2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.9.3. Chuyển ge nở thực vật nhờ Agrobacterium
2.9.3.1. Tắnh ưu việt của chuyển gen ở thực vật nhờ Agrobacterium
Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật. Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium ựược xem là phương pháp có hiệu quả cao nhất:
Trước tiên, khi xem xét vị trắ biểu hiện màu xanh lam của phản ứng GUS, nhận thấy rằng, Agrobacterium có xu hướng chuyển gen vào những vùng mô ựang phân bào mạnh. đây là lợi thế lớn nhất của phương pháp này vì mô phân sinh là nơi diễn ra quá trình tái sinh callus, chồi và rễ ựể tạo thành một cây hoàn chỉnh mang gen biến nạp. Khai thác ựặc tắnh này nên trước khi tiến hành lây nhiễm phải hoạt hóa mẫu ựể tăng nhanh khả năng phân chia của mô phân sinh, khi ựó sẽ tăng tần số và hiệu quả biến nạp gen. đối với các phương pháp khác như sử dụng súng bắn gen hoặc vi tiêm, tuy có thể thực hiện trên tất cả các ựối tượng thực vật, nhưng gen mục tiêu ựược chuyển một cách ngẫu nhiên, không ựịnh hướng và kém ổn ựịnh.
Một ưu ựiểm nữa của phương pháp này là gen mục tiêu ắt bị ựào thải, nó tồn tại khá bền vững trong cơ thể thực vật. Trong khi ựó ở các phương pháp khác, gen mục tiêu ựược tái tổ hợp nhờ hai trình tự IS ở hai ựầu. Nhưng do IS có nguồn gốc từ gen nhảy nên nó cũng có thể dễ dàng tách ra ngay sau ựó [8].
2.9.3.2. đặc ựiểm sinh học của Agrobacterium
Vi khuẩn có dạng hình gậy, kắch thước 2,5-3,0 x 0,7-0,8 ộm, dạng ựơn bào, không sinh bào tử, có vỏ, lông và roi. Là vi khuẩn hiếu khắ, nhuộm G-, khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn. Khi nuôi cấy trên môi trường pepton khuẩn lạc có mầu trắng kem, nhẵn và bóng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 20 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phát triển mạnh ở nhiệt ựộ 200C- 300C. Một ựiểm ựáng chú ý là khi ở nhiệt ựộ cao Ti-plasmid của vi khuẩn bị bất hoạt và mất khả năng gây bệnh.
Kết quả các thắ nghiệm về ảnh hưởng của pH ựối với sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn A. tumefaciens cho thấy loài vi khuẩn này phát triển tốt trong khoảng pH = 6-7, tốt nhất ở pH = 6,5.
Tất cả các dòng Agrobacterium dùng ựể chuyển gen hiện nay ựều có nguồn gốc tự nhiên, do ựó chúng vẫn còn mang một số ựặc tắnh của chủng hoang dại cần ựược lưu ý: Agrobacterium không thể gây khối u (chuyển T- DNA) ở nhiệt ựộ trên 29oC và trong môi trường kiềm. Lý do là hệ thống protein vir của vi khuẩn, ựặc biệt là virA rất nhạy cảm với nhiệt ựộ, chúng bất hoạt ở 29oC và biến tắnh ở 32oC. Hiệu suất chuyển gen ựạt cao nhất ở 22oC và khoảng pH từ 5.2 - 5.8. điều này ựược giải thắch là do thụ thể nhận biết ký chủ của Agrobacterium (ChvE-VirA) ựược hoạt hóa bằng proton của hợp chất phenolic và nó bị bất hoạt trong môi trường bazơ. Một khi protein VirA bị bất họat thì tế bào Agrobacterium sẽ mất khả năng hoạt hóa toàn bộ hệ thống protein vir, dẫn ựến mất khả năng chuyển gen [8, 14].
2.9.3.3. Ti-plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật
Ti-plasmid có kắch thước khoảng 200 kb và gồm bốn vùng:
Vùng A: Vùng T-DNA (transfer ỜDNA), ựược truyền sang tế bào thực vật.
Vùng B: Có ựiểm ori khởi ựộng tái bản Ti-plasmid
Vùng C: Có liên quan ựến sự tiếp hợp (conjugative transfer).
Vùng D: Vùng gen vir (virulence region), giữ vai trò quan trọng trong
việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của tế bào thực vật.
Ngoài ra, còn có vùng opine catabolism, mã hóa các enzym phân giải opine ựể làm nguồn dinh dưỡng carbon và nitơ cho vi khuẩn [33].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
Hình 2.2. Cấu tạo Ti- plasmid
(Nguồn: Dandekar, 2009) 2.9.3.4. T-DNA và hai trình tự biên 25 bp
Vùng T-DNA có kắch thước từ 10-20kb, nằm kẹp giữa hai trình tự 25bp lặp lại không hoàn chỉnh, gồm biên trái (left border= LB) và biên phải (right
border = RB). Toàn bộ phần giới hạn bởi biên phải và trái này ựều ựược
chuyển sang tế bào thực vật. LB và RB là những yếu tố cần thiết ựể ựịnh hướng cho sự chuyển ựoạn T- DNA. Việc mất ựi 6 bp ựầu tiên hoặc 10 bp cuối cùng trong số 25 bp của mỗi trình tự ựều ngăn cản sự chuyển của T-DNA. Qúa trình chuyển T-DNA ựược bắt ựầu từ RB và kết thúc ở LB. Sự ựịnh hướng này là rất quan trọng, nếu không việc chuyển gen sẽ kém hiệu quả.
Tại vùng T-DNA có hai nhóm gen: Một là nhóm gen gây khối u onc
(oncogenic), nó chứa ắt nhất ba gen chịu trách nhiệm tổng hợp auxin và cytokinin, do ựó có liên quan ựến việc sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục. Hai là nhóm gen mã hóa cho một số enzym ựiều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các axit amin hay ựường, gọi là opine. Hai loại enzym ựã ựược nghiên cứu kỹ nhất là octopine synthetase và nopaline synthetase [33].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 22
A/
B/
Hình 2.3. A- Cấu tạo ựoạn T-DNA. B- Hai trình tự biên RB và LB
(Nguồn: Dandekar, 2009) 2.9.3.5. Vùng gen vir
Chắnh hoạt ựộng của vùng gen vir ựóng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Nó có kắch thước khoảng 40 kb và bao gồm sáu operon: vir A, B, C, D, E, G. Trong ựó Vir A, B, D, G là cần thiết cho việc tạo ra tắnh ựộc. Còn Vir C, E liên quan ựến việc hình thành khối u. Trừ vir G, A, còn các operon khác ựều là ựa cistron.
Nói chung, gen vir A biểu hiện ở mọi ựiều kiện, gen vir C biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng, nhưng thể hiện rất mạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương. Hoạt ựộng của các operon này có liên quan chặt chẽ ựến sự có mặt của các hợp chất phenolic ựược cây tiết ra từ vết thương. Từ vết thương của cây thuốc lá người ta ựã tinh chế và xác ựịnh ựược các hợp chất này là acetosyringone và hydroxyacetosyringone [33].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 23
(Nguồn: Dandekar, 2009)
Hình 2.4. Sơ ựồ thể hiện vai trò của các gen vir
2.9.3.6. Quá trình chuyển T-DNA từ Agrobacterium vào bộ gen thực vật
Quá trình chuyển ựoạn T-DNA nhờ Agrobacterium có thể ựược tóm tắt như sau:
-Acetosyringone ựược tiết ra từ vết thương của cây.
-Acetosyringone hoạt hóa protein virA ựang nằm sẵn trên màng tế bào vi khuẩn.
- Protein virA tiếp tục hoạt hóa protein virG bằng cách phosphoryl hóa nhờ ATP.
- Protein virG ựã hoạt hóa sẽ gắn vào gen chỉ huy của các gen vir khác
(vir B, C, D, E) gây ra sự hoạt hóa các gen này.
- Protein virD2 gắn vào các trật tự biên, cắt và tạo ra các vết nứt tại một mạch của T-DNA.
- Nhờ ADN-polymerase mà mạch mới thay thế ựược tổng hợp bắt ựầu từ RB ựến LB, còn mạch ựơn T-DNA dần ựược tách ra,
-Mạch ựơn T-DNA có protein virE bám vào ựể tạo ra phức ổn ựịnh protein~T-DNA gọi là T-complex.
-Protein virB tạo ra cầu nối thông thương giữa tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật, giúp cho phức hệ T-complex có thể ựi ựược dễ dàng ựể sang tế bào thực vật, rồi gắn vào genome thực vật [11, 12, 33].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 A/
B/
(Nguồn: Dandekar, 2009)
Hình 2.5. A- Quá trình tạo phức T-complex.
B- Cơ chế chuyển ựoạn T-DNA của Agrobacterium tumefaciens 2.9.3.7. Các loại vector dựa trên Ti-plasmid
Ti-plasmid khó ựược dùng trực tiếp trong các thắ nghiệm chuyển gen, vì nó có kắch thước lớn và mang các gen gây khối u, hơn nữa ADN của Ti- plasmid có quá nhiều chỗ ựể các enzym giới hạn, trong khi ựó người ta chỉ cần một số ắt vị trắ như vậy mà thôi. Vì vậy người ta ựã thiết kế ra hai loại vector.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
2.9.3.7.1. Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector)
đây là sự hợp nhất của hai loại plasmid khác nhau, trước khi ựược biến nạp sang tế bào thực vật. Ta sẽ xem xét một dạng vector liên hợp ựiển hình là pVG3850 do Zambryski thiết kế năm 1983. Hệ thống này gồm hai plasmid:
Plasmid thứ nhất là Ti-plasmid thể nhận pVG3850, có nguồn gốc từ
pTiC58. Nó chứa vùng gen vir, vùng T-DNA chỉ giữ lại hai trật tự biên LB và RB cùng một số gen chỉ thị, còn thì loại bỏ hết (vì thế không có khả năng gây ra khối u) và ựược thay thế vào ựó là một ựoạn tương ựồng với ựoạn có trên plasmid thứ hai. đoạn ựược ựưa vào thay thế này thực ra là một plasmid nhỏ pBR322 của vi khuẩn E.coli.
Plasmid thứ hai (plasmid trung gian) pVG1103, là một plasmid ựã tách
dòng của vi khuẩn E.coli dựa trên plasmid pRB322 và có thể tái bản ựược ở
Agrobacterium. Trên vector trung gian này chứa hai nhóm gen chọn lọc: một
cho sự chọn lọc vi khuẩn (Kmr/ gen kháng gentamycin) và một gen cho sự sàng lọc ở tế bào thực vật biến nạp gen (nos-nptII/ gen kháng kanamycin), một ựoạn tương ựồng với ựoạn có trên vector pGV3850, một ựoạn có phổ tái bản rộng (ColEI) và ựoạn MCS ựể gắn gen cần chuyển.
Sau khi trộn lẫn hai loại plasmid trên với nhau, giữa chúng xảy ra sự tiếp hợp nhờ ựoạn khởi ựầu EcolEI có trong pGV1103. Quá trình tiếp hợp dẫn ựến sự hợp nhất giữa hai loại plasmid nhờ hiện tượng trao ựổi chéo xảy ra giữa các vùng tương ựồng của hai loại plasmid pGV3850 và pGV1103. Vì thế vector liên hợp pGV3850-pGV1103 ựã chứa toàn bộ vector trung gian trong ựó có gen cần ựược chuyển vào tế bào thực vật [33].
2.9.3.7.2. Hệ thống vector nhị thể (binary vector)
Khác với hệ thống vectơ liên hợp, ở hệ thống vector nhị thể, ựoạn mang T-DNA và ựoạn mang gen vir nằm trên hai plasmid khác nhau. Mặt khác, nó không nhất thiết phải chứa ựoạn tương ựồng với Ti-plasmid và có khả năng tái bản ựộc lập trong cả tế bào E.coli và Agrobacterium. đây cũng là ưu ựiểm của hệ thống vector này so với vector liên hợp. Dưới ựây ta xem xét một hệ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26 thống vector nhị thể ựiển hình là pBin19 do Bevan thiết kế từ 1984, nhưng ựến nay vẫn còn ựược dùng phổ biến.
Plasmid thứ nhất có nguồn gốc từ pUC19 của vi khuẩn E.coli (vì
thế nó có thể tái bản trong tế bào E.coli) mang ựoạn T-DNA chỉ còn lại hai trật tự biên RB và LB (còn phần mang gen gây khối u ựã bị tách bỏ) và xen vào là một số gen cần thiết như gen kháng gentamycine, gen GUS và gen ựắch [14, 33].
Plasmid thứ hai ựóng vai trò hỗ trợ, là Ti-plasmid ở vi khuẩn
Agrobacterium, mà trong ựó toàn bộ vùng T-ADN (kể cả trật tự biên) ựã bị loại
bỏ, nhưng vẫn còn vùng gen vir. Vùng gen vir này ựóng vai trò quan trọng cho việc chuyển ựoạn T-DNA của vector nhị thể. Loại plasmid thứ nhất sau khi ựã ựược nhân lên trong tế bào E.coli thì ựược chuyển sang Agrobacterium chứa plasmid thứ hai bằng quá trình tiếp hợp [33].
Hình 2.6. Quá trình tạo vector nhị thể
(Nguồn: Dandekar, 2009)