Nghiên cứu mức độ biểu hiện LncRNA GAS5 trong bệnh ung thư biểu mô dạ dày

1 T VN Ung th d dy l bnh lý tiờu húa thng gp, l nguyờn nhõn th gõy t vong cỏc bnh ung th, tng 7% ca ung th mi mc v 10% ca t vong ung th mi nm [2] Trc nhng nm 1930, hu ht cỏc nc trờn th gii, bao gm c cỏc nc chõu u, ung th d dy l nguyờn nhõn gõy nờn t vong chớnh ung th Dn dn sau ú, t l ny c gim xung nhiu vựng Tuy nhiờn, khu vc chõu , chõu Phi ni cú cht lng i sng cũn thp thỡ t l mi mc v t l t vong cũn mc cao Trong ú, theo thng kờ ca T chc ghi nhn ung th ton cu (IARC), mi nm, nc ta, cú t 11.000 12.000 ngi mc mi ung th d dy v hn 8.000 ngi t vong [5] Con s ny c ỏnh giỏ l khỏ cao, vỡ th s hiu bit v cn bnh ny cú cỏc bin phỏp phũng trỏnh, cha tr kp thi l rt cn thit Sinh hc phõn t l mụn khoa hc v gii sinh vt cp phõn t, ch yu trung nghiờn cu mi tng tỏc gia cỏc h thng cu trỳc khỏc t bo, bao gm mi quan h qua li gia quỏ trỡnh tng hp ca DNA, RNA v protein; v tỡm hiu cỏch thc iu hũa cỏc mi tng tỏc ny Trờn th gii, sinh hc phõn t ó cú nhng bc nghiờn cu phỏt trin vt bc v ỏp dng rng rói khụng ch nghiờn cu m cũn c iu tr lõm sng Vit Nam, cỏc cng, chớnh sỏch, ỏn nghiờn cu v sinh hc phõn t y t ó v ang c xõy dng v trin khai thc hin Bờn cnh ú, c s h tng phc v cho nghiờn cu v o to ngun nhõn lc v sinh hc phõn t cng nhn c nhiu u tiờn Trỡnh nghiờn cu v ng dng cụng ngh sinh hc phõn t c y mnh, gúp phn ỏng k vic iu tr v tiờn lng nhiu chng bnh khỏc nhau, c bit l ung th Vit Nam, nhng nm gn õy, nhiu cụng trỡnh nghiờn cu khoa hc v sinh hc phõn t ó c cụng b vi nhiu k thut sinh hc phõn t khỏc c ỏp dng Nhng cỏc nghiờn cu v mc biu hin ca cỏc gen iu hũa thỡ cha nhiu Mt s nghiờn cu trờn th gii ó cp n vai trũ iu hũa, biu hin ca mt s loi gen i vi ung th ngi; giỳp cho vic iu tr v tiờn lng bnh c tt hn Mt s ú l LncRNA GAS5 (Long noncoding RNA) LncRNA GAS5 l mt RNA c cho l khụng mó húa protein nhng nú cú kh nng iu hũa s sinh trng v phỏt trin ca t bo Nhng nghiờn cu ny ó ch rng: mc biu hin LncRNA GAS5 cú s thay i cỏc t bo ung th ca mt s bnh ung th nh ung th vỳ, ung th gan, ung th thn, ung th c t cung v c ung th d dy Xut phỏt t ý tng ú chỳng tụi thc hin ti Nghiờn cu mc biu hin LncRNA GAS5 bnh ung th biu mụ d dy, vi mc tiờu chớnh l: ỏnh giỏ mc biu hin gen GAS5 bnh ung th biu mụ d dy Chng TNG QUAN TI LIU 1.1 TNG QUAN V UNG TH BIU Mễ D DY D dy l phn phỡnh to nht ca ng tiờu húa v cú hỡnh ch J, nm v trớ gia on bng ca thc qun v rut non Vi chc nng chớnh l co búp v nghin trn thc n, d dy c cu to bi lp c: c dc, c vũng v c chộo Ung th d dy l mt u ỏc tớnh v cú th phỏt trin bt c phn no ca d dy Trong ú, vo khong 90% trng hp ung th d dy l ung th biu mụ tuyn (adenocarcinoma) [28].Trong 10% cũn li c phõn loi v mụ bnh hc bao gm: ung th t bo tuyn vy, cỏc u ni tit, u mụ m ng tiờu húa v lymphoma [3] 1.1.1 Dch t hc Theo t chc Y t th gii (WHO), nm 2012, trờn th gii cú 950.000 ngi mc ung th d dy v gõy 723.000 ca t vong [2] Trong cỏc loi ung th theo gii, ung th d dy ng th nam v xp th i vi n [4] Cỏc nc cú t l mc ung th d dy cao thuc vựng ụng (Nht Bn, Trung Quc, Hn Quc), Liờn Xụ c, Nam M, chõu Phi, vựng Caribe v Nam u Cỏc nc cú t l mc bnh thp thuc vựng Nam (n , Pakistan, Thỏi Lan), Bc M, c[4] Vit Nam, t l mc ung th d dy khỏ cao, ng th sau ung th phi nam gii v ung th vỳ n [5] Theo Bựi Xuõn Trng v cs, ghi nhn ung th d dy cú s khỏc gia hai gii v hai Nam Bc [3] Bng 1.1 T l mc ung th d dy theo gii mt s tnh Vit Nam Ngun: Ung th d dy, Trn Thin Trung (2014) H Ni T l mc chun theo tui (ASR)/100.000 dõn Nam N Giai on 2001-2004 30,3 15,0 Giai on 2005-2008 30,1 14,9 Hi Phũng Nam N 16,0 8,1 16,6 6,9 Thỏi Nguyờn Nam 15,4 13,7 N 6,7 6,6 Hu Nam N 14,4 7,3 14,5 7,9 Cn Th Nam N 19,4 6,8 15,2 5,6 1.1.2 Cỏc yu t nguy c Tui v gii: ung th d dy thng gp la tui trờn 40 T l ung th d dy tng theo tui Cao 50-65 tui, t l cao nht nhúm tui >75 Nam gii hay gp hn n gii t l bỏo cỏo l 2/1, cú bỏo cỏo n 4/1 [3] Yu t gia ỡnh hoc di truyn l cỏc yu t nguy c cao cú th mc ung th d dy Mt s bỏo cỏo cho rng, t l bnh nhõn cú nhúm mỏu A gp nhiu hn nhúm mỏu khỏc n 15-20% v b m hoc anh ch em rut b ung th d dy thỡ nguy c b ung th d dy cng cao hn hn [2],[3] Ch n cú nhiu nitrate cỏc thc n nh tht hun khúi, tht cỏ p mui, tht nng chỏy, du m rỏn li nhiu ln lm tng nguy c b mc ung th d dy Ngi cú bnh viờm d dy mn tớnh, viờm d dy kốm d sn rut, lon sn hoc cú hin tng tro ngc tỏ trng d dy cú th c coi l thng tn tin ung th d dy Loột d dy khụng lm tng nguy c mc ung th d dy Tuy nhiờn, Helicobacter Pylory, nguyờn nhõn hng u ca viờm v loột d dy li l mt yu t nguy c quan trng i vi ung th d dy 1.1.3 Chn oỏn lõm sng Triu chng lõm sng ca ung th d dy din bin rt õm thm, lng l kộo di nhiu nm v khụng in hỡnh Khi cỏc triu chng lõm sng rừ rng thỡ ó mun Do ú, vic chn oỏn ung th d dy sm gn nh ch da vo vic khỏm nh k Cỏc triu chng ny bao gm: au thng v, sỳt cõn nhanh, y bng chm tiờu, chỏn n, nụn v bun nụn [6] Nhng triu chng ny d nhm ln vi cỏc triu chng ca cỏc bnh lớ lnh tớnh khỏc Khi giai on mun thỡ cú th t s thy u vựng d dy Bờn cnh ú, biu hin lõm sng cũn tựy thuc vo v trớ ca ung th, vớ d ung th tin mụn v thng gõy bin chng hp mụn v v triu chng nụn sm giỳp bnh nhõn i khỏm v phỏt hin bnh sm hn Cỏc triu chng nờu trờn ch l gi ý chn oỏn chớnh xỏc cn cho bnh nhõn tin hnh cỏc xột nghim chn oỏn cn lõm sng phự hp chn oỏn chớnh xỏc v ỏnh giỏ giai on ca ung th 1.1.4.Chn oỏn cn lõm sng 1.1.4.1 Ni soi: Ni soi l thm dũ cn lõm sng ph bin nht hin chn oỏn ung th d dy Nh ú, ta bit c v trớ tn thng v th bnh Ung th d dy c chn oỏn xỏc nh nh sinh thit ni soi 1.1.4.2 X-quang d dy Trong nhiu nm trc, X-quang l phng phỏp ch yu chn oỏn ung th d dy vi nhy 40-80% [5] Phim chp X-quang chn oỏn c: v trớ ung th, mc tn thng v lan rng ca ung th, hỡnh thỏi v cỏc dng ca tn thng Tuy nhiờn, X-quang b sút 15% trng hp ung th d dy [5] giỳp chn oỏn chớnh xỏc hn, cú th dựng phng phỏp i quang kộp, vi chớnh xỏc khong 90% [2] 1.1.4.3 Cỏc xột nghim khỏc Siờu õm bng: l phng tin chn oỏn hỡnh nh c s dng thng quy kim soỏt v chn oỏn cỏc bnh khỏc bng Do ú, nú giỳp tỡm di cn v ỏnh giỏ giai on ung th d dy Chp ct lp vi tớnh CT: vi chớnh xỏc v v trớ cao, chp ct lp CT giỳp phỏt hin chớnh xỏc v trớ ca u v tỡnh trng di cn Cỏc xột nghim c bn: cỏc du n ung th tng cao nh CEA, CA 19-9, CA 72-4 Tuy nhiờn, cỏc du n ny ch tng cao rừ rt ung th d dy giai on mun v cú giỏ tr cao iu tr, theo dừi ung th d dy [6],[7] 1.2 TNG QUAN V LncRNA GAS5 1.2.1 Cu trỳc v chc nng ca gen Nm 1953, Watson Crick phỏt hin cu trỳc xon kộp ca DNA ỏnh du bc phỏt trin ca sinh hc phõn t vo giai on mi [8] nh cao nghiờn cu gn õy l vo nm 2003, cụng b phiờn bn thụ ca b gen ngi hon chnh [8] Gen l mt on phõn t DNA mang thụng tin mó húa mt sn phm xỏc nh (mt chui polypeptid hay mt phõn t RNA) [9] Hỡnh 1.1 Cu trỳc chung ca gen (Ngun:http://voer.edu.vn) V c bn thỡ cu trỳc ca gen gm vựng: vựng iu khin, vựng mang thụng tin di truyn v vựng kt thỳc Vựng mang thụng tin di truyn hay cũn gi l vựng mó húa bao gm cỏc vựng mó húa (exon) nm xen k vi cỏc vựng khụng mó húa (intron) Mc dự mang thụng tin di truyn, nhng phõn t DNA khụng phi l cht lm khuụn tng hp protein m cn phi cú mt cht trung gian lm nhim v chuyn thụng tin di truyn t DNA v lm khuụn cho quỏ trỡnh tng hp protein ú chớnh l RNA Quỏ trỡnh chộp thụng tin di truyn t DNA thnh RNA gi l s phiờn mó Sau phiờn mó, cỏc mRNA loi b cỏc intron, tham gia quỏ trỡnh dch mó to thnh protein v biu hin tớnh trng bờn ngoi Quỏ trỡnh biu hin ca gen ngoi s tham gia ca cỏc yu t phiờn mó, cũn cú s tham gia ca cỏc yu t protein, cỏc RNA, ú cú piRNA, small nucler RNA, siRNA, v cú c LncRNA 1.3.2 S lc v Long noncoding RNA (LncRNA) Trong 50 nm, thut ng gen c hiu ng ngha vi nhng vựng RNA thụng tin (mRNA) mó húa cho b gen Tuy nhiờn, cỏc nghiờn cu gn õy ó ch rng: 90% b gen ca sinh vt nhõn tht c mó, ú ch mt lng rt nh (khong 2-3%) cỏc gen mó húa protein, cũn li l cỏc RNA khụng mó hũa protein (noncoding RNA - ncRNA) [10] Cỏc ncRNA ny ó c chng minh cú liờn quan n nhiu c ch kim soỏt s biu hin ca gen mi cp truyn thụng tin di truyn t DNA n protein [10] Chỳng bao gm sa i cỏc cu trỳc nhim sc th (methyl húa v sa i histone), iu hũa phiờn mó bng cỏch iu ch cỏc hot ng ca RNA polymerase v cỏc yu t phiờn mó, sa i RNA, n nh mRNA v dch mó [11] LncRNA l nhúm ncRNA ln nht v ang c cỏc nh khoa hc trờn th gii ht sc quan tõm Chỳng l cỏc RNA khụng mó húa protein v cú chiu di ti thiu l 200 nucleotid, cng cú th l cỏc mRNA ging ncRNA T nm 1961, Jacob v Monod ó bt u suy lun v s tn ti ca mRNA v ging gii v mụ hỡnh iu hũa gen, v h suy oỏn rng s c ch cú th l mt phõn t RNA [13] Nhng mói n tn nm u thp k 90 ca th k trc, cỏc nh khoa hc mi tỡm c LncRNA u tiờn ú l Xist [14] Sau ú, lng lot LncRNA ó c bỏo cỏo l phỏt hin cỏc ng vt cú vỳ khỏc 1.2.3 GAS5 (Growtharrest-specific5) GAS5 l mt LncRNA, c Smith v Steits thuc i hc Yale Hoa K phỏt hin nm 1998 v c nh danh bi y ban danh mc gen HUGO HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee) [18] GAS5 thuc h 5Terminal Oligopyrimidine (5 TOP), gen gm 12 exon, cỏc exon ny kt hp li to thnh hai LncRNA l GAS5a v GAS5b cú s thay i v trớ ti exon [18],[19] Ngi ta cho rng, mt phn cu trỳc ca GAS5 ging vi cỏc yu t phn ng glucocorticoid Do ú, nú cú th gn vo DNA v trớ ca vựng liờn kt receptor glucocorticoid T ú, ngn chn s hot ng ca receptor glucocorticoid v iu hũa quỏ trỡnh phiờn mó Trong cỏc nghiờn cu gn õy cho thy, LncRNA GAS5 cú mc biu hin thp cỏc t bo ung th, nh ung th c t cung, ung th t bo biu mụ gan, ung th t bo biu mụ thn v nhiu loi ung th khỏc [15],[20],[21] Mc biu hin ny cú liờn quan n c im bnh lớ, giai on bnh v cú giỏ tr tiờn lng [18] Nm 2014, Ming Sun v cng s ó nghiờn cu trờn 89 bnh nhõn ung th d dy nhn thy s biu hin ca GAS5 mụ ung th d dy l thp Mc biu hin thp ca GAS5 liờn quan vi kớch thc u, giai on ung th v tiờn lng bnh Thc nghim trờn chut, tiờm GAS5 u s nh li [18] 1.3 CC K THUT NH GI MC BIU HIN LncRNA 1.3.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) Nm 1971, Khorana v cng s ó mụ t phng phỏp tip cn khch i mt vựng chui ụi DNA Nhng mói tn 14 nm tip sau ú, nm 1985, Kary Mullis v cng s mi xut k thut PCR v trin khai k thut ti Cetus Corporation, ni ụng v cỏc cng s lm vic [8],[17] Mc ớch chớnh ca PCR l chộp v khuch i mt phõn on ngn DNA ng nghim Vỡ vy, ng nghim lm PCR cn cú y nguyờn vt liu cn thit vic chộp gen v khuch i gen c m bo - Dung dch m cú Tris-HCl, KCl, MgCl theo t l nht nh Trong ú, MgCl2 l mt nhng thnh phn quan trng nht ca PCR nng ca cht ny nh hng n s c hiu v hiu sut ca phn ng Thng nng ti u DNA polymerase hot ng tt l 1,2-1,3 mM Mg2+ t [17] - dNTPs gm loi dNTP l A, T, G, C Dung dch ny ó c pha sn vi nng phõn t bng Nng ca cỏc dNTP c trỡ khong 50-200 àM [17] õy l nng ti u cho vic DNA polymerase hot ng t hiu qu tt nht - Mi: gm loi l mi xuụi v mi ngc Phc hp mi ny l cỏi khuụn vic tng hp chớnh xỏc on gen cn khuch i lờn Do ú, mi ny m bo mt s nguyờn tc: + Chiu di: 20-30 nucleotid + Cú s lng tng ng nucleotid + Trỏnh lp li trỡnh t nucleotid + Trỏnh cú G hoc C u + Trỏnh hỡnh thnh cu trỳc bc 10 + Trỡnh t nucleotid u khụng c liờn kt b sung vi hoc vi cỏc mi khỏc hỡnh thnh nờn phc hp mi - DNA polymerase: l enzym kộo di chui theo nguyờn tc b sung Khi cõn nhc la chn DNA polymerase cho PCR, ngi ta thng cõn nhc ti yu t: s chớnh xỏc v hiu sut phn ng m bo c iu trờn, DNA polymerase phi chu c nhit cao, cho phộp vic lp li nhiu ln chu k ca PCR m ch cn b sung mt ln nht enzym ny vo thi im bt u phn ng Ngy nay, ngi ta thng s dng Taq DNA polymerase Enzym ny cú nhit ti u vo khong 72-75C [17] Tuy nhiờn, Taq DNA polymerase khụng cú hot tớnh sa cha nờn cỏc sai sút quỏ trỡnh kộo di s khụng c khc phc - Acid nucleic khuụn l DNA, RNA hoc cDNA c tỏch chit, tng hp t mỏu, mụ hoc dch c th, Dung dch c trn u v cho vo chu trỡnh nhit thớch hp bt u quỏ trỡnh chộp, khch i gen Quỏ trỡnh PCR gm giai on chớnh khỏc v c iu hũa bi nhit : Giai on (bin tớnh): DNA khuụn s c bin tớnh nhit cao m ti ú cu ni hydrogen ni si DNA b phỏ v Phõn t DNA t dng si kộp tỏch thnh si n ( 94C - 95C vũng 30-60 giõy) Trc chu k 1, DNA thng c bin tớnh n thi gian m chui m bo mu DNA v mi c phõn tỏch hon ton v ch cũn dng si n Giai on (gn mi): Nhit h thp di nhit núng chy Tm (temperature melting) ca cỏc mi (khong 40C - 72C tựy thuc mi s dng) cho phộp cỏc mi bt cp vi cỏc si n DNA khuụn theo nguyờn tc b sung S dng sai nhit giai on ny dn n vic on mi khụng gn hon ton vo DNA mu, hay gn mt cỏch tựy tin dn n sai lch kt qu Thi gian cho giai on ny khong 30-60 giõy 35 phi hn ch ti a hot ng ca cỏc enzym ny: thao tỏc iu kin vụ trựng v trờn ỏ lnh, cỏc dng c c x lý bng nhit hoc kh trựng bng DEPC (Diethylpyrocarbonat) v trỏnh mi tip xỳc vi tay trn RNA cú mt tt c cỏc t bo c th cho nờn RNA cú th c tỏch t tt c t bo y Thng cỏc nghiờn cu khoa hc, RNA c tỏch chit t mỏu, dch c th, mụ ti, mụ ó tm parafin, Trong nghiờn cu ny, chỳng tụi thc hin tỏch chit RNA t mu mụ d dy ti, c tin hnh thu thp sau phu thut v c bo qun -80C Vic s dng mu mụ d dy ti s thu c lng RNA cú nng cao hn so vi vic dựng mu mụ ó ỳc paraffin Mu mụ c ỳc paraffin, sau thi gian mụi trng lõu ngy, s lm cho RNA b phõn hy Tuy nhiờn, vic tin hnh thu mu mụ ti cũn gp nhiu khú khn, cn cú s phi hp gia lõm sng v cn lõm sng Trong nghiờn cu ny, chỳng tụi s dng b tỏch chit RNA t mụ ti ca QUAGEN: Rnase Mini Kit B sn phm ny ca QUAGEN c ỏnh giỏ khỏ cao v kt qu tỏch chit v cú giỏ thnh phự hp vi nghiờn cu ny So vi phng phỏp Trizol thỡ nguyờn lý l hon ton ging nhau, gm bc c bn: (1) phỏ mng t bo, (2) loi b protein, (3) ta RNA Nhng bng cỏch s dng ct lc v cỏc húa cht tỏch chit c pha sn vi t l thớch hp nờn vic tỏch chit bng b kit ny din nhanh hn v tinh sch hn Mt mu bnh phm bỡnh thng tỏch bng phng phỏp Trizol mt khong ting, thỡ s dng b ny ch cn ht 30 phỳt Vic gim thi gian tỏch chit giỳp tng hiu qu cụng vic, RNA trỏnh b phõn hy v trỏnh b nhim t bờn ngoi Tuy rng, b sn phm ny cú u im rt tt nh trờn nhng nú cũn mt s nhc im Do mng li ct lc cha mt lng cht nn cú tỏc dng bt gi RNA nht nh, nờn lng RNA thu c ch nm mt khong nht nh v khụng th thu c RNA nng 36 cao nh i vi phng phỏp Trizol Bờn cnh ú, giỏ thnh ca kit ny cng khỏ l cao hn so vi húa cht ca phng phỏp Trizol Tt c RNA, sau tỏch chit, c xỏc nh nng v kim tra tinh sch bng cỏch o mt quang trờn mỏy Nanodrop 2000c Nguyờn tc ca phng phỏp ny l da vo s hp th mnh ỏnh sỏng ca mt cht bc súng nht nh Nucleic acid hp th mnh ỏnh sỏng t ngoi bc súng 260 nm nh s cú mt ca base purine v pyrimidine Giỏ tr mt quang ti bc súng 260 nm ca cỏc mu cho phộp xỏc nh nng ca RNA mu kim tra tinh sch ca sn phm, ngi ta o thờm giỏ tr OD bc súng 280 nm bc súng ny, cỏc protein cú mc hp th cao nht T l OD260/280 biu th mc protein cũn li dch chit RNA c gi l tinh sch t l ny > Kt qu tỏch chit bng 3.1 cho thy phng phỏp tỏch chit phng phỏp tỏch chit RNA nghiờn cu thu c sn phm cú cht lng tt, m bo nng v tinh sch cn thit cho phn ng tip theo 4.2 KT QU TNG HP CDNA V PCR Quỏ trỡnh tng hp cDNA t RNA c thc hin bi enzym phiờn mó ngc theo hng dn ca nh sn xut Sn phm cDNA ca cỏc mu c kim tra cht lng bng phn ng PCR khuch i on gen GAPDH v on gen GAS5 vi cp mi c hiu GAPDH hin din mi t bo ca c th, cú kh nng mó húa protein cú chc nng xỳc tỏc mt bc quan trng chu trỡnh chuyn húa carbonhydrat nờn khụng chu nh hng bi ung th d dy, c xem l gen ni chun v dựng so sỏnh cht lng DNA cng nh cDNA Do mi c hiu ca gen GAS5 l mi hon ton mi, ln u tiờn s dng, cha c kim tra v chun nhit gn mi phự hp, cho nờn, ngoi vic kim tra cht lng cDNA, phn ng PCR ny cng nhm mc ớch chun nhit gn mi v kim tra cht lng mi GAS5 37 thc hin iu ú, ngoi phng phỏp PCR, chỳng ta cú th thc hin bng Realtime PCR Mc dự Realtime PCR s giỳp tit kim v mt thi gian, trỏnh lai nhim chộo nhng húa cht s dng cho li t hn so vi húa cht ca PCR, khụng phự hp v mt kinh t Sau thc hin PCR, cỏc sn phm c kim tra bng phng phỏp in di trờn gel Agarose 1,5% nhum Ethidium bromide v soi bng tia t ngoi cDNA cú nguyờn cao cỏc bng cDNA trờn bn gel trung, rừ nột tinh sch c ỏnh giỏ bi s bng trờn ng in di, cDNA cú tinh sch cao thỡ trờn hỡnh nh in di ch cú mt bng nht So sỏnh v trớ bng cDNA trờn mu bnh nhõn vi marker ỏnh giỏ c hiu ca mi v nhit gn mi Hỡnh 3.2 cho thy ch cú nht mt bng sỏng, gn trờn mt ng in di tng ng vi v trớ on gen kớch thc 137 bp i vi gen GAS5 v 307 bp i vi gen GAPDH, c hiu cho kớch thc ca cp gen ó t Nh vy, sn phm PCR t yờu cu: cDNA tinh sch, nguyờn v c hiu chng t cht lng RNA tỏch chit tt v cht lng cDNA c tng hp tt, ỏp ng tiờu chun cho cỏc thớ nghim tip theo; nhit gn mi 59C l c hiu cho cp mi ca gen GAS5 v GAPDH, cht lng mi tt 4.4 KT QU REALTIME PCR ỏnh giỏ mc biu hin ca LncRNA GAS5 mu nghiờn cu, chỳng tụi tin hnh Realtime PCR xỏc nh chu k ngng vi SYBR Green lm cht phỏt hunh quang Phn ng c tin hnh trờn mỏy Realtime PCR Eppendorf Realplex4 Phn ng Realtime PCR c phỏt trin lờn t PCR, khỏc bit phn ng Realtime PCR cú s dng thờm u dũ phỏt hin s lng bn c nhõn lờn tng chu k Trong cỏc phũng nghiờn cu, loi u 38 dũ thng c s dng l u dũ SYBR Green v Taqman Tựy vo tng mc ớch nghiờn cu m ngi ta la chn loi u dũ phự hp Taqman l u dũ oligonucleotid, cú nhy v c hiu cao Taqman thng c s dng cỏc nghiờn cu ũi hi chớnh xỏc cao, nh biu hin gen, PCR a mi, nh lng DNA, phõn tớch protein, t bin gen, SYBR Green thng c s dng cỏc nghiờn cu v mc biu hin gen, vi c mu ln Trong nghiờn cu ny, chỳng tụi ch quan tõm n chu k ngng ca tng on gen mu bnh phm Vỡ vy, chỳng tụi s dng u dũ SYBR Green Bờn cnh ú, SYBR Green cũn tit kim v mt chi phớ hn so vi Taqman Kt qu Realtime PCR c minh hỡnh 3.3 cho thy, ng nn tt, tớn hiu hunh quang rừ nột, liờn tc, khụng b t góy Tng hp li chu k ngng ca tng mu bnh phm bng 3.2, chỳng tụi thy rng chu k ngng ca cỏc mu bnh phm nm khong t 25-33 chu k Trong tng mu bnh phm, chu k ngng ca gen GAS5 cao hn so vi GAPDH, phự hp vi c s lý thuyt ó c nờu Kt qu nh vy phự hp tin hnh so sỏnh, ỏnh giỏ mc biu hin ca LncRNA GAS5 ung th biu mụ d dy 4.5 KT QU NH GI MC BIU HIN LNCRNA GAS5 TRONG BNH UNG TH BIU Mễ D DY Bng phn ng Realtime PCR v cụng thc Delta delta Ct ca Livak, bc u chỳng tụi ó xỏc nh c mc biu hin ca LncRNA GAS5 mụ ung th d dy, c trỡnh by bng 3.2 Chỳng tụi thy rng, hu ht cỏc mu bnh phm u cú mc biu hin LncRNA GAS5 mụ ung th gim so vi mụ lnh Tuy nhiờn, mc gim y khụng ng u tng bnh nhõn Mc gim thp nht l 1,56 ln v mc gim cao nht l 13,27 ln Giỏ tr gim trung bỡnh l 4,7 ln 39 Trong nghiờn cu ca Ming Sun c tin hnh trng i hc Y khoa Nam Kinh, Trung Quc c tin hnh 89 bnh nhõn ung th d dy ó c phu thut ti bnh viờn Giang Tụ t nm 2006-2008 Trong nghiờn cu trờn, Ming Sun v cỏc cng s ó cho kt qu mc biu hin ca gen GAS5 mụ ung th gim so vi mụ lnh, vi mc biu hin gen GAS5 ca mụ ung th ch bng 0,38 mụ lnh [18] Tc l mc biu hin ca mu mụ ung th gim 2,63 ln so vi mụ lnh Mc gim ca LncRNA GAS5 nghiờn cu ca chỳng tụi so vi nghiờn cu ca Minh Sun cú s khỏc bit, cú th c mu chỳng tụi s dng nh hn cng nh cú s khỏc bit v c im dch t, chng tc, a lý v húa Khụng ch ung th d dy, mc biu hin ca LncRNA GAS5 cỏc ung th khỏc cng cú s gim ỏng k Trong nghiờn cu ca Cao S v cng s ó ch rng, mc biu hin ca LncRNA GAS5 ung th c t cung gim so vi mụ lnh, gim trung bỡnh l 3,45 v gim ny c cho l mt yu t tiờn lng bnh ung th c t cung [20] bnh ung th gan, nghiờn cu ca Tu ZQ v cng s ó ch rng mc biu hin ca LncRNA GAS5 cng gim, ú cú 51/71 gim nh, giỏ tr gim l 0,19; 20/71 gim nng, giỏ tr gim l 0,68 [21] V LncRNA GAS5 cng c cho l yu t tiờn lng v ỏnh giỏ giai on cho ung th gan [21] So vi cỏc nghiờn cu khỏc trờn th gii thỡ nghiờn cu ny ca chỳng tụi cha ỏnh giỏ c mi quan gia mc biu hin LncRNA GAS5 vi giai on bnh lõm sng cng nh tiờn lng bnh Do ú, mc biu hin ca gen GAS5 tng bnh nhõn cú tng mc gim ớt v nhiu khỏc cú th cỏc din bin v giai on ung th ca tng bnh nhõn khỏc Vn ny cn phi kt hp nghiờn cu lõm sng cú nhng ỏnh giỏ chớnh xỏc hn 40 KT LUN T kt qu thu c nghiờn cu, chỳng tụi a kt lun sau: Mc biu hin ca LncRNA GAS5 gim khong 4,7 ln mụ ung th biu mụ d dy so vi mụ lnh nm cỏch mụ ung th cm TI LIU THAM KHO ỡnh Cụng (2003) Nguyờn nhõn chn oỏn mun ung th biu mụ tuyn d dy Y hc TP H Chớ Minh, 7(1), 6-9 Chapter 1.1 World Cancer Report 2014 World Health Organization Trn Thin Trung (2014) Ung th d dy, nh xut bn Y hc, H Ni Nguyn Th Xuyờn (2012) Mt s bnh ung th thng gp, nh xut bn Y hc, H Ni Nguyn Bỏ c (2008) Chn oỏn v iu tr bnh ung th, nh xut bn Y hc, H Ni Nguyn Bỏ c (1997) Bi ging ung th hc, nh xut bn Y hc, H Ni Lờ ỡnh Roanh (2001) Bnh hc cỏc u, nh xut bn Y hc, H Ni Nguyn Vn Thanh (2014) Sinh hc phõn t, nh xut bn Giỏo dc Vit Nam, H Ni Trnh Vn Bo, Trn Th Thanh Hng, Phan Th Hoan (2009) Sinh hc, nh xut bn Giỏo dc Vit Nam, H Ni 10 Costa, F F (2010) Non-coding RNAs: Meet thy masters, Bioessays, 32, 599-608 11 Maciej Szymanski, Volker A Erdmann, Jan Barciszewski (2007) Noncoding RNAs database Nucleic Acids Research, 35, 162-164 12 Veronica J Peschansky, Claes Wahlestedt (2014) Non-coding RNAs as direct and indirect modulators of epigenetic regulation Epigenetics, 9(1), 3-12 13 Johnny T Y Kung, David Colognori, Jeannie T Lee (2013) Long Noncoding RNAs: Past, Present, and Future Genetics, 193(3), 651669 14 Jin-Wu Nam, David P Bartel (2012) Long noncoding RNAs in C elegans Genome Res, 22(12), 25292540 15 Lei Chang, Cuicui Li, Tian Lan and el al (2016) Decreased expression of long non-coding RNA GAS5 indicates a poor prognosis and promotes cell proliferation and invasion in hepatocellular carcinoma by regulating vimentin Molecular Medicine Reports, (13), 1541-1550 16 Trnh Vn Bo, Trn Th Thanh Hng (2010) Di truyn Y hc, nh xut bn Giỏo dc Vit Nam, H Ni 17 T Thnh Vn (2010) PCR v mt s k thut Y sinh hc phõn t, nh xut bn Y hc, H Ni 18 Ming Sun, Fei-yan Jin, Rui Xia and el al(2014) Decreased expression of long noncoding RNA GAS5 indicates a poor prognosis and promotes cell proliferation in gastric cancer BMC Cancer, 14, 319-361 19 Smith CM, Steitz JA (1998) Classification of GAS5 as a multi-smallnucleolar-RNA (snoRNA) host gene and a member of the 5'-terminal oligopyrimidine gene family reveals common features of snoRNA host genes Mol Cell Biol, 18(12):6897-909 20 Cao S, Liu W, Li F and el al, (2014) Decreased expression of lncRNA GAS5 predicts a poor prognosis in cervical cancer Int J Clin Exp Pathol, 7(10), 6776-6783 21 Tu ZQ, Li RJ, Mei JZ and el al, (2014) Down-regulation of long noncoding RNA GAS5 is associated with the prognosis of hepatocellular carcinoma.Int J Clin Exp Pathol, 7(7), 4303-4309 22 T Vn Tranh (2011) Phỏt hin vi khun Poorphyromonas Gingivalis gõy bnh viờm nha nhu bng k thut Realtime PCR Khúa lun tt nghip c nhõn Y khoa, H Ni 23 Stồhlberg, Hồkansson, Xian and el al (2004) Properties of the reverse transcription reaction in mRNA quantification Clin Chem 50, 509515 24 Michael K Udvardi, Tomasz Czechowski, Wolf-Rỹdiger Scheible (2008) Eleven Golden Rules of Quantitative RT-PCR Plant Cell, 20(7), 17361737 25 Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods, 25(4), 402-408 26 Lờ c Trỡnh (2001) Sinh hc phõn t ca t bo Nh xut bn Khoa hc v K thut, H Ni 27 Kumar, et al (2010) Pathologic Basis of Disease Saunders Elsevier, 8, 784 28 Chomczynski P, Sacchi N (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal Biochem, 162(1):156-9 29 Nguyn Nghiờm Lut (2003) Thc Húa Sinh Nh xut bn Y hc, H Ni B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC Y H NI NGUYN TRN THANH HNG ĐáNH GIá MứC Độ BIểU HIệN CủA LNCRNA GAS5 TRONG BệNH UNG THƯ BIểU MÔ Dạ DàY KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA Khúa 2012 2016 Giỏo viờn hng dn: TS Nguyn Trng Tu H NI 2016 LI CM N hon thnh khoỏ lun ny, tụi xin c by t s kớnh trng v bit n sõu sc ti TS Nguyn Trng Tu, ngi thy ó tn tỡnh hng dn, ch bo, sa cha v gúp ý cho tụi hon thnh khúa lun Tụi xin chõn thnh cm n GS.TS T Thnh Vn, giỏm c trung tõm nghiờn cu Gene-Protein; PGS.TS Trn Võn Khỏnh, trng b mụn Bnh hc phõn t, phú giỏm c trung tõm nghiờn cu Gen-Protein, Trng i hc Y H Ni l nhng ngi thy ó to u kin, ng viờn v h tr tụi quỏ trỡnh thc hin khoỏ lun Tụi xin gi li cm n ti CN Trnh Thanh Hng, cựng th cỏc anh ch lm vic ti trung tõm nghiờn cu Gen-Protein, Trng i hc Y H Ni ó giỳp v ch bo tụi v mt k thut cng nh cuc sng sut thi gian tụi lm khoỏ lun ti trung tõm Nhng hng dn ca anh ch khụng ch giỳp tụi cú nhng s liu ý ngha cho nghiờn cu ny m cũn cho tụi nhiu kinh nghim, giỳp tụi cú c hi nõng cao tay ngh Tụi xin chõn thnh cm n ng y, Ban giỏm hiu, phũng o to i hc v B mụn Bnh hc phõn t, trung tõm nghiờn cu Gen-Protein, Trng i hc Y H Ni ó giỳp v to iu kin thun li cho tụi sut quỏ trỡnh hc v thc hin nghiờn cu khoa hc ny Cui cựng, tụi xin cm n tt c ngi thõn bn bố ó ng viờn, giỳp tụi sut quỏ trỡnh hc v nghiờn cu tụi cú th hon thnh lun ny Nguyn Trn Thanh Hng BNG K HIU VIT TT STT Kớ hiu 10 11 12 13 Lnc RNA GAS5 PCR Bp cDNA mRNA ncRNA DNA dNTP RT-PCR LncRNA Ct í ngha Long Non-coding Ribonucleic acid Growtharrest-specific5 Polymerase Chain Reaction Base pair Complementary Deribonucle acid Messenger Ribonucleic acid (RNA thụng tin) Noncoding RNA (RNA khụng mó húa protein) Deribonucleic acid Deoxynucleoside triphosphate Reverse Transcription PCR Long non coding RNA Cycle threshold (chu k ngng) DANH MC HèNH V DANH MC BNG DANH MC BIU MC LC 11,14-16,22,29-31 1-10,12,13,17-21,23-28,32- [...]... 0.72 1.65 Biểu đồ 3.1 Biểu đồ đánh giá mức độ biểu hiện LncRNA GAS5 của mẫu mô ung thư sơ với mẫu mô lành dạ dày Nhận xét: Tất cả các bệnh nhân đều có mức độ biểu hiện của lncRNA GAS5 trong mẫu ung thư dày đều giảm 33 Độ giảm cao nhất ở cặp mẫu số 12 giảm 13,27 lần, độ giảm thấp nhất ở cặp mẫu số 5 giảm 1,56 lần Độ giảm trung bình là 4,7 lần 34 Chương 4 BÀN LUẬN Ung thư dạ dày là loại ung thư thường... 95ºC trong 2 phút Biến tính: 95ºC trong 30 giây Gắn mồi: 59ºC trong 30 giây Kéo dài: 72ºC trong 30 giây lặp lại 40 chu kỳ 72ºC trong 2 phút Giữ 15ºC 2.4.8 Phương pháp xác định mức độ biểu hiện LncRNA GAS5 Để đánh giá mức độ biểu hiện của LncRNA GAS5 của mẫu mô bệnh so với mẫu mô dạ dày bình thư ng, trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng công thức Delta delta Ct của Livak Mức độ biểu hiện của LncRNA GAS5. .. tài nghiên cứu này là bệnh nhân đã được chẩn đoán là ung thư biểu mô dạ dày được nhập viện và điều trị tại khoa U bướu, Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01/2016 Tiêu chuẩn chọn lựa: bệnh nhân ung thư dạ dày được phẫu thuật tại Bệnh viện Bạch Mai và có chẩn đoán giải phẫu bệnh là ung thư biểu mô tuyến Tiêu chuẩn loại trừ: ung thư dạ dày di căn từ cơ quan khác đến hoặc có một ung thư khác phối hợp với ung thư. .. LncRNA GAS5 trong mô ung thư so với mô lành giảm 2ΔΔCt lần Trong đó: ΔΔCt = ΔCt1 – ΔCt2 ΔCt1 = Ct (GAS5- B) – Ct(GAPDH-B) ΔCt2 = Ct (GAS5- A) – Ct(GAPDH-A) Với: B là mẫu mô ung thư dạ dày A là mẫu mô lành dạ dày 27 SƠ ĐỒ Mẫu mô bệnh và mẫu mô lành Kết quả giải phẫu bệnh Tách chiết RNA Tổng hợp cDNA Chuẩn hóa phản ứng PCR Realtime PCR Đánh giá mức độ biểu hiện NGHIÊN CỨU 28 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT... tiến hành lấy bệnh phẩm - Cách lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm được lấy bởi bác sĩ lâm sàng gồm 2 mảnh dạ dày gồm 1 mảnh ở vùng mô bệnh và 1 mảnh ở vùng mô lành cách mô bệnh 5cm Mảnh mô bệnh của bệnh nhân được Giải phẫu bệnh chuẩn đoán xác định là mô ung thư biểu mô dạ dày - Bệnh phẩm lấy xong được cho vào ống nghiệm và được bảo quản trong đá lạnh rồi chuyển về phòng xét nghiệm của Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein... lành giảm 2ΔΔCt lần Trong đó: ΔCt1 = Ct(gen nghiên cứu ở mô lành) – Ct(gen tham chiếu mô lành) ΔCt2 = Ct(gen nghiên cứu ở mô bệnh) – Ct(gen tham chiếu ở mô bệnh) => ΔΔCt = ΔCt1 – ΔCt2 18 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Thời gian và địa điểm Đề tài nghiên cứu này được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu GeneProtein trường đại học Y Hà Nội, trong thời gian từ... đoán ung thư dạ dày sớm còn gặp nhiều khó khăn do các triệu chứng lâm sàng của ung thư dạ dày không điển hình, dễ nhầm lẫn với triệu chứng của các bệnh lành tính khác Do đó, việc phát triển các kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhằm phát hiện sớm ung thư dạ dày là cần thiết trong chẩn đoán, tiên lượng và điều trị Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để đánh giá sự biểu hiện. .. trong sự tổng hợp của một sản phẩm gen chức năng Những sản phẩm này thư ng là 17 các protein, nhưng trong các gen không mã hóa protein như tRNA, snRNA thì sản phẩm ở đây là các chuồi polypeptid Để đánh giá mức độ biểu hiện gen, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp Delta delta Ct của Livak [25] Công thức được tính như sau: Mức độ biểu hiện của gen nghiên cứu trong mẫu mô bệnh so với mô. .. bào ấy Thư ng trong các nghiên cứu khoa học, RNA được tách chiết từ máu, dịch cơ thể, mô tươi, mô đã tẩm parafin,… Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện tách chiết RNA từ mẫu mô dạ dày tươi, được tiến hành thu thập ngay sau khi phẫu thuật và được bảo quản ở -80ºC Việc sử dụng mẫu mô dạ dày tươi sẽ thu được lượng RNA có nồng độ cao hơn so với việc dùng mẫu mô đã đúc paraffin Mẫu mô được đúc trong. .. của bệnh nhân ung thư dạ dày có nồng độ > 30 ng/µl, độ tinh sạch > 2 Nồng độ và độ tinh sạch như vậy là đủ điều kiện để tiến hành các phản ứng tiếp theo 3.2 KẾT QUẢ CHUẨN HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN PCR Để tiến hành nghiên cứu mức độ biểu hiện của LncRNA GAS5 bằng Realtime PCR, chúng tôi tiến hành chuẩn hóa các điều kiện cho phản ứng PCR Cặp mồi GAS5 là cặp mồi thiết kế mới do vậy chúng tôi chuẩn hóa nhiệt độ