Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh salmonella typhi

Để hiểu rõ hơn dịch tễ học toàn cầu của salmonellosis và tỷ lệ các chương trình giám sát quốc gia cho Salmonellanhiễm trùng ở người, Tổ chức Y tế Thế giới WHO phối hợp với Trung tâm Kiể

ĐỖ NHƢ HOA

SỬ DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH

Salmonella typhi

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015

ĐỖ NHƯ HOA

SỬ DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH

Salmonella typhi

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn : 1 TS Nguyễn Văn Duy,

2 ThS Trần Đình Quang

Thái Nguyên, năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn Văn Duy, ThS Trần Đình Quang khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn trực tiếp đề tài, các thầy đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài này

Tôi xin được cảm ơn anh Lã Văn Hiền cán bộ phòng thực hành Sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền khoa CNSH & CNTP cũng các bạn sinh viên khoa CNSH & CNTP làm nghiên cứu tại phòng

Tôi xin được cảm ơn TS Nguyễn Đắc Trung bộ môn cơ sở Đại học Y Dược Thái Nguyên, cô Phạm Thị Phương giảng viên khoa CNSH & CNTP đã cung cấp chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài này Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã dạy

dỗ chúng tôi trong suốt thời gian qua, cảm ơn các cán bộ đang công tác tại phòng thí nghiệm khoa CNSH & CNTP đã tạo môi trường thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ, thầy cô, bạn bè đã ủng hộ về mặt vật chất cũng như tinh thần giúp tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Đỗ Như Hoa

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ/thuật ngữ

viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ/thuật ngữ

μl Microlit (1 μl = 10-3

ml)

CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide

DNA Deoxyribonucleic acid - Một trong 2 loại nucleic

acid

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phương

pháp huỳnh quang miễn dịch liên kết enzyme)

PCR

Polymerase Chain Reaction: phản ứng tổng hợp chuỗi polyme (Phản ứng khuếch đại DNA trong

ống nghiệm)

RADP Random amplified polymorphic DNA (phân tích

tính đã hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên)

PFGE Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Điện di trường

xung)

MLPA Multiplex ligation Dependent probe amplification

(khuếch đại phụ thuộc mẫu dò)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Phân loại Salmonellavà vật chủ theo danh pháp Kauffmann - White 7

Bảng 2.2 Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella 9

Bảng 3.1: Các cặp mồi được thiết kế 27

Bảng 4.1: Các thông số kỹ thuật của cặp mồi được thiết kế 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 4.1 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số của các

mẫu Salmonella Typhi 34

Hình 4.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại bởi cặp mồi ViaBF-ViaBR và TF-TR 33Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đơn sử dụng các cặp mồi riêng rẽ 35Hình 4.4 Kết quả diện di kiểm tra sản phẩm PCR đơn sử dụng các cặp mồi riêng rẽ ở các điều kiện khác nhau 37Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR 39Hình 4.6 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR ở các nồng độ DNA khuôn khác nhau 41Hình 4.7 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR với các chủng vi khuẩn kiểm định khác nhau 43

MỤC LỤC

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tình hình nhiễm bệnh do Salmonella Typhi 4

2.1.1 Trên thế giới 4

2.1.2 Tại Việt Nam 5

2.2 Đại cương về Salmonella Typhi 6

2.2.1 Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi 6

2.2.2 Đặc điểm cấu trúc 8

2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 8

2.2.4 Khả năng biến dị di truyền 9

2.2.5 Tính chất nuôi cấy 9

2.2.6 Sức đề kháng 10

2.2.7 Độc tố 10

2.2.8 Bệnh học sốt thương hàn do Salmonella Typhi 10

2.3 Các phương pháp phát hiện nhanh Salmonella Typhi 12

2.3.1 Phát hiện Salmonella Typhi bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống 12

2.3.2 Phát hiện Salmonella bằng phương pháp Phage Typing 14

2.3.3 Phương pháp phân tích tính đã hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên (Random amplified polymorphic DNA - RAPD) 15

2.3.4 Phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

(Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA) 16

2.3.5 Phương pháp PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) - Điện di trường xung 17

2.3.6 Phương pháp khuếch đại phụ thuộc mẫu dò (Multiplex ligation - Dependent probe amplification - MLPA) 18

2.4 Các chỉ thị phân tử phát hiện nhanh Salmonella Typhi 19

2.5 Tổng quan phương pháp multiplex PCR 20

2.5.1 Khái niệm multiplex PCR 20

2.5.2 Ưu và nhược điểm của multiplex PCR 22

2.5.3 Ứng dụng của multiplex PCR trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh 23

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 26

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 26

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 26

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 26

3.2.2 Thời gian tiến hành 26

3.3 Hóa chất và thiết bị và vật liệu 26

3.3.1 Hóa chất 26

3.3.2 Thiết bị 27

3.3.3 Vật liệu 27

3.4 Nội dung nghiên cứu 28

3.5 Phương pháp nghiên cứu 28

3.5.1.Lựa chọn các cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR 28

3.5.2 Tách chiết DNA tổng số 28

3.5.4 Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh Salmonella Typhi 29

3.5.5 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR 30

3.5.6 Xác định độ đặc hiệu của phản ứngmultiplex PCR 31

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

4.1 Kết quả lựa chọn cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh Salmonella Typhi 32

4.2 Kết quả tách chiết DNA tổng số của Salmonella Typhi 34

4.3 Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu trong phản ứng PCR đơn sử dụng các cặp mồi riêng rẽ 35

4.4 Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu của phản ứng multiplex PCR 37

4.5 Xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh Salmonella Typhi 41

4.6 Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh Salmonella Typhi 42

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

I Tài liệu tiếng việt 46

II Tài liệu tiếng anh 48

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Thương hàn là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây bằng đường tiêu

hóa, do trực khuẩn Salmonella Typhi gây nên Biểu hiện lâm sàng là hội

chứng nhiễm khuẩn nhiễm độc toàn thân, kèm theo tổn thương bệnh lý đặc hiệu tại đường tiêu hóa Theo ước tính có 75% trường hợp ở người mắc phải

bệnh do Salmonella là do ăn phải những thức ăn bị nhiễm khuẩn bao gồm thịt

bò, thịt heo, thịt gia cầm và trứng Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN: 7926-2008 Thịt và sản phẩm của thịt và TCVN 6040: 2007 Vi sinh vật trong thực phẩm

và thức ăn gia súc) yêu cầu lượng Salmonella trong 25 g thực phẩm là 0 [12]

Các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm đã nổi lên như một vấn đề y tế

công cộng quan trọng ở nhiều nước trong thập kỷ qua.Salmonella Typhi gây bệnh thương hàn của hơn 16 triệu người trên thế giới, và khoảng 600.000 ca

tử vong mỗi năm [27] Để hiểu rõ hơn dịch tễ học toàn cầu của salmonellosis

và tỷ lệ các chương trình giám sát quốc gia cho Salmonellanhiễm trùng ở

người, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phối hợp với Trung tâm Kiểm Soát và Ngừa Bệnh Hoa Kỳ (CDC), WHO phối hợp với Giám sát Thực Phẩm Gây Bệnh, đã tiến hành một cuộc khảo sát toàn cầu các phòng thí nghiệm y tế

công cộng quốc gia để tìm hiểu về thực hiện liên quan đến Salmonella serotyping và để xác định Salmonella thường được phân lập hầu hết type

huyết thanh từ con người vào năm 1990 - 1995 [31]

Hiện nay đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện vi

khuẩn Salmonella Typhi, phương pháp nuôi cấy truyền thống luôn luôn bao

gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra làm mất nhiều thời gian từ 5 đến 7 ngày [12] Những tiến bộ của các kỹ thuật sinh học phân

tử đã và đang cho phép phát triển những phương pháp kiểm tra rất nhạy và

nhanh sự hiện diện của các dòng vi khuẩn mà không cần đến giai đoạn nuôi cấy tách dòng như: lai DNA, kỹ thuật PCR, ELISA, RADP nhưng những phương pháp này hầu hết có chi phí tốn kém, độ chính xác không cao và đòi hỏi mật độ vi sinh vật gây bệnh đủ lớn

Phương pháp multiplex PCR đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong thực tế phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh Theo Nguyễn Tuấn Anh đã nghiên cứu „„xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện một số vi khuẩn gây tiêu chảy cấp ở lợn“ đăng tải trên tạp chí sinh học 2014, kết quả thử nghiệm quy

trình bao gồm mẫu từ phân, mô lợn sơ sinh cho thấy tỉ lệ nhiễm Salmonella spp

là 4% [1] Theo Nargess Safari Foroshani, 2013 “Đồng thời và nhanh chóng phát

hiện Salmonella Typhi, Bacillus anthracis và Yersinia pestis bằng cách sử dụng

mutiplex PCR“ cho kết quả có tính đặc hiệu và khẳng định tính chính xác caocủa

multiplex PCR và mồi trong đó là cặp mồi đặc hiệu của vi khuẩn Yersinia

pestis, Bacillus anthracis, và Salmonella Typhi

Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của Khoa CNSH & CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh Salmonella Typhi”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Salmonella Typhi bằng kỹ

thuật multiplex PCR

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

- Lựa chọn được các cặp mồi đặc hiệu cho Samonella Typhi

- Tối ưu được phản ứng mutiplex PCR phát hiện nhanh Samonella

Typhi

- Xác định được độ nhạy của kỹ thuật multiplex PCR phát hiện

SamonellaTyphi

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Samonella Typhi bằng kỹ

thuật multiplex PCR

- Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán

nhanh và đặc hiệu Salmonella Typhi

1.4.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

- Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Samonella Typhi góp phần

giám sát sức khỏe cộng đồng thông qua phát hiện sớm vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm này từ các nguồn bệnh phẩm, thực phẩm

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nhiễm bệnh do Salmonella Typhi

2.1.1 Trên thế giới

Nhiễm khuẩn Salmonella và sốt thương hàn vẫn là một vấn đề y tế

công cộng quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các nước đang

phát triển.Ngộ độc do nhiễm vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện cách đây hơn 100 năm, Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh cho

người và súc vật truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt (heo, bò, gia cầm…) và các sản phẩm của thịt, trứng, và các sản phẩm của trứng Mỗi năm,

Salmonella gây 93.800.000 nhiễm bệnh ở người và 155.000 ca tử vong trên

oàn thế giới.Sự phân bố của các phân loài Salmonella khác nhau thì khác

nhau giữa các nước và khu vực Mặt khác, WHO ước tính 17 triệu trường hợp

sốt thương hàn hàng năm, Salmonella enterica serovarTyphi (S Typhi) là sinh

vật chủ yếu phân lập trong nhiều thập kỷ qua [39] Ở Đan Mạch 1995 có 2911

trường hợp bị nhiễm Salmonella, trong đó có 19% gây bệnh thương hàn do ăn

thức ăn là trứng và các sản phẩm của trứng bị nhiễm vi khuẩn này Ở Mỹ hàng năm có khoảng 4000 trường hợp bị bệnh do thực phẩm bị nhiễm

Salmonella[26].Ở Indonesia, tỷ lệ mắc bệnh thương hàn là 1487 nghìn người

mỗi năm.Năm 2001 nghiên cứu của Swanen Burg và cộng sự cho thấy 26%

thịt lợn nhiễm Salmonella Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là các vi khuẩn thương hàn, trong đó hàng đầu là Salmonella Typhi

Ở Đông Nam Á và châu Phi, với ước tính hơn 20 triệu bệnh nhân và hơn 200.000 trường hợp tử vong do sốt thương hàn và hơn 5 triệu bệnh do sốt phó thương hàn vào năm 2000[29]

Ở Mỹ hàng năm ước tính có khoảng 1,4 triệu người nhiễm trùng

Salmonella không phải thương hàn đã đưa đến 168000 lượt khám, 15000 lượt

điều trị nội trú và 580 ca tử vong Chi phí ước tính cho mỗi ca nhiễm

Salmonellaở người dao động trong khoảng từ 40 đô la Mỹ đến 4,6 triệu đô la

Mỹ tương ứng với từ các ca đơn giản đến các ca phải nhập viện và tử vong

Tổng chi phí liên quan đến Salmonella hàng năm ở Mỹ vào khoảng 3 tỷ đô la [26].Ở Đan Mạch, ước tính chi phí hàng năm cho các bệnh về Salmonellado

ngộ độc thực phẩmlà khoảng 15,5 triệu đôla Mỹ (2001) tương đương với

khoảng 0,009% GDP Một chương trình khống chế Salmonella đã thực hiện

vài năm ở Đan Mạch với chi phí hàng năm cho chương trình khoảng 14,1 triệu đola Mỹ, ước tính chương trình này đã tiết kiệm 25,5 triệu đôla chi phí công cộng của Đan Mạch [24]

2.1.2 Tại Việt Nam

Hiện nay, tình trạng ngộ độc thực phẩm, bao gồm ngộ độc do nhiễm khuẩn đang là vấn đề vô cùng nghiêm trọng ở Việt Nam, trong đó phải kể đến

các vụ ngộ độc do Salmonella gây nên Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng

Salmonellacó trong các thực phẩm như thịt, gia cầm, trứng, các sản phẩm sữa,

hoa quả, rau và các sản phẩm thực phẩm khác, trong đó gia cầm được xem là nguồn thực phẩm chính mang mầm bệnh Thịt gà là một trong những thực phẩm phổ biến của người Việt Nam, trong đó có tới 621,1 nghìn tấn thịt gia cầm được sản xuất vào năm 2010[18]

Theo thống kê ở Việt Nam mỗi năm có hàng trăm vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó số vụ do nhiễm vi sinh vật chiếm 33 -49% và chủ yếu

Salmonella Typhi chiếm 70% các vụ ngộ độc [9] Theo báo cáo của Bộ Y tế

về tình hình mắc bệnh thương hàn thì năm 2012 ghi nhận 617 trường hợp, không có tử vong So với cùng kì năm 2011(873 trường hợp mắc, không có tử vong), số mắc giảm 29,3% Số mắc giảm dần trong giai đoạn 2007 - 2011 từ

2148 ca xuống còn 873, tử vong duy trì 0 - 2 trường hợp/năm Trung bình giai đoạn 5 năm tỷ lệ mắc trên 100.000 dân là 1,806, tỷ lệ chết trên 100.000 dân là

0,001 [10] Khu vực miền Nam chiếm đa số (>60%), tập trung tại các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, TP Hồ Chí Minh, Kiên Giang Trong năm 1999 số ca mắc bệnh thương hàn tại các tỉnh miền Nam tăng khá cao như: Sóc Trăng (205,57/100.000 dân), Đồng Tháp (108,78/100.000 dân), An Giang

(96,37/100.000 dân) [9,10]

2.2 Đại cương về Salmonella Typhi

2.2.1 Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi

Salmonellathuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae Họ vi

khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que, oxidase âm và có thể di

động được[15] Có nhiều phương pháp khác nhau để định danhSalmonellatrong

đó Kaufmann - White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng rộng dãi từ năm 2003 [4].Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết huyết thanh

với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng

nguyên H

Kháng nguyên O có bản chất là một polysaccharide nằm ở ngoài cùng của màng tế bào Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường Những thay đổi trong thành phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loại kháng nguyên O khác nhau Kháng nguyên O được chia thành các nhóm kháng huyết thanh khác nhau quy ước bằng số như O9,O2, O4… ( Ban đầu các nhóm O phổ biến được quy ước bằng chữ cái đến nay vẫn dùng ở một số

nơi) Ví dụ Salmonella Typhimuriumthuộc nhóm O4 hay còn gọi là nhóm B,

Salmonella Typhi thuộc nhóm O9 (nhóm D1), Salmonella paratyphi thuộc

nhóm O2 (nhóm A) [2]

Kháng nguyên H là thành phần tạo thành cấu trúc roi của vi khuẩn

Kháng nguyên H có bản chất là proteinSalmonella là vi khuẩn đường ruột

duy nhất có thể biểu hiện hai loại kháng nguyên H khác nhau được mã hóa bởi hai gen khác nhau Tuy nhiên hoạt động của hai gen được phối hợp sao cho chỉ mộtkháng nguyên H được biểu hiện ở một thời điểm trong một tế bào vi khuẩn Hai kháng nguyên H này được sếp vào pha 1 và pha 2 Các chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểu hiện một kiểu kháng nguyên duy nhất

do sự bất hoạt của gen mã hóa cho kháng nguyên pha 1 hoặc pha 2 Ngoài ra

một số typ huyết thanh “đơn pha” do tự nhiên như Salmonella enteriditis,

Salmonella Typhi

Theo phương pháp định danh này, Salmonellađược chia thành hai loài:

Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vàoSalmonella enterica phân loài V) Salmonella entericađược chia thành 6 phân loài quy định

bằng tên hoặc số La Mã, trong đó Salmonella Typhi thuộc phân loài I [5]

Bảng 2.1: Phân loại Salmonellavà vật chủ

theo danh pháp Kauffmann - White

Loài và phân loài

Salmonella

Số lƣợng tuýp huyết thanh trong mỗi phân loài

Vật chủ

S.entericasubsp.diarizonae (IIIb) 324 Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.houtenae (IV) 70 Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.indica (VI) 12 Động vật máu lạnh và môi trường

Tổng cộng: 2463 tuýp huyết thanh

Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi (Salmonella Typhi)

là chủng vi khuẩn có tên tuýp huyết thanh (serotype) là Typhi thuộc giống

Salmonella, loài Salmonella enterica và phân loài enterica

Salmonella Typhi còn được qui ước bằng công thức kháng nguyên: I

9,12(Vi):d:- để mô tả vi khuẩn này thuộc phân loài I có kháng nguyên O là 9,

12 và mang thêm kháng nguyên vỏ Vi, kháng nguyên H pha I là d và không

có kháng nguyên H pha 2

Phần lớn (59%) tuýp huyết thanh của Salmonella thuộc S enterica phân

loài I trong đó các nhóm kháng huyết thanh O phổ biến nhất là O2, O4, O9… gây

ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động vật máu nóng [36]

2.2.2 Đặc điểm cấu trúc

Salmonellacó chiều dài 2-4µm và đường kính 0.6µm, cấu trúc gồm 2

màng: màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein mỏng nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào Màng trong và màng ngoài đều là các lớp lipoprotein, đóng vai tò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với tế bào.Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và ra khỏi tế bào chất [15].Các loại kháng nguyên [8]:

+ Kháng nguyên O: Hiện nay có 67 yếu tố kháng nguyên O Xác định yếu tố kháng ngyên giúp định nhóm và định typ

+ Kháng nguyên H: Chỉ có ở Salmonellacó lông

+ Kháng nguyên Vi ( Kháng nguyên K): Là kháng nguyên bề mặt bao bên ngoài vách tế bào vi khuẩn, dưới dạng một màng mỏng không nhìn thấy ở kính hiển vi thường Kháng nguyên Vi chỉ có ở hai typ huyết thanh

Salmonella Typhi và SalmonellaparatyphiC

2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Salmonella Typhi là trực trùng gram âm không tạo bào tử, kị khí tùy ý, di

động được bằng các roi có vành lông rung, phát triển tốt nhất ở 37ºC [15]

Salmonella Typhi là vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người mà không gây bệnh

ở bất kì sinh vật nào khác Nó có khả năng thay đổi để chống lại điều khiện ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp vì vậy rất khó để loại bỏ tận gốc vi

khuẩn này khỏi chuỗi thức ăn.Salmonella Typhi có trể tồn tại ở thịt chưa được

nấu chin và xâm nhập qua hàng rào cản acid dạ dày để gây bệnh ở người [21]

Bảng 2.2 Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella

2.2.4 Khả năng biến dị di truyền

Vi khuẩn Salmonela có khả năng biến dị khuẩn lạc từ dạng S sang dạng

R và ngược lại Bởi vậy, chúng có thể biến đổi từ dạng gây bệnh sang không gây bệnh nhất là khi nuôi cấy lâu ngày trong ống giống [20]

2.2.5 Tính chất nuôi cấy[17]

Là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37ºC, có thể phát triển được từ 6 - 42ºC, pH thích hợp là 7,6 phát triển được ở pH từ 6 - 9

- Trên môi trường lỏng

+ Sau 5 - 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đã làm đục nhẹ

+ Sau 18 giờ nuôi cấy môi trường đục đều

- Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, thường không màu hoặc xám

- Trên môi trường phân lập có tính ức chế chọn lọc như SS, Istrati… khuẩn lạc có màu cùng màu môi trường

2.2.6 Sức đề kháng

Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50ºC trong 1 giờ, 70ºC trong 15 phút,

100ºC trong 5 phút Chúng có thể sống sót trong môt trường thạch ở nhiệt độ 10ºC trong 115 ngày, sống từ 4-8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6 - 12ºC [6]

-Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng

Salmonellatồn tại khoảng 2 - 3 tháng, trong nước tự nhiên chúng có thể sống

1 - 2 tháng Ánh mặt trời chiếu thẳng có thể tiêu diệt vi khuẩn trong nước sau

5 giờ, trong nước đục sau 9 giờ Salmonellabị tiêu diệt bởi clorua thủy ngân

1% trong 5 phút, formon 0,5%, acid fenic 3% trong 15 - 20 phút, cloramin 1%, phenol 5% [20]

2.2.7 Độc tố [17]

Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonellarất mạnh, tiêm cho chuột lang

hoặc chuột nhắt liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết Ruột non xung huyết, mảnh Payer phù nề, đôi khi hoại tử.Nội độc tố có vai trò quyết định

trong tính chất gây bệnh của Salmonella

Ngoại độc tố: Ngoại tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí, ngoại độc tố có thể điều chế thành giải độc tố

2.2.8 Bệnh học sốt thương hàn do Salmonella Typhi

2.2.8.1 Nguồn lây bệnh và con đường truyền bệnh

Bệnh thương hàn là bệnh truyền nhiễm cấp tính của người do vi khuẩn

Salmonella Typhi gây ra, vi khuẩn này thường xâm nhập vào cơ thể bằng

đường miệng khi ăn thức ăn hay uống nước nhiễm bẩn Nguồn nước sinh hoạt

bị ô nhiễm (thực phẩm không đảm bảo vệ sinh) là nguyên nhân chính gây ra bệnh thương hàn [14]

Vi khuẩn thương hàn lây qua đường tiêu hóa Đa số các trường hợp mắc bệnh là do ăn uống thực phẩm, nước bị nhiễm khuẩn và không được nấu chín Những yếu tố nguy cơ phải kể đến nguồn nước nhiễm bẩn, kem, thực phẩm và nước uống đường phố, rau quả được tưới bằng nước thải bẩn hoặc được rửa bằng nước nhiễm khuẩn như nước sông, nước ao hồ, cống rãnh Đo lien quan đến những yếu tố điều kiện sống nên bệnh thường lưu hành ở những nơi có mật độ dân số cao cùng với tập quán sinh hoạt kém vệ sinh[14]

2.2.8.2 Khả năng gây bệnh và triệu chứng lâm sàng

Salmonellatheo thức ăn, nước uống xâm nhập vào đường tiêu hóa sau

đó vào hệ thống bạch huyết rồi vào máu Từ máu trực khuẩn thương hàn đến các cơ quan bạch huyết ruột (như mảng payer).Chúng có thể gây hoại tử chảy máu và thủng ruột.Từ hệ thống bạch huyết ruột, các trực khuẩn thương hàn lại

có thể xâm nhập vào máu rồi đến mọi cơ quan.Trong máu và hệ thống bạch huyết, trực khuẩn thương hàn bị các tế bào đơn nhân to tiêu diệt làm giải phóng các nội độc tố Nội độc tố tác động lên hệ thần kinh gây sốt kéo dài, liên tục, li bì, nhịp tim chậm (mạch và nhiệt độ phân ly) và huyết áp giảm Đây là dấu hiệu đặc trưng của bệnh thương hàn ở thời kì chưa có kháng sinh đặc hiệu chữa thương hàn [6]

2.2.8.3 Biện pháp phòng bệnh sốt thương hàn

Bệnh chủ yếu lây qua đường ăn uống thức ăn hoặc nước bị nhiễm khuẩn nên biện pháp quan tọng hang đầu là tạo điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm, cải thiện hệ thống xử lý nước thải và nguồn cung cấp nước Ở các nước phát triển, bệnh chủ yếu xảy ra ở các khác du lịch trở về từ các nước có dịch nên khách du lịch khi đến những vùng này cần chú ý đến vấn

đề an toàn thực phẩm

Do Salmonella Typhi chỉ gây bệnh ở người nên guồn gốc lây lan bệnh

luôn liên quan đến những người mắc sốt thương hàn hoặc mang mầm bệnh mãn tính Những người chế biến thực phẩm mang mần bệnh mãn tính có thể

là nguyên nhân của những đợt dịch sốt thương hàn nghiêm trọng Những

người mang Salmonella Typhi mãn tính có thể làm lan tràn bệnh dịch nếu họ

gây nhiễm nguồn cung cấp nước Vì vậy, việc kiểm soát và chữa bệnh cho

người mang Salmonella Typhi mãn tính là hết sức quan trọng trong công tác

- Điều trị

Hiện nay vi khuẩn thương hàn kháng lại một số kháng sinh nên làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh điều trị là cần thiết Nếu không có điều kiện làm kháng sinh đồ thì kháng sinh kinh điển điều trị thương hàn là Chloramphenicol ampicillin [19]

2.3 Các phương pháp phát hiện nhanhSalmonella Typhi

2.3.1 Phát hiện Salmonella Typhi bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống

Bao gồm có 4 giai đoạn:

Giai đoạn tiền tăng sinh (pre-ernichment): Đây là khâu quan trọng

không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm người ta thường sử dụng môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc

hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều sinh vật hiện diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm[22]

Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment): Giai đoạn này

làm tăng mật độ Salmonella so với các vi khuẩn khác bằng cách ức chế hoặc

ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập

Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonellathường được dung là

Rappapor Vasilialis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT), Selenete Cystein Broth (SC)… Thông thường môi trường TT được dùng để phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại thực phẩm khác[42]

Giai đoạn phân lập (isolation): Đây là bước tách biệt Salmonella

trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng Một số môi trường phân lập như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar (BSA), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen Entric Agar (HEP) Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái

khuẩn lạc của Salmonellatrên từng môi trường khác nhau

Trên các môi trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu

khuẩn lạc đặc trưng khác nhau Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng,

tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen Một số dòng Salmonellacó khả

năng sinh H2S, trừ Salmonella Typhi thì khuẩn lạc trong suốt và không có

tâm đen[5]

Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa: Đây là bước xác nhận các

dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonellatrên môi trường phân lập bằng các thử

nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng Các biểu hiện sinh hóa của

Salmonellanhư sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase

(+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), manitol (+), sorbitol (+) Nếu các biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá.Vi khuẩn sau khi hồi phục được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa nhằm

xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella[21]

2.3.2 Phát hiện Salmonella bằng phương pháp Phage Typing

Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại phage chỉ ly giải một chủng vi khuẩn mà không thể ly giải một chủng vi khuẩn khác trong cùng một loài Do đó các chủng của một loài vi khuẩn có thể được phân biệt dựa trên tính nhạy khác nhau của chúng với một hỗn hợp nhiều loại phage khác nhau [26]

+ Hiệu quả phân biệt của phương pháp còn hạn chế

+ Nhiều chủng Salmonella Typhi không thể xác định được kiểu Vi do

chúng kháng với hoạt động của các Vi-phage hoặc phản ứng chéo với nhiều loại Vi-phage khác nhau [32]

Trong nhiều năm qua phương pháp Phage typing đã được nghiên cứu

và sử dụng để phát hiện Salmonella Điển hình như Rabsch W( 2007) đã mô

tả phương pháp Phage typing nhằm phát hiện Salmonella Typhimurium

2.3.3 Phương pháp phân tích tính đã hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên (Random amplified polymorphic DNA - RAPD)

Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuếch đại ngẫu nhiên, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và McClelland Được sử dụng lần đầu tiên bởi Williams và cộng sự (1990) để kiểm tra mẫu DNA của con người chưa rõ danh tính [25] Random amplified polymorphic DNA (tính

đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là phương pháp phân biệt dựa trên

sự khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA trên nhiễm sắc thể Dùng nghiên cứu

sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau [22]

Sinh vật cùng loài sẽ có kiểu gen hoàn toàn giống nhau, khuếch đại các đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR Sinh vật khác nhau ít nhiều sẽ khác nhau về kiểu gen thì một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước khác nhau

+ Ưu điểm:

+ Phát hiện nhanh tính đa dạng di truyền

+ Thao tác đơn giản không đòi hỏi kỹ thuật cao

+ Tương đối rẻ tiền hơn so với các phương pháp RFLP, SSR

+ Không dùng đồng vị phóng xạ nên tránh được độc hại cho người thao tác

+ Thường được áp dụng để phân loại Salmonella Typhi và cho hiệu quả

phân biệt khá cao [4]

Các công trình nghiên cứu trên thế giới ứng dụng kỹ thuật RADP đã được công bố như Quintaes B R., Leal N C., Reis E M F đã tối ưu hóa

phản ứng RADP đặc trưng cho Salmonella Typhi, để đảm bảo khả năng phân

biệt của kỹ thuật này các nhà khoa học đã sử dụng nồng độ khác nhau của DNA khuôn, mồi, MgCl2 và Taq để kiểm tra 8 chủng Salmonella Typhi được

phân lập ở các khu vựa khác nhau Brazil

2.3.4 Phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA)

Nguyên tắc: phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung

là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữ kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn vào một enzyme [11]

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên kháng thể và chất tạo màu thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Kỹ thuật ELISA đã được nghiên cứu rộng rãi tại Việt Nam và trên thế giới Điển hình nhưBringmon R L và cộng sự (1995) sử dụng các kháng thể nguyên roi hay còn gọi là kháng nguyên H Nguyễn Trí Nhân và cộng sự (

2005) đã sử dụng kỹ thuật ELISA tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng

nguyên H:g,m của Salmonella enterica trong tế bào E.coli.Trong nghiên cứu này với mục đích xây dựng quy trình ELISA phát hiện Salmonellatrong thực

phẩm, các nhà khoa học đã lựa chọn kháng nguyên H toàn phần, nhằm ứng dụng tính phản ứng chéo giữa kháng nguyên và kháng thể của các serotype

của các Salmonellađể phát hiện ra Salmonellabất kỳ.Kết quả của nghiên cứu

này có độ nhạy cao và đáng tin cậy

+ So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA - Radio Immuno Assay) thì

kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn

+ ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

Nhược điểm:

+ Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau nên phải thử nghiệm với nhiều loại kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được

+ Yêu cầu kỹ thuật và trình độ chuyên môn

+ Chỉ được thực hiện ở các phòng thí nghiệm đạt chuẩn [16]

2.3.5 Phương pháp PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) - Điện di trường xung

Nguyên tắc: Trước tiên các mẫu đưa vào phân tích phải được xử lý trước bằng loại enzym cắt hạn chế mà có rất ít điểm cắt Kết quả phải tạo ra được các mảnh có kích thước lớn (50 kb - 12 Mb), với kích thước này không thể điện di theo phương pháp thông thường mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ

thuật PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh ADN có kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường

+ Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát hiện những sai khác nhỏ giữa các mẫu, đặc biệt khi thực hiện với một enzym thì kết quả có thể giống nhau nhưng không chắc chắn là hai mẫu giống nhau hoàn toàn Điều đó có nghĩa là

kỹ thuật này nên dùng để xác định sự khác nhau còn việc xác định sự giống

nhau thì không đủ tin cậy [7]

Stephen G Long và cộng sự đã sử dụng phương pháp PFGE để giám

sát sự tăng cường lây nhiễm của vi khuẩn Salmonella [38]

2.3.6 Phương pháp khuếch đại phụ thuộc mẫu dò (Multiplex ligation - Dependent probe amplification - MLPA)

MLPA là một phương pháp dựa vào PCR giúp phát hiện đồng thời các

khác biệt trên trình tự DNA hay RNA

Nguyên tắc của phương pháp MLPA là sử dụng các mẫu dò để nhận biết các trình tự mục tiêu Mỗi mẫu dò là hai đoạn oligonucleotide có thể nối lại với nhau khi chúng gắn hoàn toàn vào trình tự đích Tất cả các mẫu dò đều

có trình tự giống nhau ở đầu 5‟ và đầu 3‟ để sau khi nối lại chúng có thể được khuếch địa đồng thời trong một phản ứng PCR duy nhất chỉ sử dụng một cặp mồi Với MLPA không phải DNA mục tiêu được khuếch đại mà các mẫu dò

trình tự đích được khuếch đại Chỉ những mẫu dò nào gắn được vào trình tự đích mới được nối lại sau đó được khuếch đại bằng PCR Mẫu dò được gắn với một trình tự có chiều dài khác nhau giúp cho các sản phẩm khuếch đại sẽ

có một chiều dài duy nhất và đặc trưng cho trình tự đích Sau khi điện di, các sản phẩm khuếch đại được phân tích và các đoạn DNA mất đi hoặc được thêm vào sẽ dễ dàng xác định được [32]

Ưu điểm:

+ Rất nhanh, rẻ, tính lặp lại cao

+ Độ phân biệt rất tốt, rõ ràng và rất dễ thực hiện

+ Thiết bị thực hiện phản ứng MLPA có ở hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử là một máy chạy PCR và một thiết bị điện di mao quản hoặc điện di thông thường

+ Phương pháp MLPA có thể phân biệt được đến 45 trình tự đích cùng một lúc trong một phản ứng duy nhất

- Nhược điểm:

+ Yêu cầu trình độ kỹ thuật cao

Phương pháp này chỉ được thực hiện ở các phòng thí nghiệm đạt chuẩn

có trang thiết bị chuyên dụng [32]

Trên thế giới đã có công trình nghiên cứu của Kathryn và cộng sự ứng

dụng phương pháp MLPA để giản trình tự bộ gen của 19 chủng Salmonella Typhi,

nhờ kỹ thuật này mà các nhà nghiên cứu đã xác định được đoạn bị mất và các

đoạn gắn chèn đặc trưng cho các halotype ở Salmonella Typhi[32]

2.4 Các chỉ thị phân tử phát hiện nhanh Salmonella Typhi

Gen chỉ thị là gen không thể thiếu cho sự tồn tại và phát triển của vi

khuẩn Các công trình nghiên cứu về phương pháp phát hiện Salmonella

Typhi bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các gen làm chỉ thị phân tử như: Pui C

F và cộng sự [37] đã sử dụng gen 23S rRNA làm gen chỉ thị để phát hiện

Salmonella Typhi Nargess S F và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật multiplex

PCR khuếch đại gen invA, hp để phát hiện nhanh Salmonella Typhi Thong K

L và cộng sự [39] đã sử dụng kỹ thuật multiplex PCR khuếch đại gen hil, spa,

typ, IAC để phát hiện Salmonellaspecies.S Kumar và cộng sự (2005) đã sử

dụng multiplex PCR để khuếch đại bốn trình tự gen invA, viaB, flic-d, prt nhằm phát hiện vi khuẩn Salmonella Typhi Gen prt là một phần của cụm gen

rfb và mã hóa cho CDP paratose synthase trong đó chuyển đổi CDP-4-keto-3,

6 - dideoxyglucose thành CDP paratose Gen này hiện diện trong phân loài

Typhi, ParatyphiA và vài phân loài khác [33] Seyed Latif Mousavi và cộng

sự (2006) đã sử dụng gen rfbE làm gen chỉ thị để phát hiện S Typhi bằng

phương pháp PCR-ELISA, cặp mồi BS1 và BS2 đã được sử dụng để khuếch

đại gen rfbE , kết quả của nghiên cứu cho thấy quy trình có độ đặc hiệu đạt

100% và giúp tăng độ nhạy lên 100 lần, giới hạn phát hiện trong PCR-ELISA

là 2.5ρg DNA, toàn bộ quy trình mất khoảng 100 phút [35] Một tập hợp 7

gen “chỉ thị” được chọn nằm rải rác trên nhiễm sắc thể của Salmonella Typhi CT18 bao gồm aroC (chorismate synthase), dnaN (DNA polymerase III beta subunit), hemD (uroporphyrinogen III cosynthase), hisD (histidinol dehydrogenase), purE (phosphoribosylaminoimidazole carboxylase), sucA (alpha ketoglutaratedehydrogenase) và thrA (aspartokinase+homoserine

dehydrogenase) Các gen này được giải trình tự (tổng cộng 3336 bp) và được

dùng để phân biệt 26 chủng Salmonella Typhiphân lập khắp nơi trên thế giới

từ năm 1918 đến 2000) Tuy nhiên kết quả chỉ tìm thấy có 3 vị trí đa hình ở

26 chủng này và 4 loại trình tự [34]

2.5 Tổng quan phương pháp multiplex PCR

2.5.1 Khái niệm multiplex PCR

Multiplex PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng