Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây sâm đất côn đảo (parietaria debilis g forst , urticaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒNG QUỐC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY SÂM ĐẤT CƠN ĐẢO (Parietaria debilis G Forst., Urticaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒNG QUỐC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY SÂM ĐẤT CÔN ĐẢO (Parietaria debilis G Forst., Urticaceae) Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan thực vật học 2.1.1 Hệ thống phân loại họ Gai, chi Parietaria 2.1.2 Đặc điểm hình thái họ Gai (Urticaceae) .2 2.2 Tổng quan thành phần hóa học họ Gai (Urticaceae) 2.3 Tổng quan tác dụng dược lý họ Gai (Urticaceae) .7 2.3.1 Tác dụng độc tế bào chống ung thư .7 2.3.2 Tác dụng kháng khuẩn kháng nấm .8 2.3.3 Tác dụng chống BPH (tăng sinh tuyến tiền liệt lành tính) 2.3.4 Tác dụng chống HIV 2.3.5 Tác dụng chống đái tháo đường hạ lipid huyết 10 2.3.6 Hoạt tính ức chế 5α-reductase kích thích mọc tóc 10 2.3.7 Tác dụng chống oxy hóa 10 2.4 Tổng quan oxy hóa phương pháp sàng lọc khả chống oxy hóa .10 2.4.1 Tổng quan chất chống oxy hóa 10 i 2.4.2 Một số phương pháp sàng lọc khả chống oxy hóa 12 2.5 Tổng quan ung thư phương pháp tiến hành sàng lọc tác dụng độc tế bào .13 2.5.1 Tổng quan ung thư .13 2.5.2 Một số phương pháp tiến hành sàng lọc tác dụng độc tế bào 13 2.6 Viêm phương pháp sàng lọc tác dụng kháng viêm 14 2.6.1 Phương pháp ức chế biến tính albumin 15 2.6.2 Mơ hình sàng lọc hợp chất kháng viêm tế bào macrophage RAW 264.7 kích thích lipopolysaccharid (LPS) 15 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 3.1 Đối tượng nghiên cứu 15 3.1.1 Nguyên vật liệu .15 3.1.2 Dung mơi hóa chất 16 3.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị .16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.2.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật 17 3.2.2 Thử tinh khiết 17 3.2.3 Phân tích thành phần hóa học rễ Sâm đất Côn đảo .18 3.2.4 Khảo sát hoạt tính sinh học in vitro 20 3.2.5 Khảo sát hoạt tính sinh học in vivo 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 4.1 Khảo sát hình thái 28 4.1.1 Đặc điểm hình thái 28 4.1.2 Khảo sát vi học 30 ii 4.2 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật rễ Sâm đất Côn đảo 37 4.3 Thử tinh khiết 38 4.3.1 Xác định độ ẩm .38 4.3.2 Xác định độ tro 38 4.3.3 Xác định hàm lượng chất chiết 39 4.4 Kết chiết xuất phân lập .39 4.4.1 Quy trình chiết xuất tách phân đoạn cao rễ Sâm đất Côn đảo 39 4.4.2 Phân lập hợp chất tinh khiết từ tủa C 41 4.4.3 Phân lập hợp chất tinh khiết từ tủa EA 43 4.4.4 Phân tách phân đoạn cao DCM sắc ký cột mở .44 4.4.5 Phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn D8 47 4.5 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 48 4.5.1 Hợp chất C12 48 4.5.2 Hợp chất C14 51 4.5.3 Hợp chất EA21 54 4.5.4 Hợp chất D862 56 4.6 Khảo sát tác dụng sinh học cao chiết rễ Sâm đất Côn đảo in vitro .60 4.6.1 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa 60 4.6.2 Kết thử hoạt tính sinh học gây độc tế bào 61 4.6.3 Kết thử hoạt tính sinh học kháng viêm 62 4.7 Kết hoạt tính sinh học in vivo 63 4.7.1 Độc tính cấp đường uống 63 4.7.2 Kết thử tác dụng tăng lực 64 iii Chương BÀN LUẬN 66 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 Phụ lục 74 Phổ MS Phổ NMR Số liệu thử sinh học .42 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ tắt 13 C-NMR Chữ nguyên 13 C-Nuclear magnetic resonance 1 br d DCM DĐVN DEPT 10 11 12 13 14 DMSO DPPH COSY EtOAc EtOH HMBC HSQC 15 16 HTCO IC50 17 18 19 20 21 22 J m MeOH MHz MS MTT 23 NOESY 24 NSAIDs 25 26 27 28 29 30 31 32 ppm s SKLM t TT UCBT UV-Vis VS H-NMR H-Nuclear magnetic resonance Broad Doublet Dicloromethan Dược điển Việt Nam Distortionless enhancement by polarization transfer Dimethyl sulfoxide 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Correlation spectroscopy Ethyl acetat Ethanol Heteronuclear multiple bond correlation Heteronuclear single quantum coherence Hoạt tính chống oxy hóa Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% Coupling constant Hằng số ghép Multiplet Nhiều đỉnh Methanol Mega hertz Mass spectroscopy Phổ khối lượng 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide Nuclear Overhauser enhancement spectroscopy Non-steroidal anti-inflammatory drug Thuốc chống viêm không steroid Parts per million Phần triệu Singlet Đỉnh đơn Sắc ký lớp mỏng Triplet Đỉnh ba Thuốc thử Ức chế biến tính Ultraviolet and visible Vanillin-acid sulfuric v Ý nghĩa Cộng hưởng từ hạt nhân C13 Cộng hưởng từ hạt nhân proton Đỉnh rộng Đỉnh đôi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Những hợp chất phân lập loài thuộc họ Urticaceae Bảng 3.1 Cách pha mẫu đo phương pháp DPPH .21 Bảng 3.2 Cách pha mẫu thử nghiệm phương pháp MTT 22 Bảng 3.3 Cách pha mẫu đo phương pháp ức chế biến tính albumin 24 Bảng 4.1 Kết phân tích sơ hóa thực vật bột rễ Sâm đất Côn đảo 37 Bảng 4.2 Độ ẩm bột rễ sâm đất Côn đảo 38 Bảng 4.3 Tro toàn phần bột rễ Sâm đất Côn đảo 39 Bảng 4.4 Hàm lượng chất chiết 39 Bảng 4.5 Độ ẩm cao EtOH tổng rễ Sâm đất Côn đảo 40 Bảng 4.6 Bảng so sánh liệu phổ NMR C12 (CDCl3-d) với friedelin (CDCl3d) 49 Bảng 4.7 Bảng so sánh liệu phổ NMR C14 (CDCl3-d) với 3-friedelanol (MeOD-d4) 52 Bảng 4.8 Bảng so sánh liệu phổ daucosterol (DMSO-d6) EA21 (DMSOd6) 55 Bảng 4.9 Bảng so sánh liệu phổ NMR D862 (MeOD-d4) với Pouzolignan G (MeOD-d4) 58 Bảng 4.10 Giá trị IC50 cao EtOH tổng cao phân đoạn 60 Bảng 4.11 Hoạt tính gây độc tế bào cao Hep-G2 62 Bảng 4.12 Giá trị IC50 hoạt tính kháng viêm cao EtOH tổng cao phân đoạn 62 Bảng 4.13 Kết khảo sát độc tính cấp đường uống cao EtOH tổng rễ Sâm đất Côn đảo .63 vi Bảng 4.14 Kết khảo sát tác dụng tăng lực cao EtOH tổng rễ Sâm đất Côn đảo 64 Bảng 4.15 Kết khảo sát tác dụng tăng lực cao EtOH tổng rễ Sâm đất Côn đảo .64 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Vị trí phân loại họ Gai, chi Parietaria hệ thống thực vật Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất thu phân đoạn cao Sâm đất Cơn đảo .19 Hình 4.1 1-2 Cây Sâm đất Cơn đảo; Rễ củ 28 Hình 4.2 Sâm đất Cơn đảo Cách xếp lá; 2-3 Kích thước hình dạng lá; Lá kèm 29 Hình 4.3 Sâm đất Côn đảo Cụm hoa; Hoa cái; Hoa đực; Bao phấn; Quả dính đài; Quả 30 Hình 4.4 Vi phẫu cuống Sâm đất Côn đảo Tổng quát; Sơ đồ; Vi phẫu chi tiết 31 Hình 4.5 Lỗ khí kiểu hỗn bào Biểu bì mang lơng che chở 32 Hình 4.6 Vi phẫu Sâm đất Côn đảo Tổng quát; Sơ đồ; Vi phẫu chi tiết; Mô mềm giậu 33 Hình 4.7 Vi phẫu thân Sâm đất Côn đảo Tổng quát; Sơ đồ; Vi phẫu chi tiết; Tế bào hóa mơ cứng 34 Hình 4.8 Vi phẫu rễ Sâm đất Cơn đảo Tổng quát; Sơ đồ; Bần; Gỗ 2; Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai 35 Hình 4.9 Các cấu tử bột thân Sâm đất Côn đảo Lông che chở đơn bào hình móc câu; Lơng che chở đơn bào có gai; Mạch mạng; Mạch xoắn; Khối nhựa màu vàng; Mảnh biểu bì; Mảnh biểu bì mang lơng che chở 36 Hình 4.10 Các cấu tử bột rễ Sâm đất Côn đảo Mảnh bần; Mạch mạng; Khối nhựa màu vàng; 4-5 Tinh bột; Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai .36 Hình 4.11 Quy trình chiết phân tách phân đoạn bột rễ Sâm đất Côn đảo 40 Hình 4.12 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C12 C14 hệ dung môi DCM 100% n-hexan - EtOAc (4 : 1) Phát thuốc thử VS 42 viii Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 58 Phổ HSQC D862 PL 30 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 59 Phổ HSQC D862, vùng 1,6 – 4,3 ppm PL 31 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 60 Phổ HSQC D862, vùng 5,8 – 7,3 ppm PL 32 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 61 Phổ HMBC D862 PL 33 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 62 Phổ HMBC D862, vùng 5,6 – 7,2 ppm PL 34 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 63 Phổ HMBC D862, vùng 1,7 – 4,2 ppm PL 35 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 64 Phổ COSY D862 PL 36 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 65 Phổ COSY D862, vùng 2,6 – 4,5 ppm PL 37 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 66 Phổ COSY D862, vùng 5,6 – 7,4 ppm PL 38 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 67 Phổ NOESY D862, vùng 6,0– 7,1 ppm PL 39 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 68 Phổ NOESY D862, vùng 2,7– 4,3 ppm PL 40 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 69 Phổ NOESY D862, vùng 5,4– 7,4 ppm PL 41 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Số liệu thử sinh học Cao DCM OD trung bình HTCO (%) 2,5 10 20 30 40 50 70 200 250 300 400 500 600 125 150 250 300 400 500 2,5 10,6 21,2 31,8 42,4 53,0 79,5 206,0 257,5 309,0 412,0 515,0 618,0 118,8 142,5 237,5 285,0 380,0 475,0 1,048 0,923 0,769 0,550 0,365 0,080 1,062 0,871 0,655 0,585 0,354 0,114 0,977 0,878 0,802 0,643 0,504 0,402 0,895 0,852 0,694 0,612 0,452 0,345 15,35 25,44 37,88 55,57 70,52 93,54 14,22 29,64 47,09 52,75 71,41 90,79 21,08 29,08 35,22 48,06 59,29 67,53 27,71 31,18 43,94 50,57 63,49 72,13 Mẫu thử Cao EtOAc Nồng độ thực tế (µg/ml) Cao n-butanol Nồng độ dự kiến (µg/ml) Cao nước Cao n-hexan Cao EtOH tổng Acid ascorbic Mẫu thử Nồng độ dự kiến (µg/ml) Nồng độ thực tế (µg/ml) OD trung bình HTCO (%) 10 15 20 25 30 35 40 50 75 100 125 150 600 700 800 1000 1200 1500 9,6 14,4 19,2 24,0 28,8 33,6 39,2 49,0 73,5 98,0 122,5 147,0 696 812 928 1160 1492 1740 1,034 0,876 0,765 0,550 0,403 0,322 0,882 0,801 0,599 0,401 0,283 0,151 0,851 0,759 0,717 0,607 0,462 0,317 16,48 29,24 38,21 55,57 67,45 73,99 28,76 35,30 51,62 67,61 77,14 87,80 31,26 38,69 42,08 50,97 62,68 74,39 Phụ lục 70 Thơng số thử hoạt tính quét gốc tự DPPH PL 42 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Cao n-hexan Mẫu trắng OD trước biến tính 0,001 OD sau biến tính 0,082 10 15 25 50 0,001 0,001 0,001 0,001 0,062 0,052 0,031 0,007 50,27 58,02 75,40 94,65 50 0,014 0,104 27,88 100 125 250 300 0,024 0,030 0,047 0,071 0,078 0,063 0,072 0,082 56,84 73,19 79,89 90,88 3,125 0,004 0,128 0,27 6,25 12,5 25 50 0,005 0,007 0,014 0,040 0,108 0,048 0,038 0,041 17,16 67,29 80,43 99,46 0,001 0,125 UCBT (%) Mẫu thử 34,22 Cao DCM Nồng độ (µg/ml) Cao EtOAc Cao EtOH tổng Diclofenac natri Mẫu thử 3,125 OD trước biến tính 0,133 OD sau biến tính 0,131 6,25 12,5 25 50 0,125 0,081 0,074 0,077 0,123 0,084 0,074 0,077 6,70 43,70 65,15 97,86 25 0,009 0,094 31,37 50 100 125 150 0,011 0,015 0,019 0,023 0,083 0,058 0,048 0,042 41,82 65,68 76,68 84,72 Nồng độ (µg/ml) Phụ lục 71 Thơng số thử hoạt tính kháng viêm Phụ lục 72 Dữ liệu thử tác dụng tăng lực lô chứng PL 43 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn UCBT (%) 0,27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 73 Dữ liệu thử tác dụng tăng lực lô thử (liều 0,68 g/kg) Phụ lục 74 Dữ liệu thử tác dụng tăng lực lô thử (liều 1,36 g/kg) PL 44 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒNG QUỐC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY SÂM ĐẤT CƠN ĐẢO (Parietaria debilis G Forst. , Urticaceae). .. Nam, vài năm g? ??n đây, người dân Côn Đảo có xu hướng sử dụng rễ củ Sâm đất Côn Đảo loại Nhân Sâm giúp tăng cường, cải thiện sức khỏe phòng chống bệnh tật Mặc dù nghiên cứu nước chưa có thực trạng... thu? ?, g? ??m (3) cánh không nhau, g? ??n Đài thường mỏng, có lơng mặt ngồi, thường lớn lên bao xung quanh Bầu thường hình trứng, nhẵn có lơng, bầu ? ?, có nỗn, nỗn đính g? ??c, bầu thượng Vịi nhuỵ ngắn