- Chuẩn bị mẫu hạt bụng để phõn tớch HPLC: Hạt bụng của cỏc giống nghiờn cứu được tỏch loại vỏ, phần nhõn được nghiền thành bột đồng nhất bằng
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phõn lập gossypol từ hạt bụng
3.4. Tỏc dụng gõy độc của gossypol trờn tế bào ung thư
Cỏc sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol được chỳng tụi nghiờn cứu tỏc dụng ức chế sự sinh trưởng hay gõy độc trờn cỏc dũng tế bào ung thư người bằng phương phỏp MTT. Thử nghiệm này được chỳng tụi sử dụng để đỏnh giỏ tỏc dụng gõy độc tế bào của cỏc chất tinh khiết điều chế được, so sỏnh tỏc
dũng tế bào được chỳng tụi lựa chọn nghiờn cứu là cỏc dũng tế bào đại diện cho cỏc loại ung thư phổ biến ở Việt Nam như ung thư vỳ (MCF-7), ung thư phổi (LU- 1) và ung thư gan (Hep-G2). Cỏc thử nghiệm được tiến hành song song với mẫu đối chứng khụng cú thuốc thử và mẫu đối chứng dương vincristine ở cỏc nồng độ từ 0,1 nM đến 500 nM sau 72 h trờn 3 dũng tế bào MCF-7, LU-1 và Hep-G2 thu được cỏc giỏ trị IC50 tương ứng là 80,4 nM, 93,1 nM và 5,0 nM.
3.4.1. Tỏc dụng của (±)-gossypol, (+)-gossypol và (-)-gossypol trờn dũng tế bào ung thư vỳ MCF-7 bào ung thư vỳ MCF-7
(±)-Gossypol và (-)-gossypol được thử ở cỏc nồng độ từ 0,5 đến 30 àM, (+)- gossypol được thử tại cỏc nồng độ từ 0,5 àM đến 60 àM trờn dũng tế bào ung thư vỳ MCF-7 sau 72 h. Kết quả cho thấy (±)-gossypol và (-)-gossypol đều cú tỏc dụng gõy độc trờn dũng tế bào ung thư vỳ MCF-7 phụ thuộc theo liều trong khoảng nồng độ đó thử (Hỡnh 3.15). (±)-Gossypol và (-)-gossypol cú tỏc dụng ức chế mạnh với IC50 lần lượt là 6,2 và 4,0 àM. Ngược lại, khi cỏc tế bào MCF-7 được xử lý với (+)-gossypol tại cỏc nồng độ 10 và 20 àM, khụng quan sỏt thấy sự ức chế quỏ trỡnh sinh trưởng của tế bào sau 72 h. Giỏ trị IC50 của (+)-gossypol trờn dũng tế bào MCF-7 sau 72 giờ là 30,2 àM. Kết quả này cho thấy (-)-gossypol cú tỏc dụng gõy độc tế bào mạnh hơn (±)- gossypol khoảng 1,5 lần và mạnh hơn (+)-gossypol khoảng 7 lần.
Đối chứng (-)-Gossypol 10àM
(-)-Gossypol 20 àM (-)-Gossypol 30àM
Hỡnh 3.16. Tế bào MCF-7 khi khụng xử lý (đối chứng) và xử lý với (-)-gossypol ở cỏc nồng độ 10 àM, 20 àM, 30 àM sau 72 h.
3.4.2. Tỏc dụng của (±)-gossypol, (+)-gossypol và (-)-gossypol trờn dũng tế bào ung thư phổi LU-1 bào ung thư phổi LU-1
Để đỏnh giỏ tỏc dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trờn khả năng sống sút của cỏc tế bào ung thư phổi LU-1, cỏc tế bào LU-1 được xử lý với (±)-gossypol, (-)-gossypol ở cỏc nồng độ khỏc nhau từ 0,5 đến 30 àM và với (+)- gossypol ở cỏc nồng độ từ 0,5 đến 60 àM sau 72 h (Hỡnh 3.17). Phộp thử MTT cho thấy, (±)-gossypol, (-)-gossypol đều cú tỏc dụng ức chế sự tăng sinh tế bào LU-1 phụ thuộc theo liều trong khoảng nồng độ đó thử. Ngược lại, cỏc tế bào LU- 1 lại kộm nhạy cảm hơn đối với (+)-gossypol. Dưới nồng độ 20 àM, khụng quan sỏt thấy sự ức chế tăng sinh của (+)-gossypol trờn dũng tế bào LU-1 sau 72 h. (±)- Gossypol và (-)-gossypol cú tỏc dụng ức chế mạnh với IC50 lần lượt là 8,7 và 4,3
30,3 àM. Như vậy, (-)-gossypol cú tỏc dụng gõy độc trờn dũng tế bào LU-1 mạnh hơn (±)-gossypol và (+)-gossypol lần lượt là khoảng 2 và 7 lần.
Hỡnh 3.17. Tỏc dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trờn dũng tế bào LU-1 sau 72 h.
Đối chứng (-)-Gossypol 10 àM
(-)-Gossypol 20 àM (-)-Gossypol 30 àM
3.4.3. Tỏc dụng của (±)-gossypol, (+)-gossypol và (-)-gossypol trờn dũng tế bào ung thư gan Hep-G2 bào ung thư gan Hep-G2
(±)-Gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol cũng được thử trờn dũng tế bào ung thư gan Hep-G2 sau 72 h ở cỏc nồng độ tương ứng từ 0,5-30 àM (đối với (±)- gossypol và (-)-gossypol ) và 0,5 đến 60 àM (đối với (+)-gossypol) thụng qua phộp phõn tớch MTT (Hỡnh 3.19). Kết quả của chỳng tụi cho thấy (±)-gossypol và (-)-gossypol cú tỏc dụng ức chế sự tăng sinh tế bào phụ thuộc theo liều trong khoảng nồng độ đó thử với cỏc giỏ trị IC50 lần lượt là 8,8 àM và 4,5 àM. Trong khi đú, ở khoảng nồng độ 0,5-10 àM, chỳng tụi khụng quan sỏt thấy sự ức chế của (+)-gossypol trờn dũng tế bào Hep-G2 sau 72 h. Ngược lại, trong khoảng nồng độ từ 10-60 àM, tỏc dụng ức chế của (+)-gossypol là phụ thuộc theo liều. Giỏ trị IC50
của (+)-gossypol trờn dũng tế bào Hep-G2 được xỏc định là 32,1 àM sau 72 h.
Hỡnh 3.19. Tỏc dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trờn dũng tế bào Hep-G2 sau 72 h.
Đối chứng (±)-gossypol 10 àM
(-)-gossypol 10 àM (+)-gossypol 10 àM
Hỡnh 3.20. Sự phỏt triển của tế bào Hep-G2 khi khụng xử lý (đối chứng) và xử lý với (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol tại nồng độ 10 àM sau 72 h
Nhận xột chung:
Bảng 3.4. Giỏ trị IC50 của (±)-, (+)- và (-)-gossypol trờn cỏc dũng tế bào ung thư người
Chất nghiờn cứu
Dũng tế bào ung thư
MCF-7 LU-1 Hep-G2
(±)-Gossypol 6,2 ± 1,2 àM 8,7 ± 1,3 àM 8,8 ± 1,1 àM
(-)-Gossypol 4,0 ± 0,3 àM 4,3 ± 0.9 àM 4,5 ± 0,8 àM
(+)-Gossyol 30,2 ± 1,9 àM 30,3 ± 2,7 àM 32,1 ± 3,2 àM
Vincristine 80,4 ± 3,7 nM 93,1 ± nM 5,0 ± 1,2 nM
Kết quả phõn tớch MTT cho thấy (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol đều cú tỏc dụng ức chế sự phỏt triển của cả 3 dũng tế bào nghiờn cứu là MCF-7, LU-1 và Hep-G2. Trong đú với giỏ trị IC50 > 30 àM, (+)-gossyol được xem như cú tỏc dụng ức chế yếu 3 dũng tế bào ung thư đó thử in vitro. (-)-Gossypol ức chế manh nhất sự phỏt triển của cả 3 dũng tế bào nghiờn cứu, tỏc dụng này gấp từ 1,5 đến 2 lần so với (±)-gossypol và gấp từ 7-7,5 lần so với (+)-gossypol.
Trờn thế giới, tỏc dụng chống ung thư của gossypol đó được chứng minh trờn nhiều dũng tế bào ung thư khỏc nhau cả in vitro và in vivo. Trờn dũng MCF-7, IC50
của (±)-gossypol trong khoảng 3,4-24 àM [7, 24, 66]. Trờn một dũng tế bào ung thư vỳ khỏc là T47-D, Benz và cộng sự đó cho thấy IC50 của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol lần lượt là 5,3; 3,1 và 20 àM. Như vậy (-)-gossypol cú tỏc dụng ức chế gấp khoảng 1,7 lần và 6,6 lần so với (±)-gossypol và (-)-gossypol. Chưa thấy cụng trỡnh nghiờn cứu nào cụng bố về tỏc dụng của gossypol và cỏc đồng phõn quang học của nú trờn dũng tế bào ung thư phổi LU-1. Tuy nhiờn, trờn dũng tế bào ung thư phổi H69, Shelley và cộng sự cho thấy (-)-gossypol cú tỏc dụng ức chế sự phỏt triển của tế bào gấp 1,5 lần so với (±)-gossypol và 2,5 lần so với (+)-gossypol [50]. Như vậy, tỏc dụng gõy độc trờn cỏc dũng tế bào ung thư vỳ và phổi của cỏc sản phẩm gossypol mà chỳng tụi phõn lập được khỏ phự hợp với cỏc cụng bố trước đõy trờn thế giới. Trờn dũng tế bào ung thư gan, chỳng tụi khụng tỡm thấy tài liệu nào cụng bố về tỏc dụng của gossypol trờn loại tế bào ung thư này.
Với kết quả này, chỳng tụi cho rằng, (-)-gossypol cú thể là một đối tượng đỏng được nghiờn cứu kỹ hơn để phỏt triển thành thuốc chữa ung thư ở Việt Nam.
KẾT LUẬN
Chỳng tụi đó đạt được một số kết quả sau trong quỏ trỡnh thực hiện luận văn: 1. Đó nghiờn cứu thành cụng quy trỡnh chiết xuất và tinh chế gossypol từ hạt
bụng Gossypol barbadense L., quy trỡnh đơn giản, sử dụng ớt dung mụi, sản phẩm cú độ tinh khiết cao (>98%), đạt hiệu suất 0,32% trờn giống HD139 và HD208, 0,28% trờn giống HD108.
2. Đó tỏch thành cụng đồng phõn quang học (-)-gossypol và (+)-gossypol thụng qua tạo bazơ Schiff của (±)-gossypol với L-phenylalaninol và sử dụng sắc ký cột. Sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol cú độ tinh khiết cao, hiệu suất phõn tỏch tương ứng là 82,1% và 66,7%.
3. Đỏnh giỏ được tỷ lệ đồng phõn (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt bụng của 4 giống bụng thuộc loài G. barbadense L. và 1 giống bụng thuộc loài G. hirsutum bằng phương phỏp HPLC, trong đú HD208 là giống cú tỷ lệ đồng phõn (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt là cao nhất (57,8: 42,2), và VN01-2 là giống cú tỷ lệ này là thấp nhất (39,7 : 60,3).
4. Đó tiến hành thử độc tớnh tế bào bằng phương phỏp MTT (MTT assay) của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trờn 3 dũng tế bào ung thư người. Trong đú, đồng phõn (-)-gossypol cú tỏc dụng độc tế bào mạnh nhất trờn cả 3 dũng tế bào ung thư là ung thư vỳ (MCF-7, IC50 = 4,0 àM), ung thư phổi (LU- 1, IC50 = 4,3 àM) và ung thư gan (Hep-G2, IC50 = 4,5 àM).
KIẾN NGHỊ
1. Nghiờn cứu quy trỡnh tỏch (-)-gossypol-L-phenylalalinol dienamine từ hỗn hợp (±)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và tinh chế (-)-gossypol sau quỏ trỡnh thủy phõn base Schiff tương ứng bằng phương phỏp kết tinh.
2. Nghiờn cứu sử dụng đồng phõn (+)-gossypol bằng cỏch racemic húa cỏc dẫn xuất của nú.
3. Nghiờn cứu tỏc dụng phối hợp của (-)-gossypol với một số thuốc húa trị liệu đang được sử dụng trờn lõm sàng hiện nay.
4. Nghiờn cứu cơ chế tỏc dụng sinh học của (-)-gossypol
5. Nghiờn cứu tỏc dung chống ung thư của (-)-gossypol in vivo, độc tớnh cấp và độc tớnh bỏn trường diễn.