- Chuẩn bị mẫu hạt bụng để phõn tớch HPLC: Hạt bụng của cỏc giống nghiờn cứu được tỏch loại vỏ, phần nhõn được nghiền thành bột đồng nhất bằng
2.2.8.2.Phương phỏp MTT
Độc tớnh tế bào của gossypol và cỏc đồng phõn quang học của nú trờn cỏc dũng tế bào ung thư được xỏc định bằng phương phỏp MTT (MTT assay). Phương
phỏp MTT được tiến hành dựa trờn phản ứng khử của MTT (3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, một tetrazole) cú mầu vàng thành formazan cú mầu tớm trong ty thể của tế bào sống. Phản ứng khử này chỉ xảy ra chỉ khi cỏc enzyme reductase trong ty thể hoạt động và do đú sự thay đổi này liờn quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống. Khi so sỏnh lượng formazan mầu tớm được tạo thành từ cỏc tế bào đó được xử lý với một chất thử với lượng formazan tạo thành từ cỏc tế bào đối chứng khụng được xử lý thỡ cú thể suy ra tỏc động gõy chết tế bào của chất thử thụng qua việc xõy dựng một đường cong phụ thuộc theo liều dựng [48].
Cấy 200 àl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong mụi trường RPMI 1640 với dũng Hep-G2 và MCF-7, mụi trường DMEM với cỏc mẫu thử trờn dũng LU-1. Cỏc tế bào được nuụi ổn định sau 24 h ở 370C, 5% CO2. Cỏc mẫu thử: gossypol racemic, (+)-gossypol, (-)-gossypol và mẫu đối chứng dương là vincristine được pha trong DMSO. Pha loóng cỏc mẫu thử tạo thành dóy cỏc nồng độ khỏc nhau trong mụi trường nuụi cấy tương ứng. Cỏc dung dịch mẫu thử sau đú được thờm dung dịch tế bào sao cho nồng độ pha loóng cuối cựng đạt 0,5; 1; 5; 10; 20; 30 àM với (±)-gossypol và (-)-gossypol; nồng độ đạt 0,5; 1; 5; 10; 20; 30; 40; 60 àM với (+)-gossypol và nồng độ đạt 0,5; 5; 50; 500 nM với vincristine. Mẫu đối chứng khụng được bổ xung thuốc thử.
Thớ nghiệm được lặp lại 3 lần. Cỏc tế bào được ủ ở 370C, 5% CO2. Sau 72 h, mụi trường nuụi cấy tế bào được loại bỏ và thờm vào mỗi giếng 50 àl MTT (1 mg/ml pha trong mụi trường nuụi cấy khụng huyết thanh). Sau khi ủ ở 370C trong 4 giờ, dung dịch MTT được loại bỏ và thờm vào mỗi giếng 100 àl DMSO. Lắc đều, đọc kết quả ở bước súng 540 nm trờn mỏy spectrophotometter Genios TECAN.
Phần trăm ức chế sự phỏt triển của tế bào được tớnh theo cụng thức: % ức chế = (OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng.
Giỏ trị IC50 được tớnh dựa trờn kết quả số liệu phần trăm ức chế sự phỏt triển của tế bào bằng phần mềm mỏy tớnh table curve.