- Cỏc húa chất và dung mụi dựng cho tổng hợp, tinh chế, đo cỏc loại phổ và thử độc tớnh tế bào (MTT assay) được mua của hóng Merck hoặc Sigma.
2.2.5.3.Điều chế (-)-gossypol và (+)-gossypol
(-)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine (0,315 g; 0,40 mmol) được đưa vào bỡnh cầu dung tớch 25 ml. Thờm vào đú lần lượt 15 ml DEE, 3 ml acetic acid và 0,5 ml HCl đặc (37%). Hỗn hợp này được đun hồi lưu trong điều kiện trỏnh ỏnh sỏng và trong mụi trường khớ nitơ. Theo dừi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung mụi khai triển là n-hexan/EtOAc = 5/5. Sau khi phản ứng kết thỳc (chất đầu phản ứng hết), hỗn hợp này được làm nguội về nhiệt độ phũng, chuyển vào bỡnh chiết quả lờ và chiết loại tạp chất bằng nước cất. Quỏ trỡnh chiết này được lặp lại 3 lần (cho đến khi pH = 7). Pha nước sau đú được gộp và chiết lại bằng DEE. Cỏc phõn đoạn DEE được gộp lại và làm khan bằng Na2SO4 khan, cất loại dung mụi bằng mỏy cất quay dưới ỏp suất giảm. Sản phẩm thụ chứa (-)- gossypol được tinh chế bằng sắc ký cột.
Sử dụng sắc ký cột để tinh chế (-)-gossypol, chất hấp phụ là silica gel pha thường (cỡ hạt 0,04-0,063 mm) với khối lượng silica gel sử dụng gấp 30 lần khối lượng mẫu cần tinh chế. Sử dụng hệ dung mụi rửa giải là hỗn hợp n- hexan/EtOAc/acetic acid cú độ phõn cực tăng dần (100/0/1 – 80/20/1).
Quỏ trỡnh chạy cột được theo dừi bằng SKLM với bản mỏng trỏng sẵn GF254
(Merck), khai triển bằng hệ dung mụi: n-hexan/EtOAc/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20% trong EtOH sau đú đốt trờn bếp điện.
Cỏc phõn đoạn chứa (-)-gossypol sạch (1 vết trờn SKLM) được gộp lại, thu hồi dung mụi dưới ỏp suất giảm và cú thể kết tinh lại dưới dạng G-AA trong hỗn hợp DEE/acetic acid băng. Sản phẩm (-)-gossypol hoặc sản phẩm (-)-G-AA sau khi kết tinh được sấy trong tủ sấy chõn khụng 24 h và bảo quản ở nhiệt độ -18ºC.
Quỏ trỡnh điều chế (+)-gossypol từ (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được tiến hành tương tự như với (-)-gossypol.
Sản phẩm (+)-gossypol, (-)-gossypol đó qua tinh chế được khẳng định cấu trỳc bằng phương phỏp phổ tử ngoại, MNR, phổ khối, xỏc định gúc quay cực, điểm chảy, xỏc định độ tinh sạch bằng HPLC.
2.2.6. Phương phỏp HPLC đỏnh giỏ độ tinh sạch của sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol (-)-gossypol và (+)-gossypol
Cỏc mẫu (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol được hũa tan trong dung mụi acetonitrile, lọc qua màng lọc 0,45àM, hũa loàng đến nồng độ thớch hợp sau đú được chuyển vào trong mỏy phõn tớch HPLC
Điều kiện phõn tớch HPLC như sau: Mỏy sắc ký lỏng cao ỏp của hóng Agilent 1200 (Mỹ), cột sắc ký Inertsil ODS-3 (C18), cỡ hạt 5 àm (Nhật), kớch thước cột 4,6 x 250 mm. Quỏ trỡnh dũ được thực hiện bằng detector UV khoảng bước súng 220-500 nm. Pha động là hỗn hợp 85/15 của acetonitrile và đệm phosphate pH = 3 (10 mM KH2PO4, sau đú chỉnh về pH = 3 bằng H3PO4 đậm đặc). Tốc độ dũng
được điều chỉnh ở 1 ml/phỳt. Thời gian chạy là 12 phỳt. Quỏ trỡnh sắc ký được theo dừi bằng phổ tử ngoại ở bước súng 254 nm và 365 nm.