4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2. Bước ựầu thử nghiệm chuyển gen sinh và mẫn cảm auxin hoạt ựộng ựặc
ựặc thù bầu nhụy vào quýt đường Canh và cây cam Vinh thông qua
Agrobacterium tumerfacies
Từ kết quả thu ựược trong các thắ nghiệm nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào thân mầm của giống quýt đường Canh và cam Vinh ở phần 4.1 chúng tôi xây dựng quy trình chuyển gen sinh auxin INO-iaaM và mẫn cảm với auxin INO-rolB vào trụ trên lá mầm nhờ Agrobacterium
tumefaciens. Quy trình ựược tóm tắt qua sơ ựồ sau:
A4 B4
C4
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 65
Sơ ựồ tóm tắt các bước tiến hành trong quy trình chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB
vào thân mầm nhờ Agrobacterium tumefaciens
để ựánh giá hiệu quả quy trình chuyển gen xây dựng ựược, chúng tôi ựã tiến hành thắ nghiệm chuyển gen INO-iaaM và INO-rolB cho 300 ựoạn epicotyls (trụ trên lá mầm)/ mỗi gen/giống. Sau khi cho lây nhiễm khuẩn trong vòng 20Ỗ, tiến hành ựồng nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung chất kắch thắch (100 ộM AS + 2 mg/l NAA + 1mg/l BA), ựồng nuôi cấy ở 220C, trong 3 ngày. Tiếp ựến cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi và môi trường chọn lọc. Những mẫu chồi nào còn sống sót sau 2 tháng trên môi trường chọn lọc sẽ ựược kiểm tra gen GUS, bằng cách mỗi chồi cắt lấy một lá và ựem lá ựó ngâm ủ trong dung dịch ựệm có chứa chất X-Gluc. Kết quả ựược thể hiện ở bảng 4.5a và 4.5b.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 66
Bảng 4.5a. Kết quả ựánh giá khả năng tái sinh chồi, khả năng sống sót của các mẫu trên môi trường chọn lọc và tỉ lệ mẫu chồi có biểu hiện gen
GUS khi chuyển gen iaaM-INO và rolB-INO vào quýt đường Canh
Mẫu tái sinh chồi sau 2,5 tháng trên môi trường tái sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót sau 2 tháng trên môi
trường chọn lọc
Tỉ lệ mẫu chồi có biểu hiện mẫu xanh lam
của gen GUS Số lượng mẫu (mẫu) Số lượng (mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) Số lượng (mẫu chồi) Tỉ lệ (%) iaaM-INO 196 65,3 56 18,6 13 4,3 rolB-INO 220 73,3 61 20,3 17 5,6
Bảng 4.5b. Kết quả ựánh giá khả năng tái sinh chồi, khả năng sống sót của các mẫu trên môi trường chọn lọc và tỉ lệ mẫu chồi có biểu hiện gen
GUS khi chuyển gen iaaM-INO và rolB-INO vào cam Vinh
Mẫu tái sinh chồi sau 2,5 tháng trên môi trường tái sinh chồi
Mẫu chồi còn sống sót sau 2 tháng trên môi
trường chọn lọc
Tỉ lệ mẫu chồi có biểu hiện mẫu xanh lam
của gen GUS Số lượng mẫu (mẫu) Số lượng (mẫu) Tỉ lệ (%) Số lượng (chồi) Tỉ lệ (%) Số lượng (mẫu chồi) Tỉ lệ (%) iaaM-INO 183 61,0 52 17,3 12 4,0 rolB-INO 198 66,0 59 19,6 14 4,6
đối với chuyển gen vào quýt đường Canh, từ 300 mẫu biến nạp mỗi gen ựã thu ựược 56 (chuyển gen INO-iaaM) và 61(chuyển gen INO-rolB) mẫu chồi còn sống sót sau 2 tháng trên môi trường chọn lọc, chiếm lần lượt 18,6% và 20,3%. Tuy nhiên chỉ có 13 mẫu chồi (chuyển gen INO-iaaM) và 17 mẫu chồi (chuyển gen INo-rolB) có biểu hiện màu xanh lam ựặc trưng của gen GUS chiếm lần lượt 4,3% và 5,6%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 67 đối với cam Vinh, từ 300 mẫu biến nạp mỗi gen thu ựược 52 chồi (chuyển gen INO-iaaM) và 59 mẫu chồi (chuyển gen INO-rolB) sống sót trên môi trường chọn lọc, chiếm lần lượt là 17,3 và 19,6%. Trong số ựó chỉ có 12 mẫu chồi (chuyển gen INO-iaaM) và 14 mẫu chồi (chuyển gen INO-rolB) có biểu hiện gen GUS, chiếm lần lượt là 4,0% và 4,6%.
Qua ựây chúng tôi khẳng ựịnh rằng quy trình chuyển gen sinh auxin
INO-iaaM và mẫn cảm với auxin INO-rolB hoạt ựộng ựặc thù bầu nhụy vào
trụ trên lá mầm (epycotyl) của hai giống quýt đường Canh và cam Vinh nhờ
Agrobacterium tumefaciens ựạt tỷ lệ chuyển gen thành công là 4,3% (chuyển
gen INO-iaaM), 5,3% (chuyển gen INO-rolB) trên ựối tượng là quýt đường
Canh. 4,0% (chuyển gen INO-iaaM) và 4,6% (chuyển gen INO-rolB) trên ựối tượng là Cam Vinh. Những mẫu chồi nào có biểu hiện GUS+ sẽ ựược chuyển sang môi trường kéo dài chồi và tái sinh rễ hoặc vi ghép ựể tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh.
Kết quả này cũng tương tự với kết quả nghiên cứu của Yu et al (2002)
trên giống Xuegan. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen mà chúng tôi thu ựược vẫn còn thấp hơn so với các kết quả nghiên cứu trên thế giới như: hiệu quả biến nạp gen của giống cam ngọt Bingtan là 10% (Duan, 2006), giống cam ngọt Natal là 11,6%, giống cam ngọt Valencia là 13,8% và giống Rangpur lime là 19,3% (Ameilida, 2003), giống cam ngọt Valencia là 23,8%
(Boscariol, 2003).
đối chiếu kết quả thu ựược ở bảng 4.5a và 4.5b của quy trình chuyển gen ựã ựược tối ưu hóa với các kết quả thu ựược ở các thắ nghiệm tối ưu hóa phần 4.1 cho thấy, tỉ lệ mẫu chồi còn sống sót sau 2 tháng trên môi trường chọn lọc có chứa 50mg/l kanamycine của của quy trình chuyển gen ựã ựược tối ưu hóa là cao nhất (tỉ lệ chồi còn sống sót trên môi trường chọn lọc của các thắ nghiệm 4.1.1, 4.1.2, 4.1.3 và 4.1.4 khi chưa ựược tối ưu hóa thấp hơn so với ựiều kiện ựã ựược tối ưu hóa. Do ựó, hiệu quả biến nạp gen thu ựược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 68 trong quy trình ựã ựược tối ưu hóa là cao nhất. Có thể giải thắch kết quả này là do các chất bổ sung vào môi trường ựồng nuôi cấy như acetosyringone (100ộM) và NAA (2mg/l) ựã có tác dụng tăng hiệu quả chuyển gen, ựồng nuôi cấy ở nhiệt ựộ 220C và trong thời gian 3 ngày là thắch hợp nhất cho chuyển gen. Vì vậy, có thể khẳng ựịnh xây dựng thành công quy trình chuyển gen sinh và mẫn cảm với auxin vào trụ trên lá mầm cây quýt đường Canh và cam Vinh nhờ Agrobacterium tumefaciens.
Hình 4.7. Mẫu chồi sống sót trên môi trường chọn lọc chuyển gen sinh và mẫn cảm với auxin vào trụ trên lá mầm giống quýt đường Canh
Hình 4.8. Mẫu chồi sống sót trên môi trường chọn lọc chuyển gen sinh và mẫn cảm với auxin vào trụ trên lá mầm giống cam Vinh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 69
Hình 4.9. Mẫu chồi bị chết trên môi trường chọn lọc chứa 50 mg/lắt kanamycine
Hừnh 4.10. Cịc mục ệé biÓu hiỷn gen GUS ẻ lị (GUS-
GUS+), phờn ịnh tử
lỷ giọa tạ bộo khềng nhẺn ệ−ĩc gen biạn nỰp/ tạ bộo nhẺn ệ−ĩc gen biạn nỰp.
Hình 4.11. Ảnh 15 lá (từ 15 chồi) nhuộm màu xanh lam ựặc trưng của gen GUS thu ựược khi biến nạp 300 mẫu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 70