Nghiên cứu mức độ biểu hiện gen survivin ở giai đoạn phiên mã trên một số dòng tế bào ung thư

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ HÀ PHƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1101397 NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN SURVIVIN Ở GIAI ĐOẠN PHIÊN MÃ TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ HÀ PHƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1101397 NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN SURVIVIN Ở GIAI ĐOẠN PHIÊN MÃ TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đỗ Hồng Quảng Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Sinh Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Công nghệ sinh học Viện hàn lâm Khoa học – Công nghệ HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, trước hết, em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô Trường Đại học Dược dạy dỗ truyền đạt tri thức quý báu cho em suốt thời gian em học tập rèn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị bạn bè nghiên cứu khoa học môn Hóa Sinh, anh chị công tác phòng Công nghệ tế bào động vật thuộc Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi bảo cho em trình nghiên cứu Với tất kính trọng, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Hồng Quảng – giảng viên Bộ môn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà Nội Thầy người truyền đạt cho em kiến thức, phương pháp tác phong làm việc nghiêm túc, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên em, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Quang Huấn - trưởng phòng Công nghệ tế bào động vật Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người hỗ trợ nhiều mặt chuyên môn thời gian em nghiên cứu Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè quan tâm, động viên giúp đỡ em suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2016 Sinh viên Lê Hà Phương MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan survivin 1.1.1 Cấu trúc phân tử 1.1.2 Chức sinh học survivin 1.1.2.1 Survivin phân chia tế bào 1.1.2.2 Survivin apoposis 1.1.2.3 Survivin sự hình thành mạch 1.1.3 Vai trò survivin ung thư 1.1.3.1 Biểu hiện của survivin ung thư 1.1.3.2 Cơ chế phân tử của survivin ung thư 1.1.3.3 Ứng dụng survivin chẩn đoán và điều trị ung thư 10 1.2 Tổng quan phương pháp đánh giá biểu gen survivin 11 1.2.1 Quá trình biểu gen 11 1.2.2 Các phương pháp đánh giá mức độ biểu gen survivin 12 1.2.2.1 RT-PCR 13 1.2.2.2 Real-time RT-PCR 15 1.2.2.3 Western blot 16 1.3 Tổng quan Glycyl funtumin 16 1.3.1 Nguồn gốc 16 1.3.2 Tác dụng dược lý 17 1.3.3 Tác dụng của Glycyl funtumin ung thư 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU/ 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu, trang thiết bị nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Nuôi cấy tế bào 21 2.3.2 Tách chiết ARN 22 2.3.3 Xác định nồng độ độ tinh mẫu ARN 23 2.3.4 Phản ứng Real-time RT-PCR phát gen survivin 23 2.3.5 Điện di gel agarose 25 2.3.6 Giải trình tự ADN 25 2.2.7 Xây dựng đường chuẩn real-time RT-PCR 25 2.3.8 Phản ứng real-time RT-PCR đánh giá biểu gen survivin 26 2.3.9 Xử lý thống kê 26 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Kết 27 3.1.1 Kết xây dựng quy trình đánh giá biểu gen survivin 27 3.1.1.1 Tách chiết ARN tổng số 27 3.1.1.2 Kết phát hiện gen survivin 28 3.1.1.3 Xây dựng đường chuẩn định lượng real-time PCR 29 3.1.1.4 Kết định lượng biểu hiện gen survivin 31 3.1.2 Kết ứng dụng mô hình xây dựng để đánh giá sơ tác dụng Glycyl funtumin 31 3.1.2.1 Tách chiết ARN tổng số 32 3.1.2.2 Kết định lượng real-time RT-PCR 33 3.2 Bàn luận 34 3.2.1 Về kết xây dựng quy trình đánh giá biểu gen dòng tế bào 34 3.2.1.1 Nuôi cấy tế bào 35 3.2.1.2 Tách chiết ARN tổng số 35 3.2.1.3 Kỹ thuật real-time RT-PCR đánh giá mức độ biểu hiện gen 36 3.2.1.4 Kết đánh giá biểu hiện gen hai dòng tế bào BT474 A549 37 3.2.2 Về kết ứng dụng quy trình xây dựng để đánh giá sơ tác dụng thuốc Glycyl funtumin 377 KẾT LUẬN 39 KIẾN NGHỊ 39 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Tên tiếng Việt ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BIRC5 Baculoviral IAP repeat containing protein BIR Baculoviral IAP repeat Chuỗi lặp lại IAP baculovirus Bps Base pairs Cặp bazơ nitơ Carbon C cADN Complementary DNA ADN bổ sung DMEM Dulbecco's Modified Eagle Môi trường nuôi cấy Medium tế bào Deoxynucleosid dNTP triphosphate EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid Axit Ethylendiamin Tetraacetic F Forward primer Mồi xuôi FBS Fetal bovine serum Huyết bào thai bò IAP Inhibitors of Apoptosis Chất ức chế sự chết theo chương trình của tế bào Thực nghiệm in-vitro mARN N Message RNA ARN thông tin Nitơ Nhiễm sắc thể NST NTC Non – template control Mẫu đối chứng OD Optical Density Mật độ quang PAGE Polyacrylamide gel Điện di gel electrophoresis polyacrylamid P/S Penicillin/Streptomycin PBS Phosphate buffer saline Dung dịch đệm phosphate PCR Polymer chain reaction Phản ứng khuếch đại gen qRT-PCR Quantitative Reverse transcription Polymerase chain Phản ứng khuếch đại gen có phiên mã ngược định lượng reaction R Reverse primer Mồi ngược rARN Ribosom RNA ARN ribosom RT Reverse transcription Phiên mã ngược RT-PCR Reverse transcription Phản ứng khuếch đại gen có Polymerase chain reaction phiên mã ngược SDS Sodium dodecyl sulfat tARN Transfer RNA TAE ARN vận chuyển Đệm Tris - Acetate – EDTA DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Bảng 3.1 Kết nồng độ và độ tinh sạch của mẫu ARN Trang 28 tổng số Bảng 3.2 Kết định lượng real-time PCR mARN survivin 30 xác định đường chuẩn dòng tế bào ung thư vú BT474 Bảng 3.3 Số lượng đoạn gen survivin khuếch đại từ 31 100ng ARN tổng số dòng tế bào BT 474 A549 sau 45 chu kỳ Bảng 3.4 Nồng độ và độ tinh sạch của ARN tổng số mẫu 32 thử thuốc Bảng 3.5 Kết định lượng biểu hiện gen survivin hai nhóm chứng thử 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị STT Trang Hình 1.1 Cấu trúc phân tử protein survivin Hình 1.2 Sơ đồ NST 17 vị trí của gen survivin Hình 1.3 Mô hình mARN tiền thân tạo thành mARN trưởng thành với đồng dạng ghép nối Hình 1.4 Cơ chế ức chế apoptosis của survivin Hình 1.5 Các chất ức chế survivin 11 Hình 1.6 Quá trình biểu hiện gen 12 Hình 1.7 Nguyên lý phản ứng PCR 15 Hình 1.8 Funtumin N-Glycyl funtumin 17 Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV của mẫu ARN chiết từ hai dòng 27 tế bào BT474 A549 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm real-time RT-PCR với cặp 28 mồi survivin hai dòng tế bào ung thư Hình 3.3 Kết so sánh kết giải trình tự gen với trình tự 29 gen survivin đăng ký Genbank Hình 3.4 Đường chuẩn định lượng mARN/cADN survivin 30 Hình 3.5 Phổ hấp thụ UV của ARN chiết từ mẫu nghiên 32 cứu Hình 3.6 Đường phản ứng real-time RT-PCR với mồi survivin mẫu nghiên cứu 33 32 thuốc Sau đó, tiến hành tách ARN tổng số, real-time RT-PCR sau áp vào đường chuẩn định lượng mARN/cADN survivin xây dựng để định lượng số ADN gen survivin 3.1.2.1 Tách chiết ARN tổng số Sau tách chiết ARN tổng số, nồng độ chất lượng ARN thu được kiểm tra máy NanoDrop Kết quét phổ cho thấy tất mẫu đều có cực đại hấp thụ bước sóng 260 nm (Hình 3.5) Hình 3.5 Phổ hấp thụ UV ARN chiết từ mẫu nghiên cứu (BT474: chứng - thử, A549) Nồng độ và độ tinh sạch của mẫu thử đo máy NanoDrop Kết trình bày Bảng 3.4 Bảng 3.4 Nồng độ và độ tinh sạch của ARN tổng số mẫu thử thuốc Nhóm thử Ký hiệu mẫu Nồng độ (ng/µL) OD260/OD280 BT474 1+ 146,0 2,03 BT474 2+ 213,8 1,81 BT474 3+ 159,1 1,99 33 Nhận xét: Tất mẫu đều có tỷ số OD260/OD280 xấp xỉ Điều cho thấy ARN thu mẫu tinh sạch đủ điều kiện để tiến hành các bước của quy trình đánh giá biểu hiện gen 3.1.2.2 Kết định lượng real-time RT-PCR Thực hiện phản ứng real-time RT-PCR tất mẫu hai nhóm thu đường phản ứng Hình 3.6 Hình 3.6 Đường phản ứng real-time RT-PCR mẫu nghiên cứu Nhận thấy, tất mẫu đều có tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng phát hiện Như vậy, gen survivin biểu hiện tất mẫu hai nhóm chứng thử Các kết của mẫu nghiên cứu đưa vào xử lý Thống kê mô tả (Descriptive Statistic) xử lý t-Test (Two-Sample Assuming Equal Variances) với α = 0,05 phần mềm MS Excel 2013 Bảng 3.5 Kết định lượng biểu hiện gen survivin hai nhóm chứng thử BT474 ( X ± SD) Nhóm thử 70,5 66,4 95,2 77,37 ± 15,58 Nhóm chứng 115,0 128,0 138,0 127,0 ± 11,53 p 0,01 < 0,05 34 Nhận xét: Kết xử lý thống kê cho thấy số lượng khuếch đại nhóm thử nhóm chứng (77,37 < 127) với p < 0,05 61% nhóm chứng Do đó, có thể kết luận, lượng mARN survivin dòng tế bào ung thư vú BT474 nhóm thử nhóm không dùng thuốc, nhóm thử có biểu hiện gen survivin thấp nhóm chứng Kết nghiên cứu cho thấy, Glycyl funtumin có tác dụng làm giảm 40% mức độ biểu hiện gen survivin dòng BT474 giai đoạn phiên mã Vì survivin ức chế trình apoptosis nguyên nhân của việc tiến triển kháng hóa trị liệu và tái phát ung thư nên có thể sơ thấy Glycyl funtumin có thể có tác dụng giảm khả tiến triển tái phát của ung thư vú theo chế kháng survivin 3.2 Bàn luận 3.2.1 Về kết triển khai mô hình đánh giá biểu gen hai dòng tế bào BT474 A549 Ung thư trở thành đề tài nghiên cứu từ vài kỷ trước, có nhiều thành tựu chẩn đoán, điều trị, nhiều thuốc điều trị ung thư đời và nghiên cứu Quá trình thử nghiệm thuốc điều trị ung thư đòi hỏi cần tìm phương pháp sàng lọc chung thuốc ung thư các loại ung thư khác nhau, nhiên khó khăn hiện là chưa thấy có gen biểu hiện đồng thời tất các dòng ung thư [19] Theo nhiều nghiên cứu gần đây, survivin biểu hiện tất 60 dòng ung thư người, với mức cao ung thư vú, ung thư phổi mức thấp ung thư thận [15] Vì vậy, survivin trở thành dấu ấn sinh học chung tạo điều kiện cho việc sàng lọc tác dụng của thuốc điều trị ung thư dựa khả làm giảm biểu hiện gen survivin mô, dòng tế bào ung thư 35 3.2.1.1 Nuôi cấy tế bào Lợi ích của việc sử dụng dòng tế bào nuôi cấy nghiên cứu sự sẵn có của dòng tế bào ung thư Các dòng tế bào ung thư nuôi cấy thường xuyên và lưu trữ phòng, viện nghiên cứu nguồn cung cấp nguyên liệu cho nghiên cứu thực nghiệm Mặt khác, nuôi cấy dòng tế bào có khả cung cấp mẫu quần thể tế bào tương đối đồng có khả tự chép môi trường nghiên cứu tiêu chuẩn [29] làm hạn chế sai số nghiên cứu Dựa vào tài liệu tham khảo, nghiên cứu biểu hiện gen survivin và ngoài nước, lựa chọn hai dòng tế bào BT474 và A549 để đưa vào nghiên cứu Đây là các dòng tế bào ung thư thường sử dụng để nghiên cứu mức độ biểu hiện gen survivin ung thư vú và ung thư phổi [13, 50] 3.2.1.2 Tách chiết ARN tổng số Để đánh giá mức độ chép của gen survivin tế bào, tiến hành tách chiết ARN tổng số Kỹ thuật tách ARN tổng số cần đảm bảo hàm lượng và độ tinh sạch Các phân tử ARN không bền, dễ bị phân hủy enzym ribonuclease (RNase) Hơn nữa, RNase lại có mặt khắp nơi, có hoạt tính cao bền vững với các tác nhân thường dùng để loại bỏ enzym (việc xử lý nhiệt 90oC không làm hoạt tính RNase) Vì lý đó, việc tách chiết ARN đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng điều kiện vô trùng, dụng cụ, hóa chất đều khử trùng [44] Có nhiều phương pháp tách chiết ARN, việc sử dụng kit tách chiết ARN đem lại nhiều thuận lợi tách chiết nhanh, thao tác đơn giản, cho phép tách đồng thời nhiều mẫu tế bào, chất lượng ARN thu cao so với các phương pháp tách chiết hóa chất thông thường [26] Quy trình tách ARN theo quy trình tách của QIAgen chuẩn hóa đảm bảo tính ổn định tính bền 36 vững của ARN, ARN không bị phân hủy suốt trình tiến hành nghiên cứu Độ tinh sạch của mẫu ARN tổng số xác định số mật độ quang tỷ lệ OD260 /OD280 Các acid nucleic có độ hấp thụ cao bước sóng 260nm Protein có độ hấp thụ cao bước sóng 280nm và độ hấp thụ thấp bước sóng 260nm Tỷ lệ OD260 /OD280 biểu thị mức độ protein sót lại dịch chiết ARN coi tinh sạch giá trị OD260/OD280 xấp xỉ [55] Kết quét phổ từ bước sóng từ 220nm đến 350nm, tất mẫu đều có đỉnh hấp thụ bước sóng 260 nm Đồng thời, tất mẫu đều có tỷ lệ OD260 /OD280 xấp xỉ 2,0 Điều cho thấy ARN tách chiết mẫu đều tinh sạch chứng tỏ trình tách chiết tốt 3.2.1.3 Kỹ thuật real-time RT-PCR đánh giá mức độ biểu gen Có nhiều phương pháp đánh giá mức độ phiên mã, hiện thường dùng kỹ thuật Real-time PCR Kỹ thuật PCR cho phép nghiên cứu mARN tồn tại với hàm lượng thấp, không thể phát hiện các phương pháp cổ điển khác Northern blot (nhạy Northern blot 10.000 lần), đồng thời phương pháp cho phép định lượng các phương pháp đánh giá biểu hiện gen giúp dễ dàng so sánh sự chép mARN mẫu nghiên cứu dựa vào kết định lượng cụ thể [24] Trong nghiên cứu này, tiến hành kỹ thuật Real-time RT-PCR sử dụng tín hiệu huỳnh quang Probe Taqman thực hiện máy Light Cycle của Roche Real-time PCR kỹ thuật PCR mà kết khuếch đại ADN đích hiển thị tại chu kỳ nhiệt của phản ứng Nói chung có hai phương pháp đánh giá Real-time PCR: định lượng tuyệt đối và tương đối Để định lượng tuyệt đối cần xây dựng đường cong chuẩn Ngược lại để định lượng tương đối cần so sánh gen cần nhân với gen tham chiếu gọi gen nội chuẩn có mặt khắp nơi thể Các gen nội chuẩn nhiều sử dụng 37 GAPDH Beta-actin…[43] Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp định lượng tuyệt đối xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn có thể áp dụng nghiên cứu đánh giá mức độ phiên mã gen survivin sau Khác với nghiên cứu về biểu hiện gen survivin của TS Nguyễn Minh Hiền, nghiên cứu này, tiến hành kỹ thuật Real-time RT-PCR bước: phản ứng phiên mã ngược tiến hành ống phản ứng PCR Việc thực hiện kỹ thuật RT-PCR bước thao tác đem lại số ưu điểm như: chi phí thấp hơn, thời gian tiến hành ngắn hơn, thao tác làm hạn chế nguy nhiễm tạp sai sót trộn mẫu, thích hợp với nghiên cứu số lượng gen Một vài nghiên cứu cho thấy kết phân tích sử dụng kỹ thuật RT-PCR theo phương pháp này cho các kết giống đến 100% với R2 0,995 Về tính nhạy cảm hiệu suất phản ứng của hai phương pháp này tùy thuộc vào gen nghiên cứu [51] Điều cho phép lựa chọn linh hoạt phương pháp này nghiên cứu cụ thể 3.2.1.4 Kết đánh giá biểu gen hai dòng tế bào BT474 A549 Với kết real-time RT-PCR khẳng định sự có mặt mức độ biểu hiện mức của gen survivin hai dòng tế bào ung thư BT474 và A549 Kết phù hợp với nghiên cứu của TS.Nguyễn Minh Hiền về mức độ mARN survivin dòng tế bào BT474 nghiên cứu khác về biểu hiện gen survivin giai đoạn phiên mã dòng tế bào A549 [4, 60] 3.2.2 Về đánh giá sơ tác dụng thuốc Glycyl funtumin với mức độ biểu gen survivin dòng BT474 Glycyl funtumin chứng minh có tác dụng kích thích miễn dich sử dụng điều trị bổ trợ ung thư mang lại kết khả quan Tuy 38 nhiên, chế tác dụng của Funtumin điều trị ung thư chưa làm rõ Trong nghiên cứu này, đánh giá tác dụng của Glycin Funtumin với vai trò chất kháng survivin Kết nghiên cứu cho thấy sự phơi nhiễm của tế bào ung thư vú BT474 môi trường thuốc thử với nồng độ µg/ml thời gian ngày có tác dụng làm giảm mức độ biểu hiện gen survivin dòng BT474 giai đoạn phiên mã Như vậy, nghiên cứu bước đầu cho thấy Glycyl funtumin có thể có tác dụng ức chế survivin giai đoạn phiên mã Trên giới, thử nghiệm thuốc kháng survivin thường đánh giá biểu hiện gen survivin hai giai đoạn phiên mã (mARN) dịch mã (protein) [58, 62] Tuy nhiên, phạm vi nghiên cứu dừng lại việc đánh giá tác dụng ức chế biểu hiện gen survivin giai đoạn phiên mã mARN sản phẩm cuối của gen, mức độ phiên mã của gen có thể không tỷ lệ với biểu hiện của protein đươc mã hóa từ gen Tùy theo chế của thuốc mà có thể ảnh hưởng lên trình biểu hiện gen các giai đoạn khác Tuy nhiên, sự thay đổi về số lượng ARN tế bào kéo theo sự thay đổi về số lượng chất lượng của protein [28, 42] sự giảm mức độ phiên mã làm giảm lượng mARN dẫn đến sự giảm mức độ biểu hiện của protein Các phương pháp phân tích mARN tế bào tốn kém và sử dụng phổ biến việc phân tích biểu hiện protein Tóm lại, kết nghiên cứu xây dựng áp dụng quy trình đánh giá biểu hiện gen survivin mức độ phiên mã dòng tế bào ung thư để đánh giá tác dụng ức chế biểu hiện gen survivin của thuốc Đây là quy trình sử dụng kỹ thuật hiện đại và sử dụng phổ biến có tính ứng dụng cao nghiên cứu về gen survivin sau này, tạo tiền đề phát triển cho thử nghiệm thuốc điều trị ung thư, thuốc nhắm mục tiêu ức chế survivin tương lai 39 KẾT LUẬN Qua trình thực nghiệm đề tài, rút số kết luận sau: Xây dựng triển khai mô hình đánh giá biểu hiện gen survivin hai dòng tế bào BT474 A549 bao gồm các bước sau: - Nuôi cấy tế bào ung thư theo dạng bám đáy 37oC, 5% CO2 môi trường DMEM high glucose với thời gian ngày - Tách chiết ARN tổng số từ mẫu tế bào kit tách chuyên dụng của QIAgen Định lượng và đánh giá chất lượng ARN máy NanoDrop - Sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR kit QIAgen phát hiện mARN survivin hai dòng tế bào BT474 A549, định lượng gen survivin 100 ng ARN tổng số hai dòng BT474 A549 sau 45 chu kỳ 127 ± 11,53 88.17 ± 5,83 Ứng dụng quy trình xây dựng để đánh giá tác dụng của Glycin funtumin biểu hiện gen survivin dòng tế bào ung thư vú BT474: Glycin funtumin làm giảm 40% mức độ biểu hiện gen survivin giai đoạn phiên mã dòng tế bào BT474 KIẾN NGHỊ Tiếp tục tiến hành đánh giá mức độ biểu hiện gen survivin giai đoạn phiên mã số dòng tế bào ung thư khác Tiếp tục đánh giá tác dụng của Glycin funtumin số dòng tế bào ung thư khác Sử dụng quy trình đánh giá mức độ biểu hiện gen survivin nghiên cứu đánh giá tác dụng của thuốc điều trị ung thư TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt [1] Chu Hoàng Mậu (2004), Cơ sở phương pháp sinh học phân tử, Tr 139, Nhà xuất Đại học sư phạm, Thái Nguyên [2] Đào Thị Kim Chi (1984), Tổng hợp Funtumin, số peptidyl funtumin thăm dò tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu của chúng, Luận án Phó Tiến sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội [3] Đào Thị Kim Chi (2005), Hoàn thiện qui trình sản xuất thuốc tiêm Aslem điều hóa miễn dịch, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật của dự án KC10-DA13 [4] Nguyễn Minh Hiền (2014), Đánh giá mức độ chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ tế bào ung thư vú, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội [5] Lê Thị Thu Huyền (2011), Bước đầu nghiên cứu Dược Động Học của glycyl funtumin động vật thí nghiệm LC-MS/MS, Tr 3-4, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội [6] Đỗ Hồng Quảng (2001), Nghiên cứu tổng hợp thăm dò tác dụng sinh học của Methyonyl Glycyl Funtumin, Tr 10-12, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Hà Nội B Tài liệu Tiếng Anh [7] Altieri D C (2003), "Validating survivin as a cancer therapeutic target", Nature Reviews Cancer (1), pp 46-54 [8] Ambrosini G et al (1997), "A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma", Nature medicine (8), pp 917921 [9] Badran A et al (2004), "Identification of a novel splice variant of the human anti-apoptopsis gene survivin", Biochemical and biophysical research communications 314 (3), pp 902-907 [10] Berthelet J et al (2013), "Regulation of apoptosis by inhibitors of apoptosis (IAPs)", Cells (1), pp 163-187 [11] Bisen P S et al (2013), Biology of oral cancer: Key apoptotic regulators, CRC Press [12] Blanc-Brude O P et al (2003), "Therapeutic Targeting of the Survivin Pathway in Cancer Initiation of Mitochondrial Apoptosis and Suppression of Tumor-associated Angiogenesis", Clinical Cancer Research (7), pp 2683-2692 [13] Brar S S et al (2012), "Mitochondrial DNA-depleted A549 cells are resistant to bleomycin", American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology 303 (5), pp L413-L424 [14] Brassart B et al (2007), "A new steroid derivative stabilizes gquadruplexes and induces telomere uncapping in human tumor cells", Molecular pharmacology 72 (3), pp 631-640 [15] Brentnall M et al (2013), "Caspase-9, caspase-3 and caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis", BMC cell biology 14 (1), pp 32 [16] Caldas H et al (2005), "Survivin 2α: a novel survivin splice variant expressed in human malignancies", Molecular cancer (1), pp 11 [17] Carter B Z et al (2012), "Survivin is highly expressed in CD34+ 38− leukemic stem/progenitor cells and predicts poor clinical outcomes in AML", Blood 120 (1), pp 173-180 [18] Chandele A et al (2004), "Upregulation of survivin in G2/M cells and inhibition of caspase activity enhances resistance in staurosporineinduced apoptosis", Neoplasia (1), pp 29-40 [19] Chekhun S et al (2013), "Expression of biomarkers related to cell adhesion, metastasis and invasion of breast cancer cell lines of different molecular subtype", Experimental oncology, pp 174-179 [20] Chen X et al (2016), "Survivin and Tumorigenesis: Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies", Journal of Cancer (3), pp 314-323 [21] Crook N E et al (1993), "An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif", Journal of virology 67 (4), pp 2168-2174 [22] Deveraux Q L et al (1999), "IAP family proteins-suppressors of apoptosis", Genes & development 13 (3), pp 239-252 [23] Duffy M J et al (2007), "Survivin: a promising tumor biomarker", Cancer letters 249 (1), pp 49-60 [24] Dvořák Z et al (2003), "Approaches to messenger RNA detection– comparison of methods", Biomed Pap 147, pp 131-135 [25] Esteban J et al (1985), "Importance of Western blot analysis in predicting infectivity of anti-HTLV-III/LAV positive blood", The Lancet 326 (8464), pp 1083-1086 [26] García-Nogales P et al (2010), "Comparison of commercially-available RNA extraction methods for effective bacterial RNA isolation from milk spiked samples", Electronic Journal of Biotechnology 13 (5), pp 19-20 [27] Giesen E M et al (1981), "The effect of LH1, an aminoacyl-steroid, on cultured hepatoma cells", Cancer Biochem Byophys 5, pp 233 - 238 [28] Guil S et al (2015), "RNA–RNA interactions in gene regulation: the coding and noncoding players", Trends in biochemical sciences 40 (5), pp 248-256 [29] Holliday D L et al (2011), "Choosing the right cell line for breast cancer research", Breast Cancer Res 13 (4), pp 215 [30] Klein D (2002), "Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations", Trends in molecular medicine (6), pp 257-260 [31] Ku J H et al (2012), "Urine survivin as a diagnostic biomarker for bladder cancer: a systematic review", BJU international 110 (5), pp 630-636 [32] Kusner L L et al (2014), "Survivin as a potential mediator to support autoreactive cell survival in myasthenia gravis: a human and animal model study", PloS one (7), pp e102231 [33] Kyani K et al (2014), "Detection of survivin 2α gene expression in thyroid nodules", Journal of cancer research and therapeutics 10 (2), pp 312 [34] Mahotka C et al (1999), "Survivin-ΔEx3 and survivin-2B: two novel splice variants of the apoptosis inhibitor survivin with different antiapoptotic properties", Cancer Research 59 (24), pp 6097-6102 [35] Majno G et al (1995), "Apoptosis, oncosis, and necrosis An overview of cell death", The American journal of pathology 146 (1), pp [36] Mirza A et al (2002), "Human survivin is negatively regulated by wildtype p53 and participates in p53-dependent apoptotic pathway", Oncogene 21 (17), pp 2613-2622 [37] Mita A C et al (2008), "Survivin: key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics", Clinical Cancer Research 14 (16), pp 5000-5005 [38] Mobahat M et al (2014), "Survivin as a preferential target for cancer therapy", International journal of molecular sciences 15 (2), pp 24942516 [39] Muzio L L et al (2001), "Expression of the apoptosis inhibitor survivin in aggressive squamous cell carcinoma", Experimental and molecular pathology 70 (3), pp 249-254 [40] Nelson D L et al (2008), Lehninger principles of biochemistry, Macmillan [41] Pennati M et al (2007), "Targeting survivin in cancer therapy: fulfilled promises and open questions", Carcinogenesis 28 (6), pp 1133-1139 [42] Pesiridis G S et al (2009), "Mutations in TDP-43 link glycine-rich domain functions to amyotrophic lateral sclerosis", Human molecular genetics 18 (R2), pp R156-R162 [43] Romanowski T et al (2006), "Housekeeping genes as a reference in quantitative real-time RT-PCR", Postepy higieny i medycyny doswiadczalnej (Online) 61, pp 500-510 [44] Roth C M (2002), "Quantifying gene expression", Current issues in molecular biology 4, pp 93-100 [45] Roux K H (2009), "Optimization and troubleshooting in PCR", Cold Spring Harbor Protocols 2009 (4), pp 66 [46] Sanhueza C et al (2015), "The twisted survivin connection to angiogenesis", Molecular cancer 14 (1), pp [47] Tirrò E et al (2006), "Altered expression of c-IAP1, survivin, and Smac contributes to chemotherapy resistance in thyroid cancer cells", Cancer Research 66 (8), pp 4263-4272 [48] VanGuilder H D et al (2008), "Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis", Biotechniques 44 (5), pp 619 [49] Velculescu V et al., "Analysis of human transcriptomes.", Nat Genet 23, pp 387-388 [50] von der Heyde S et al (2015), "mRNA profiling reveals determinants of trastuzumab efficiency in HER2-positive breast cancer", PloS one 10 (2), pp 117818 [51] Wacker M J et al (2005), "Analysis of one-step and two-step real-time RT-PCR using SuperScript III", Journal of biomolecular techniques: JBT 16 (3), pp 266 [52] Waligórska-Stachura J et al (2014), "Survivin delta ex3 overexpression in thyroid malignancies", PloS one (6) [53] Wang Y.-F et al (2014), "Inhibition of Survivin Reduces HIF-1α, TGFβ1 and TFE3 in Salivary Adenoid Cystic Carcinoma", PloS one (12), pp 114051 [54] Wang Z et al (2004), "Survivin regulates the p53 tumor suppressor gene family", Oncogene 23 (49), pp 8146-8153 [55] Wilfinger W W et al (1997), "Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity", Biotechniques 22 (3), pp 474-476, 478-481 [56] Wong R S (2011), "Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment", Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 30 (1), pp [57] Wright M E et al (2000), "Caspase-3 and inhibitor of apoptosis protein (s) interactions in Saccharomyces cerevisiae and mammalian cells", FEBS letters 481 (1), pp 13-18 [58] Yang M et al (2013), "Analysis of the expression levels of survivin and VEGF in patients with acute lymphoblastic leukemia", Experimental and therapeutic medicine (1), pp 305-307 [59] Yu X et al (2016), "The interplay between human herpes simplex virus infection and the apoptosis and necroptosis cell death pathways", Virology Journal 13 (1), pp [60] Zhang M et al (2006), "Experimental study of antisense oligodeoxynucleotide targeting survivin gene for cisplatin resistant human lung adeno-carcinoma xenograft in nude mice", Zhong nan da xue xue bao Yi xue ban= Journal of Central South University Medical sciences 31 (5), pp 717-722 [61] Zhao J et al (2000), "The ubiquitin-proteasome pathway regulates survivin degradation in a cell cycle-dependent manner", Journal of cell science 113 (23), pp 4363-4371 [62] Zhu J et al (2016), "Targeting survivin using a combination of miR‑494 and survivin shRNA has synergistic effects on the suppression of prostate cancer growth", Molecular Medicine Reports 13 (2), pp 16021610 [63] Ziello J E et al (2007), "Hypoxia-Inducible Factor (HIF)-1 regulatory pathway and its potential for therapeutic intervention in malignancy and ischemia", Yale J Biol Med 80 (2), pp 51-60 [...]... tạp ở mỗi loại tế bào Việc đánh giá mức độ biểu hiện của một gen cụ thể được thư c hiện thông qua việc phát hiện và đo lường các sản phẩm của gen đó ở hai giai đoạn phiên mã (ARN) và dịch mã (protein) 1.2.2 Các phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen survivin Trên thế giới biểu hiện gen survivin trong ung thư được nghiên cứu ở cả hai giai đoạn phiên mã và dịch mã Một nghiên cứu. .. này đang được thư nghiệm trên người Ở nước ta, việc nghiên cứu về survivin cũng đã được bắt đầu với nghiên cứu về mức độ phiên mã của mARN survivin trong tế bào tại mô ung thư vú và tại tế bào ung thư vú lưu hành trong máu của tác giả Nguyễn Minh Hiền 2014 Việc đánh giá mức độ phiên mã của gen survivin giúp dự đoán tốc độ phát triển của khối u, tiên lượng về mức độ đáp ứng với... còn giúp xây dựng một phương pháp invitro nhằm sàng lọc các thuốc có tác dụng chống ung thư theo cơ chế ức chế survivin, rất có ích cho các nghiên cứu sau này 2 Do đó, chúng tôi thư c hiện đề tài Nghiên cứu mức độ biểu hiện gen survivin trên một số dòng tế bào ung thư với các mục tiêu sau: 1 Triển khai mô hình đánh giá mức độ biểu hiện gen survivin trên hai dòng tế bào BT474 và A549... để đánh giá mức độ biểu hiện của gen survivin ở các bệnh nhân [58] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về survivin cũng đã được bắt đầu với nghiên cứu về mức độ phiên mã của mARN survivin trong tế bào tại mô ung thư vú và tại tế bào ung thư vú lưu hành trong máu của tác giả Nguyễn Minh Hiền 2014 Trong nghiên cứu này, tác giả đã xây dựng mô hình đánh giá biểu hiện gen survivin sử dụng... pháp nghiên cứu 2.3.1 Nuôi cấy tế bào Môi trường nuôi cấy tế bào: - Môi trường bổ sung đầy đủ (BSĐĐ): DMEM high glucose (invitrogen) + 10% FBS (Invitrogen) + 1% P/S (Invitrogen) + 2 mM L-Glutamin - Môi trường giữ chủng tế bào: Môi trường BSĐĐ + 10% DMSO Nuôi cấy tế bào trên đĩa nghiên cứu: Xác định thể tích dịch tế bào ứng với số lượng tế bào là 104 tế bào Bổ sung thêm 10ml môi trường bổ sung... BRUCE và survivin Survivin được phát hiện năm 1997 từ bộ gen người Nó được mã hóa bởi gen BIRC5 (baculoviral IAP repeat-containing protein 5) gọi tắt là gen survivin [10] Nhiều nghiên cứu cho thấy, survivin biểu hiện ở tế bào ung thư trong hầu hết loại ung thư phổ biến nhưng hiếm khi biểu hiện ở các mô bình thư ng tương ứng [49] Điều này đã khiến survivin trở thành chỉ dấu ung thư và... trong ung thư vú và ung thư phổi, mức độ biểu hiện thấp nhất trong ung thư thận [32] Biểu hiện quá mức của survivin luôn gắn với các loại khối u ác tính và các chẩn đoán các khối u lành tính hay không ung thư đều có xét nghiệm survivin âm tính Xét nghiệm ở tế bào niêm mạc và tế bào da bình thư ng cho kết quả âm tính với survivin; ngược lại, một nghiên cứu cho thấy 56% ung thư miệng... tăng sinh mạch của survivin đóng góp vào việc bảo tồn tính toàn vẹn của vi cấu trúc hình ống và ức chế apoptosis ở tế bào nội mạc, làm cho tế bào này có khả năng tồn tại và chức năng bảo vệ tế bào ung thư [12, 46] 1.1.3 Vai trò của survivin trong ung thư 1.1.3.1 Biểu hiện của survivin trong ung thư Một trong những đặc điểm đặc trưng trên lâm sàng của survivin là mức độ biểu hiện khác... Funtumin trên các tế bào khối u người cho thấy Funtumin có thể có tiềm năng trong điều trị kháng u [14] Năm 1981, nhóm nghiên cứu của Giesen đã nuôi cấy tế bào ung thư gan ở môi trường có chứa Glycyl funtumin nồng độ từ 3,3 đến 106 μg/ml trong những khoảng thời gian 7 giờ, 24 giờ và 48 giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy: Ở nồng độ 6 μg/ml, sau 7 giờ số lượng tế bào bắt đầu giảm và toàn bộ tế bào ung thư. .. hiện làm kích hoạt phiên mã nhiều gen quan trọng đảm nhiệm chức năng của tế bào trong điều kiện thiếu oxy [63] HIF -1α làm tăng biểu hiện gen survivin đã được tìm thấy trong các ung thư vú, ung thư phổi và các tế bào ung thư tuyến tụy [53] 1.1.3.3 Ứng dụng survivin trong chẩn đoán và điều trị ung thư Do có mức độ biểu hiện cao rõ rệt trong nhiều bệnh ung thư và đóng vai trò như