4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.3. Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả chuyển gen
Thời gian ựồng nuôi cấy là một trong những yếu tố có ảnh hưởng quan trọng ựến hiệu quả biến nạp gen. Nó ảnh hưởng ựến sự phát triển của vi khuẩn và khả năng tái sinh của mẫu. Do ựó, ựiều cần thiết là phải tìm ra thời gian ựồng nuôi cấy thắch hợp cho từng giống cây cam quýt. Trong thắ nghiệm này, chúng tôi tiến hành ựồng nuôi cấy theo ba mức thời gian khác nhau (2 ngày, 3 ngày và 4 ngày). Sau thời gian ựồng nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển mẫu sang môi trường tái sinh chồi, rồi môi trường chọn lọc chứa 50 mg/l kanamycine. Trong quá trình này tiến hành theo dõi: Sự phát triển của khuẩn lạc, tỉ lệ mẫu tái sinh chồi, tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc. Kết quả ựược thể hiện ở bảng 4.3a, 4.3b, biểu ựồ 4.3a và 4.3b.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 56
Bảng 4.3a. Ảnh hưởng thời gian ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và khả năng sống sót trên môi trường
chọn lọc của quýt đường Canh
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường tái sinh
chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn
lọc Giống đồng nuôi cấy (ngày) Sự phát triển của khuẩn lạc Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) 2 + 72,0 72,0 11,0 11,0 3 ++ 63,0 63,0 17,6 17,6 iaaM- INO 4 +++ 30,0 30,0 11,3 11,3 CV% 4,3 LSD0,05 3,3 2 + 73,3 73,3 11,6 11,6 3 ++ 65,6 65,6 18,6 18,6 rolB-INO 4 +++ 38,3 38,3 12,0 12,0 CV% 4,6 LSD0,05 2,6
Bảng 4.3b. Ảnh hưởng thời gian ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tái sinh chồi và khả năng sống sót trên môi trường
chọn lọc của cam Vinh
Mẫu tái sinh chồi trên môi trường tái sinh
chồi
Mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn
lọc Giống đồng nuôi cấy (ngày) Sự phát triển của khuẩn lạc Số lượng (Mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) 2 + 67,0 67,0 8,6 8,6 3 ++ 57,6 57,6 16,3 16,3 iaaM-INO 4 +++ 39,0 39,0 12,0 12,0 CV% 4,0 LSD0,05 3,6 2 + 68,6 68,6 9,6 9,6 3 ++ 62,6 62,6 17,6 17,6 rolB-INO 4 +++ 30,3 30,3 10,3 10,3 CV% 4,6 LSD0,05 4,0
(+) Khuẩn lạc phát triển yếu, hình thành một lớp màng rất mỏng bao quanh mẫu. (++) Khuẩn lạc phát triển ở mức vừa phải, tạo thành lớp màng mỏng bao quanh mẫu (+++) Khuẩn lạc phát triển rất mạnh, tạo thành lớp màng dày bao quanh mẫu, thậm chắ còn có những khuẩn lạc phát triển quá mạnh phủ trùm kắn mẫu, gây chết mẫu ngay sau 4 ngày ựồng nuôi cấy
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 57
Biểu ựồ 4.3a. Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến tỷ lệ tái sinh chồi và tỷ lệ mẫu sống của quýt đường Canh trên môi trường chọn lọc
(từ trái qua phải gen INO-iaaM, INO-rolB)
Biểu ựồ 4.3b. Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến tỷ lệ tái sinh chồi và tỷ lệ mẫu sống của cam Vinh trên môi trường chọn lọc
(từ trái qua phải gen INO-iaaM, INO-rolB)
2 ngày 3 ngày 4 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 58 Từ kết quả thu ựược ở bảng 4.4a, 4.4b, biểu ựồ 4.4a và 4.4b cho thấy, khi tăng thời gian ựồng nuôi cấy từ 2 ngày lên 4 ngày ựã làm tăng sự phát triển của khuẩn lạc, nhưng lại làm giảm sức sống và khả năng tái sinh chồi của mẫu, từ ựó có ảnh hưởng ựến hiệu quả chuyển gen.
đồng nuôi cấy trong 2 ngày có ưu ựiểm là tỉ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất. đối với chuyển gen vào quýt đường Canh ựạt 72% (chuyển gen INO- iaaM), 73,3% (chuyển gen INO-rolB). đối với cam Vinh tỷ lệ tái sinh chồi ựạt 67,0% (ựối với chuyển gen INO-iaaM) và 68,6% (chuyển gen INO-rolB). Tuy nhiên ở ựồng nuôi cấy 2 ngày lại có tỉ lệ chồi còn sống trên môi trường chọn lọc khá thấp. đối với chuyển gen vào quýt đường Canh ựạt 11,0% (chuyển gen INO-iaaM), 12,0% (chuyển gen INO-rolB). đối với cam Vinh ựạt 8,6% (chuyển gen INO-iaaM) và 9,6% (chuyển gen INO-rolB). Nguyên nhân của hiện tượng này là do thời gian quá ngắn, số lượng vi khuẩn ựược sinh ra chưa ựủ lớn ựể có thể ảnh hưởng lớn ựến sức sống và khả năng tái sinh chồi của mẫu. đồng thời mật ựộ vi khuẩn cũng chưa ựạt ựến giá trị cực thuận cho hoạt ựộng chuyển gen.
Trái lại, ựồng nuôi cấy trong 4 ngày lại có tỉ lệ mẫu tái sinh chồi và tỉ lệ chồi còn sống trên môi trường chọn lọc thấp nhất. đối với chuyển gen vào quýt đường Canh lần lượt ựạt 30,0% và 11,3% (chuyển gen INO-iaaM), 38,3% và 12,0% (chuyển gen INO-rolB). đối với cam Vinh, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi, và sống sót trên môi trường chọn lọc lần lượt là 39,0% và 12% (chuyển gen INO- iaaM), 30,3 và 10,3% (chuyển gen INO-rolB). Nguyên nhân của hiện tượng này là vì thời gian ựồng nuôi cấy quá dài vi khuẩn phát triển quá mạnh, làm xuất hiện một số khuẩn lạc phủ kắn mẫu. Sự phát triển quá mạnh của vi khuẩn như vậy ựã làm giảm sức sống và khả năng tái sinh của mẫu, thậm chắ còn làm chết một số mẫu ngay sau giai ựoạn ựồng nuôi cấy. Ngoài ra nó còn gây khó khăn cho quá trình rửa và diệt khuẩn, dẫn ựến tăng hiện tượng mẫu bị tái nhiễm khuẩn nhiều lần và khi ựó tỉ lệ mẫu bị chết lại càng tăng cao.
Hiệu quả chuyển gen ựạt cao nhất khi ựồng nuôi cấy trong 3 ngày ựối với cả cam Vinh và quýt đường canh. đối với quýt đường Canh tỷ lệ mẫu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 59 chồi sống sót trên môi trường chọn lọc lần lượt là 16,3% (chuyển gen INO- iaaM) và 17,6% (chuyển gen INO-rolB). Với LSD 0,05%= 3,3 và 2,6 thì ựồng nuôi cấy ở 3 ngày cho hiệu quả biến nạp gen hơn hẳn 2 ngày và 4 ngày ở mức có ý nghĩ. Tương tự ựối với cam Vinh, tỷ lệ mẫu chồi sống sót trên môi trường chọn lọc là 16,3% (chuyển gen INO-iaaM) và 17,6% (chuyển gen
INO-rolB) với LSD0,05 lần lượt là 3,6 và 4,0. Nguyên nhân làm tăng hiệu
quả biến nạp gen là do với lượng thời gian 3 ngày vừa ựủ ựể vi khuẩn phát triển ựạt ựến ngưỡng cực thuận cho hoạt ựộng biến nạp gen, nhưng vẫn chưa quá lớn ựể có thể ảnh hưởng xấu ựến khả năng tái sinh chồi của mẫu.
Nhận xét: đồng nuôi cấy trong thời gian 3 ngày thu ựược tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc là cao nhất. Do ựó, ựồng nuôi cấy trong 3 ngày có thể là khoảng thời gian thắch hợp nhất cho hoạt ựộng biến nạp gen vào thân mầm giống cam Vinh thông qua Agrobacterium tumefaciens. đồng nuôi cấy trong 3 ngày ựược lựa chọn trong các thắ nghiệm tiếp theo.
Hình 4.4. Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến sự phát triển của khuẩn lạc.
A4- (2 ngày) Khuẩn lạc là lớp màng rất mỏng quanh mẫu. B4- (3 ngày) Khuẩn lạc là lớp mỏng bao quanh mẫu.
C4 và D4- (4 ngày) Khuẩn lạc lớn, có khi phủ trùm kắn mẫu và có mẫu bị chết.
A4 B4
D4 C4
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 60
Hình 4.5. Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến sự tái sinh chồi của mẫu (CV).
E4- (2 ngày) mẫu tái sinh chồi rất mạnh. G4- (3 ngày) mẫu tái sinh chồi khá H4- (4 ngày) mẫu tái sinh chồi yếu, có nhiều mẫu bị chết.