4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả biến nạp gen
Nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy là một trong những yếu tố ảnh hưởng ựến sự phát triển của vi khuẩn, khả năng tái sinh của mẫu và hiệu quả biến nạp gen (Almeida et al, 2003). Tuy nhiên, nhiệt ựộ tối ưu cho hoạt ựộng biến nạp gen lại khác nhau giữa các giống cam quýt. Ở thắ nghiệm này, các mẫu sau khi cho nhiễm khuẩn ựược tiến hành ựồng nuôi cấy với các nhiệt ựộ khác nhau (220C, 250C, 280C). Sau 3 ngày ựồng nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển mẫu sang môi trường tái sinh chồi (kéo dài 2,5 tháng), rồi môi trường chọn lọc chứa 50mg/l kanamycine (kéo dài 2 tháng). Trong quá trình này tiến hành theo dõi: tỉ lệ khuẩn lạc phát triển quá mạnh phủ kắn mẫu làm cho mẫu bị chết, tỉ lệ mẫu tái sinh chồi, tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc. Kết quả ựược tổng hợp ở bảng 4.1a, 4.1b, biểu ựồ 4.1a và 4.1b.
Từ kết quả thu ựược ở bảng 4.1a, 4.1b, biểu ựồ 4.1a và 4.1b cho thấy, nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy có ảnh hưởng lớn ựến sự phát triển của vi khuẩn, khả năng tái sinh của mẫu và tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc. Khi nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy giảm từ 280C xuống 220C có tác dụng kìm hãm sự hình thành các khuẩn lạc phát triển, tăng khả năng tái sinh chồi và tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc có kanamycine. đối với quýt đường canh, ở 280C tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc thấp nhất, chỉ ựạt 3,3% (chuyển gen INO-iaaM) và 3,6% (chuyển gen INO-rolB). Tiếp theo ở 250C tăng dần lên 8,6% (chuyển gen INO-iaaM) và 6% (chuyển gen INO- rolB). Còn ở 220C tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc ựạt cao nhất 14,6% (chuyển gen INO-iaaM) và 17% (chuyển gen INO-rolB). Tương tự, ựối
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46 với chuyển gen vào cam Vinh, tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc thấp nhất ở 280C, ựạt 4,0% (chuyển gen INO-iaaM) và 4,6% (chuyển gen gen
INO-rolB). Tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc cao nhất ở 220C, ựạt
15,3% (chuyển gen INO-iaaM) và 17,3% (chuyển gen INO-rolB).
Sự tăng tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc phản ánh hiệu quả biến nạp gen khi giảm nhiệt ựộ. Như vậy, hiệu quả biến nạp gen thấp nhất ở nhiệt nhiệt ựộ cao 280C, tăng dần ở 250C và ựạt cao nhất ở nhiệt ựộ thấp 220C ựối với cả quýt đường Canh và cam Vinh.
Bảng 4.1a. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và khả năng sống sót của mẫu quýt
đường canh trên môi trường chọn lọc gen
Khuẩn lạc phủ kắn mẫu
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường
tái sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn
lọc Gen chuyển Nhiệt ựộ (0C) Số lượng (khuẩn lạc) Tỉ lệ (%) Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) 28 7,3 7,3 15,3 15,3 3,3 3,3 25 5,0 5,0 34,0 34,0 8,6 8,6 iaaM-INO 22 0 0,00 64,6 64.6 14,6 14,6 CV% 3,40 4,20 LSD0,05 8,3 5,6 28 6,6 6,6 10,0 10,0 3,6 3,6 25 4,0 4,0 32,6 32,6 6,0 6,0 rolB-INO 22 0 0,00 60,0 60,0 17,0 17,0 CV% 2,6 2,3 LSD0,05 9,1 4,0
đồng nuôi cấy ở nhiệt ựộ cao 280C có hiệu quả quả biến nạp gen thấp là vì:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47 khuẩn lạc lớn phủ kắn mẫu, do ựó làm giảm sức sống và khả năng tái sinh của mẫu, thậm chắ gây chết mẫu ngay sau 3 ngày ựồng nuôi cấy (ựối với những mẫu có vi khuẩn phủ kắn mẫu). Sự phát triển quá mạnh của vi khuẩn còn gây khó khăn cho quá trình rửa và diệt khuẩn, dẫn ựến làm tăng hiện tượng mẫu bị tái nhiễm khuẩn nhiều lần, khi ựó càng làm cho tỉ lệ mẫu bị mất khả năng tái sinh chồi tăng lên.
+ Theo Almeida et al (2003), nhiệt ựộ cao trên 290C ảnh hưởng ựến quá trình chuyển ựoạn T-DNA từ Agrobacterium vào bộ gen của tế bào thực vật. Lý do là hệ thống protein vir, ựặc biệt là protein virA rất mẫn cảm với nhiệt ựộ cao, chúng bị bất hoạt ở 290C và biến tắnh ở 320C. Chắnh ựiều này giải thắch tại sao bệnh khối u do Agrobacterium thường không xuất hiện vào mùa hè.
Bảng 4.1b. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và khả năng sống sót của mẫu cam Vinh
trên môi trường chọn lọc gen
Khuẩn lạc phủ kắn mẫu
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường
tái sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn
lọc Gen chuyển Nhiệt ựộ (0C) Số lượng (khuẩn lạc) Tỉ lệ (%) Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) 28 8,3 8,3 14,0 14,0 4,0 4,0 25 2,3 2,3 31,3 31,3 7,6 7,6 iaaM-INO 22 0 0,00 67,0 67,0 15,3 15,3 CV% 4,0 3,6 LSD0,05 7,6 5,2 28 7,6 7,6 12,0 12,0 4,6 4,6 25 3,6 3,6 34,0 34,0 6,6 6,6 rolB-INO 22 0 0,00 64,0 64,0 17,3 17,3 CV% 4,3 4,6 LSD0,05 10,3 8,6
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48 + Ở nhiệt ựộ này vi khuẩn phát triển ở mức vừa phải (không thấy xuất hiện những khuẩn lạc trùm phủ kắn mẫu), mật ựộ khuẩn vừa ựủ ựể thực hiện quá trình chuyển gen và ắt ảnh hưởng ựến sức sống và khả năng tái sinh của mẫu.
+ Theo Almeida thì nhiệt ựộ tối ưu cho hoạt tắnh của protein virA là 220C- 230C.
Kết quả này tương tự với những thông báo của Alemeida (2003) trên ựối tượng Citrus sinensis và Citrus limonia, hay của Ghorbel (2000), trên một số ựối tượng khác không thuộc chi Citrus như: Phaseolus acutifolius và
Nicotiana tabacum là 220C (Dillen et al, 1997), Lycopersium sculentum là
22-240C (Costa et al, 2000).
Biểu ựồ 4.1a. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến tỷ lệ tái sinh chồi và tỷ lệ mẫu sống của quýt đường Canh trên môi trường chọn lọc (từ trái qua phải gen INO-
iaaM, INO-rolB)
280C 250C 220C 280
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 49
Biểu ựồ 4.1b. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến tỷ lệ tái sinh chồi và tỷ lệ mẫu sống của cam Vinh trên môi trường chọn lọc (từ trái qua phải
gen INO-iaaM, INO-rolB)
Nhận xét: đồng nuôi cấy ở 220C có tỉ lệ tái nhiễm khuẩn thấp, khả năng tái sinh chồi cao và tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc là cao nhất ựối với cả quýt đường Canh và cam Vinh. Do ựó 220C là nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy thắch hợp nhất cho hoạt ựộng chuyển gen vào trụ trên lá mầm cây quýt đường Canh và cam Vinh thông qua Agrobacterium tumefaciens. đồng nuôi cấy ở 220C ựược lựa chọn trong các thắ nghiệm tiếp theo.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 50
Hình 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của Agrobacterium tumefaciens và mẫu sau ba ngày ựồng nuôi cấy trên Cam Vinh
Avộ B- ẻ 28OC cã nhọng khuÈn lỰc phự trỉm kÝn mÉu vộ mÉu cã hiỷn t−ĩng chạt.
C- ẻ 250C khuÈn lỰc t−ểng ệèi khị dộy, mÉu hểi yạu.
D- 22OC khuÈn lỰc lộ lắp mộng máng bao quanh mÉu, mÉu cưn t−ểi hển cờ.
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựồng nuôi cấy ựến khả năng tái sinh chồi cây cam Vinh.
E- ở 280C nhiều mẫu có hiện tượng mất khả năng tái sinh chồi, do bị tái nhiễm khuẩn nhiều lần. G- ở 250C chồi nhỏ. H- ở 220C chồi nhiều và lớn
A B
C D
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 51