của mẫu cam Vinh
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường tái
sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn
lọc Gen chuyển Công thức Nồng ựộ acetosyringone (ộộộM)ộ Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) đC 0 63,6 63,6 15,0 15,0 1 100 71,0 71,0 17,6 17,6 2 150 65,6 65,6 14,3 14,3 iaaM-INO 3 200 61,3 61,3 10,6 10,6 CV% 2,6 LSD0,05 2,3 đC 0 63,3 63,3 15,3 15,3 1 100 66,3 66,3 18,6 18,6 2 150 62,3 62,3 14,3 14,6 rolB-INO 3 200 49,6 49,6 13,0 13,0 CV% 2,3 LSD0,05 1,6
Biểu ựồ 4.2a. Tỷ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc ựối với quýt đường Canh khi bổ sung nồng ựộ AS khác nhau vào môi trường ựồng nuôi cấy
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 54
Biểu ựồ 4.2b. Tỷ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc ựối với Cam Vinh khi bổ sung nồng ựộ AS khác nhau vào môi trường ựồng nuôi cấy
Như vậy cả quýt đường Canh lẫn cam Vinh ựều cho hiệu quả biến nạp gen cao khi bổ sung 100ộM AS/l, và giảm dần khi tăng lên 150ộM AS/l và 200ộM AS/l. Khi tăng nồng ựộ lên 150ộM AS/l và 200ộM AS/l có thể vượt quá ngưỡng cực thuận gây ra sự ức chế làm giảm hiệu quả chuyển gen. Kết quả này cũng tương tự như những nghiên cứu của Cervera (1998) trên giống cam ngọt Pineapple, Luth và Moore (1999) với giống bưởi Ducan và Dutt (2009) với giống cam Carrio. Tuy nhiên ở một số nghiên cứu khác các tác giả kết luận nồng ựộ 200ộM AS là cực thuận ựối với giống cam ngọt Washiton nevel (Bond, 1998). Ở một số nghiên cứu khác các tác giả lại kết luận giống Carrizo cittrange khi không bổ sung AS lại có kết quả cao hơn khi bổ sung
100ộM AS, 150ộM AS/l hoặc 200ộM AS (Pena, 1995), do các giống cam này ựã tiết ựủ lượng AS cần thiết.
Nhận xét: Việc bổ sung 100ộM acetosyringone vào dung dịch pha loãng vi khuẩn và môi trường ựồng nuôi cấy ựã thu ựược tỉ lệ mẫu chồi còn
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 55 sống sót trên môi trường chọn lọc là cao nhất ở mức có ý nghĩa. Do ựó, có thể nói việc bổ sung 100ộM AS vào môi trường ựồng nuôi cấy là nồng ựộ AS thắch hợp nhất cho hoạt ựộng biến nạp gen vào ựoạn trụ trên lá mầm cây quýt đường Canh và cam Vinh thông qua Agrobacterium tumefaciens. Bổ sung 100ộM AS vào dung dịch pha loãng vi khuẩn và môi trường ựồng nuôi cấy ựược lựa chọn trong các thắ nghiệm tiếp theo.
Hình 4.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung acetosyringone vào môi trường ựồng nuôi cấy ựến khả năng sống sót của mẫu trên môi trường chọn lọc.
Từ trái qua phải (không bổ sung AS; Bổ sung 100ộM AS; Bổ sung 150ộM
AS; Bổ sung 200ộM AS)