Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh salmonella typhi

I HC THI NGUYấN TRNG I HC NễNG LM NH HOA S DNG K THUT MULTIPLEX PCR PHT HIN NHANH Salmonella typhi KHểA LUN TT NGHIP I HC H o to : Chớnh quy Chuyờn ngnh : Cụng ngh Sinh hc Khoa : CNSH - CNTP Khoỏ hc : 2011 - 2015 Thỏi Nguyờn, nm 2015 I HC THI NGUYấN TRNG I HC NễNG LM NH HOA S DNG K THUT MULTIPLEX PCR PHT HIN NHANH Salmonella typhi KHểA LUN TT NGHIP I HC H o to Chuyờn ngnh Lp Khoa Khoỏ hc Ging viờn hng dn : Chớnh quy : Cụng ngh Sinh hc : K43 - CNSH : CNSH - CNTP : 2011 - 2015 : TS Nguyn Vn Duy, ThS Trn ỡnh Quang Thỏi Nguyờn, nm 2015 i LI CM N Tụi xin chõn thnh cm n thy TS Nguyn Vn Duy, ThS Trn ỡnh Quang khoa Cụng ngh Sinh hc v Cụng ngh Thc phm ó hng dn trc tip ti, cỏc thy ó tn tỡnh ch bo, giỳp v to mi iu kin thun li tụi hon thnh tt ti ny Tụi xin c cm n anh Ló Vn Hin cỏn b phũng thc hnh Sinh hc phõn t v k thut di truyn khoa CNSH & CNTP cng cỏc bn sinh viờn khoa CNSH & CNTP lm nghiờn cu ti phũng Tụi xin c cm n TS Nguyn c Trung b mụn c s i hc Y Dc Thỏi Nguyờn, cụ Phm Th Phng ging viờn khoa CNSH & CNTP ó cung cp chng vi sinh vt thc hin ti ny Tụi xin chõn thnh cm n cỏc thy cụ khoa Cụng ngh Sinh hc v Cụng ngh Thc phm ó dy d chỳng tụi sut thi gian qua, cm n cỏc cỏn b ang cụng tỏc ti phũng thớ nghim khoa CNSH & CNTP ó to mụi trng thun li cho tụi hc tp, nghiờn cu, thc hin ti ny Cui cựng, tụi xin cm n b m, thy cụ, bn bố ó ng h v mt vt cht cng nh tinh thn giỳp tụi hon thnh ti ny Tụi xin chõn thnh cm n! Thỏi Nguyờn, thỏng nm 2015 Sinh viờn Nh Hoa ii DANH MC T VIT TT T/thut ng Ngha y ca t/thut ng vit tt l Microlit (1 l = 10-3 ml) CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide DNA ELISA Deoxyribonucleic acid - Mt loi nucleic acid Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phng phỏp hunh quang dch liờn kt enzyme) Polymerase Chain Reaction: phn ng tng hp PCR chui polyme (Phn ng khuch i DNA ng nghim) RADP PFGE MLPA Random amplified polymorphic DNA (phõn tớch tớnh ó hỡnh cỏc on DNA khuch i ngu nhiờn) Pulsed-Field Gel Electrophoresis (in di trng xung) Multiplex ligation Dependent probe amplification (khuch i ph thuc mu dũ) iii DANH MC CC BNG Trang Bng 2.1: Phõn loi Salmonellav vt ch theo danh phỏp Kauffmann - White Bng 2.2 Cỏc biu hin sinh húa ca Salmonella Bng 3.1: Cỏc cp mi c thit k 27 Bng 4.1: Cỏc thụng s k thut ca cp mi c thit k 32 iv DANH MC CC HèNH Trang Hỡnh 4.1 Hỡnh nh in di kim tra sn phm tỏch chit DNA tng s ca cỏc mu Salmonella Typhi 34 Hỡnh 4.2 Kt qu in di kim tra sn phm PCR khuch i bi cp mi ViaBF-ViaBR v TF-TR 33 Hỡnh 4.3 Kt qu in di kim tra sn phm PCR n s dng cỏc cp mi riờng r 35 Hỡnh 4.4 Kt qu din di kim tra sn phm PCR n s dng cỏc cp mi riờng r cỏc iu kin khỏc 37 Hỡnh 4.5 Kt qu in di kim tra sn phm ca phn ng multiplex PCR 39 Hỡnh 4.6 Kt qu in di kim tra sn phm multiplex PCR cỏc nng DNA khuụn khỏc 41 Hỡnh 4.7 Hỡnh nh in di kim tra sn phm ca phn ng multiplex PCR vi cỏc chng vi khun kim nh khỏc 43 v MC LC Phn 1: M U 1.1 t 1.2 Mc ớch nghiờn cu 1.3 Mc tiờu nghiờn cu 1.4 í ngha ca ti 1.4.1 í ngha khoa hc 1.4.2 í ngha thc tin Phn 2: TNG QUAN TI LIU 2.1 Tỡnh hỡnh nhim bnh Salmonella Typhi 2.1.1 Trờn th gii 2.1.2 Ti Vit Nam 2.2 i cng v Salmonella Typhi 2.2.1 Danh phỏp v phõn loi ca Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi 2.2.2 c im cu trỳc 2.2.3 c im sinh lý, sinh húa 2.2.4 Kh nng bin d di truyn 2.2.5 Tớnh cht nuụi cy 2.2.6 Sc khỏng 10 2.2.7 c t 10 2.2.8 Bnh hc st thng hn Salmonella Typhi 10 2.3 Cỏc phng phỏp phỏt hin nhanh Salmonella Typhi 12 2.3.1 Phỏt hin Salmonella Typhi bng phng phỏp nuụi cy truyn thng 12 2.3.2 Phỏt hin Salmonella bng phng phỏp Phage Typing 14 2.3.3 Phng phỏp phõn tớch tớnh ó hỡnh cỏc on DNA khuch i ngu nhiờn (Random amplified polymorphic DNA - RAPD) 15 vi 2.3.4 Phng phỏp xột nghim hp th dch liờn kt vi enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA) 16 2.3.5 Phng phỏp PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) - in di trng xung 17 2.3.6 Phng phỏp khuch i ph thuc mu dũ (Multiplex ligation Dependent probe amplification - MLPA) 18 2.4 Cỏc ch th phõn t phỏt hin nhanh Salmonella Typhi 19 2.5 Tng quan phng phỏp multiplex PCR 20 2.5.1 Khỏi nim multiplex PCR 20 2.5.2 u v nhc im ca multiplex PCR 22 2.5.3 ng dng ca multiplex PCR vic phỏt hin cỏc vi sinh vt gõy bnh 23 PHN 3: I TNG, NI DUNG V PHNG PHP NGHIấN CU 26 3.1 i tng v phm vi nghiờn cu 26 3.1.1 i tng nghiờn cu 26 3.1.2 Phm vi nghiờn cu 26 3.2 a im v thi gian tin hnh 26 3.2.1 a im nghiờn cu 26 3.2.2 Thi gian tin hnh 26 3.3 Húa cht v thit b v vt liu 26 3.3.1 Húa cht 26 3.3.2 Thit b 27 3.3.3 Vt liu 27 3.4 Ni dung nghiờn cu 28 3.5 Phng phỏp nghiờn cu 28 3.5.1.La chn cỏc cp mi cho phn ng multiplex PCR 28 vii 3.5.2 Tỏch chit DNA tng s 28 3.5.4 Ti u húa phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi 29 3.5.5 Phng phỏp xỏc nh nhy ca phn ng multiplex PCR 30 3.5.6 Xỏc nh c hiu ca phn ngmultiplex PCR 31 Phn 4: KT QU NGHIấN CU 32 4.1 Kt qu la chn cp mi c hiu cho phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi 32 4.2 Kt qu tỏch chit DNA tng s ca Salmonella Typhi 34 4.3 Kt qu xỏc nh nng DNA ti thiu phn ng PCR n s dng cỏc cp mi riờng r 35 4.4 Kt qu nghiờn cu iu kin ti u ca phn ng multiplex PCR 37 4.5 Xỏc nh nhy ca phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi 41 4.6 Xỏc nh c hiu ca phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi 42 Phn 5: KT LUN V KIN NGH 44 5.1 Kt lun 44 5.2 Kin ngh 44 TI LIU THAM KHO 46 I Ti liu ting vit 46 II Ti liu ting anh 48 Phn M U 1.1 t Thng hn l mt bnh truyn nhim cp tớnh, lõy bng ng tiờu húa, trc khun Salmonella Typhi gõy nờn Biu hin lõm sng l hi chng nhim khun nhim c ton thõn, kốm theo tn thng bnh lý c hiu ti ng tiờu húa Theo c tớnh cú 75% trng hp ngi mc phi bnh Salmonella l n phi nhng thc n b nhim khun bao gm tht bũ, tht heo, tht gia cm v trng Tiờu chun Vit Nam (TCVN: 7926-2008 Tht v sn phm ca tht v TCVN 6040: 2007 Vi sinh vt thc phm v thc n gia sỳc) yờu cu lng Salmonella 25 g thc phm l [12] Cỏc bnh truyn nhim qua thc phm ó ni lờn nh mt y t cụng cng quan trng nhiu nc thp k qua.Salmonella Typhi gõy bnh thng hn ca hn 16 triu ngi trờn th gii, v khong 600.000 ca t vong mi nm [27] hiu rừ hn dch t hc ton cu ca salmonellosis v t l cỏc chng trỡnh giỏm sỏt quc gia cho Salmonellanhim trựng ngi, T chc Y t Th gii (WHO) phi hp vi Trung tõm Kim Soỏt v Nga Bnh Hoa K (CDC), WHO phi hp vi Giỏm sỏt Thc Phm Gõy Bnh, ó tin hnh mt cuc kho sỏt ton cu cỏc phũng thớ nghim y t cụng cng quc gia tỡm hiu v thc hin liờn quan n Salmonella serotyping v xỏc nh Salmonella thng c phõn lp hu ht type huyt t ngi vo nm 1990 - 1995 [31] Hin ó cú rt nhiu phng phỏp c s dng phỏt hin vi khun Salmonella Typhi, phng phỏp nuụi cy truyn thng luụn luụn bao gm nhiu cụng on nuụi cy kt hp vi cỏc bc kim tra lm mt nhiu thi gian t n ngy [12] Nhng tin b ca cỏc k thut sinh hc phõn t ó v ang cho phộp phỏt trin nhng phng phỏp kim tra rt nhy v 36 phm PCR s dng cp mi ViaBF-ViaBR; ng chy v 11: mu kim chng õm tớnh; ng chy v 12, v 13; v 14; v 15; v 16; v 17; v 18; v 19; v 10 v 20: DNA khuụn cú nng ln lt l 115.10; 115; 115.10-1; 115.10-2; 115.10-3; 115.10-4; 115.10-5, 115.10-6 v 115.10-7 ng/l; Kt qu in di kim tra sn phm sn phm PCR trờn hỡnh 4.3 cho thy: gim dn nng DNA khuụn, cng bng sn phm PCR thu c gim dn v ti ng chy s 10 v sụ 20 khụng xut hin bng sn phm PCR iu ny chng t nng DNA khuụn gim xung n nng 115.10-7 ng DNA/l, lng sn phm PCR thu c khụng ln hỡnh thnh bng DNA cú th quan sỏt trờn hỡnh nh in di iu ú chng t nng DNA ti thiu phn ng PCR n ca tng cp mi riờng r cú th hỡnh thnh c sn phm PCR quan sỏt c trờn hỡnh nh in di l 115.10-6 ng/l (tng ng vi 1,15.10-4 ng/l) Theo cỏc cụng b ó nghiờn cu v nng DNA khuụn ti thiu cho phn ng PCR nh nghiờn cu ca Mousavi S L v cng s [35 ]trong vic phỏt hinSalmonella Typhithỡ nng khuụn DNA ti thiu l 2,5.10-3 ng/l, ca Kumar v cng s [33] cú nng DNA khuụn ti thiu l 3.10 -3ng/l Nh vy nhy ca phn ng PCR n kt qu nghiờn cu ny cao hn so vi kt qu ca Mousavi S L v Kumar S Lý tỡm nng DNA ti thiu ca phn ng PCR n nghiờn cu ny c gii thớch nh sau: thc hin ti u cỏc iu kin cho phn ng multiplex PCR tip theo vic xỏc nh nng DNA khuụn ti thiu ca phn ng PCR n rt quan trng Nu nng DNA khuụn ca phn ng PCR cao thỡ ti u cỏc iu kin ca phn ng multiplex PCR cao thỡ s khỏc bit ca kt qu bng in di ti u cỏc iu kin phn ng s khụng cú s khỏc bit rừ rng v khú nhn bit c s khỏc ú thy c s khỏc rừ rng ti u cỏc iu kin phn ng multiplex PCR, nng DNA khuõn cung cp cho phn ng PCR phi thp 37 Do ú, ti u cỏc iu kin cho phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi chỳng tụi la chn nng DNA khuụn l 1,15.10-4 ng/àl m bo nng DNA khuụn thp nhng m bo s khuch i cú hiu qu cỏc vựng gen mc tiờu 4.4 Kt qu nghiờn cu iu kin ti u ca phn ng multiplex PCR ti u cỏc iu kin ca phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi, trc tiờn tụi tin hnh tỡm hiu cỏc iu kin chung nht ca cỏc phn ng PCR n s dng cỏc cp mi ViaBF-ViaBR v TF-TR riờng r lm c s cho vic xõy dng cỏc iu kin ti u ca phn ng multiplex PCR i vi phn ng multiplex PCR, hm lng MgCl2 (hay chớnh l hm lng buffer), nhit gn mi u nh hng n kh nng khuch i ng thi cỏc trỡnh t ớch mu phõn tớch [40] Trong nghiờn cu ny, cỏc iu kin v hm lng MgCl2, nhit gn mi cỏc phn ng PCR n c bin i nhm tỡm hiu iu kin chung nht cho phộp khuch i cú hiu qu cỏc vựng gen c hiu ca Salmonella Typhi Hỡnh 4.4 Kt qu din di kim tra sn phm PCR n s dng cỏc cp mi riờng r cỏc iu kin khỏc 38 ng chy M: thang chun DNA 100 bp (Enzynomics); ng chy v 17: kim chng õm tớnh Hng trờn: sn phm PCR s dng cp mi ViaBF-ViaBR Hng di: sn phm PCR s dng cp mi TF-TR Bng 4.2: Ghi chỳ hỡnh 4.4 Nhit gn mi (oC) ng chy 53 18 53 55 19 55 57 20 59 21 59 61 22 61 53 23 53 55 24 55 57 25 10 59 26 59 11 61 27 61 12 53 28 53 13 55 29 55 57 30 15 59 31 59 16 61 32 61 Hm ng lng PCR chy buffer 14 0,5 X 1,0 X 1,5 X Hm lng PCR buffer 0,5 X 1,0 X 1,5 X Nhit gn mi (oC) 57 57 57 Kt qu in di kim tra sn phm PCR trờn hỡnh 4.4 cho thy, cỏc iu kin ca thnh phn phn ng PCR v iu kin chu trỡnh nhit ca phn ng khỏc th nghim trờn u cho phộp khuch i c hiu vựng gen mc tiờu hỡnh thnh sn phm PCR cú th nhn bit c bng mt thng trờn bn in di Tuy nhiờn, cỏc iu kin phn ng khỏc v iu kin chu trỡnh nhit khỏc nhau, cng bng sn phm phn ng PCR khỏc nhau, 39 c bit l phn ng PCR s dng cp mi ViaBF-ViaBR (hng trờn) So sỏnh cng bng sn phm thu c bi phn ng PCR s dng cp mi ViaBF-ViaBR (hng trờn), cng bng DNA ng chy s 10 cao nht Chng t vi hm lng PCR Buffer v nhit gn mi ca phn ng PCR tng ng vi ng chy s 10 cú hiu qu khuch i cao nht, ng thi m bo c tớnh c hiu ca phn ng Hm lng PCR Buffer thnh phn phn ng PCR tng ng vi ng chy s 10 v 1x PCR buffer v nhit gn mi l 59oC So sỏnh cng bng sn phm PCR s dng cp mi TF-TR cỏc iu kin khỏc (hng di) cho phộp rỳt kt lun rng cỏc iu kin th nghim nghiờn cu ny khụng nh hng nhiu n hiu qu khuch i ca phn ng PCR T kt qu nghiờn cu trờn chỳng tụi la chn iu kin hm lng PCR Buffer l 1x v nhit gn mi l 59oC th nghim phn ng multiplex PCR Kt qu in di kim tra sn phm ca phn ng muiltiplex PCR c th hin hỡnh 4.5 di õy Hỡnh 4.5 Kt qu in di kim tra sn phm ca phn ng multiplex PCR ng chy s Kim chng õm tớnh ca phn ng PCR n vi mi TF-TR;ng chy s 2: Phn ng PCR n vi mi TF-TR; ng chy s 40 3: phn ng PCR n vi mi ViaBF-ViaBR; ng chy s 4: Kim chng õm tớnh ca phn ng PCR n vi mi ViaBF-ViaBR; ng chy s 5: Kim chng õm tớnh ca phn ng multiplex PCR; ng chy s 6: Phn ng multiplex PCR s dng DNA khuụn ca S Typhi Kt qu in di kim tra sn phm ca phn ng multiplex PCR hỡnh 4.5 cho thy: sn phm ca phn ng multiplex PCR gm bng DNA rừ nột, ú bng DNA cú kớch thc tng ng vi sn phm PCR n s dng cp mi ViaBF-ViaBR v bng DNA cú kớch thc tng ng vi sn phm PCR n s dng cp mi TF-TR Kt qu ny chng t, phn ng multiplex PCR hon ton khuch i hiu qu v c hiu vựng gen mc tiờu nghiờn cu T ú chỳng tụi xõy dng c iu kin ca phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi nh sau: V thnh phn phn ng: - 10x PCR buffer: 2,5 l - dNTPs (2,5 mM): 3,0 l - Primer ViaBF (10 M):1,0 l - Primer ViaBR (10 M):1,0 l - Primer TF (10 M):1,0 l - Primer TR (10 M):1,0 l - nTaq Hot DNA polymerase (5U/l): 0,2 l - DNA khuụn: 2,5 l - H2O:12,8 l V iu kin chu trỡnh nhit ca phn ng: - Bin tớnh ban u: 95oC 10 phỳt - 35 chu k khuch i gm: + Bin tớnh: 95oC 30 giõy + Gn mi: 59oC 30 giõy 41 + Kộo di mi: 72oC 60 giõy - Kộo di cui cựng: 72oC phỳt - bo qun 8oC cho n ly sn phm 4.5 Xỏc nh nhy ca phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi xỏc nh nhy ca phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi,DNA tng s ca Salmonella Typhi c pha loóng theo cp s 10 Sau pha loóng, dung dch DNA c s dng lm khuụn cho phn ng multiplex PCR nhy ca phn ng c xỏc nh l nng DNA ti thiu cho phộp phn ng multiplex PCR khuch i hỡnh thnh sn phm cú th quan sỏt c bng mt thng trờn hỡnh nh in di Kt qu in di kim tra sn phm PCR c th hin hỡnh 4.6 di õy Hỡnh 4.6 Kt qu in di kim tra sn phm multiplex PCR cỏc nng DNA khuụn khỏc M thang chun DNA 100 bp (Enzynomics); ng chy 1: Kim chng õm tớnh; ng chy - 8: Nng DNA khuụn ln lt l 1,15.10-2 n 1,15.10-8 ng/l 42 Kt qu kim tra sn phm ca phn ng multiplex PCR th hin trờn hỡnh 4.5 cho thy: nng DNA khuụn gim dn, cng bng DNA sn phm PCR cú xu hng gim dn Khi nng DNA khuụn gim n 1,15.10-5 ng/l (ng chy s 5) c bng sn phm PCR u cú th quan sỏt c trờn hỡnh nh in di Tuy nhiờn gim nng DNA khuụn xung cũn 1,15.10-6 ng/l, c bng sn phm PCR u khụng th quan sỏt bng mt thng trờn hỡnh hnh in di iu ny c gii thớch nh sau: nng DNA khuụn gim, hm lng sn phm khuch i gim, hm lng DNA khuụn gim n 1,15.10-6 ng/l, hm lng sn phm PCR quỏ thp nờn khụng kh nng hỡnh thnh bng DNA cú th quan sỏt c bng mt thng trờn hỡnh nh in di T kt qu trờn cho phộp kt lun phn ng multiplex PCR vi iu kin c thit lp nghiờn cu ny cú kh nng phỏt hin c Salmonella Typhi nng DNA khuụn t 1,15.10-5 ng/l tr lờn Theo cụng b ca Mousavi v cng s nm 2006 nghiờn cu k thut PCR phỏt hinSalmonella Typhi, nhy phỏt hin ca k thut t nng khuụn DNA l 2,5.10-3 ng/àl [35] Kumar v cng s ( 2005) ó phỏt trin k thut PCR a mi phỏt hin nhanh Salmonella Typhi vi nng khuụn ti thiu cho phộp phỏt hin bng sn phm PCR trờn hỡnh nh in di l 3.10-3ng/àl [33] Nh vy, quy trỡnh phõn tớch ca chỳng tụi cú nhy phỏt hin cao hn so vi kt qu c cụng b bi Mousavi v ng tỏc gi v bi Kumar ng tỏc gi 4.6 Xỏc nh c hiu ca phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi xỏc nh c hiu ca phn ng multiplex PCR phỏt hin SamonellaTyphi, phn ng multiplex PCR c xõy dng trờn c tin hnh th nghim vi cỏc chng vi khun kim nh gm Salmonella enteridis, 43 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus v Escherichia coli Kt qu in di kim tra sn phm PCR c th hin hỡnh 4.7 di õy Hỡnh 4.7 Hỡnh nh in di kim tra sn phm ca phn ng multiplex PCR vi cỏc chng vi khun kim nh khỏc M thang chun DNA 100 bp (Enzynomics); ng chy s 1: Mu kim chng õm tớnh; ng chy 2, v 4: cỏc chng vi khun S Typhi; ng chy 5: S aureus; ng chy 6:B cereus; ng chy 7:S enteridis; ng chy 8.E.coli Kt qu in di kim tra sn phm PCR th hin trờn hỡnh 4.7 cho thy sn phm ca phn ng mutltiplex PCR ch xut hin bng rừ nột ỳng kớch thc theo lý thuyt s dng khuụn l cỏc chng Salmonella Typhi (ng chy 2, v 4) v khụng hỡnh thnh sn phm PCR khuụn l cỏc loi vi khun kim nh khụng phi l Salmonella Typhi (ng chy 5, 6, v 8) Kt qu nghiờn cu ny th hin rng: K thut multiplex PCR s dng cp mi ViaBF-ViaBR v TF-TR c phỏt trin ti nghiờn cu ny cú kh nng phỏt hin chớnh xỏc Salmonella Typhi Tuy nhiờn, cú th khng nh c c hiu, k thut cn phi c th nghim trờn mt hp s lng ln cỏc chng Salmonella Typhi khỏc v t hp nhiu loi vi khun khụng phi l Salmonella Typhi 44 Phn KT LUN V KIN NGH 5.1 Kt lun T nhng kt qu nghiờn cu trờn õy chỳng tụi a nhng kt lun sau: ó la chn c cp mi c hiu cho Salmonella Typhi, bao gm cp mi ViaBF-ViaBR v TF-TR Hai cp mi tha cỏc iu kin ca phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi ó ti u c iu kin ca phn ng multiplex PCR phỏt hin nhanh Salmonella Typhi Thnh phn phn ng mutlplex PCR iu kin ti u gm: 2,5 l 10X PCR Buffer; 3,0 l 2,5 mM dNTPs; 1,0 l Primer ViaBF (10 M); 1,0 l Primer ViaBR (10 M); 1,0 l Primer TF (10 M); 1,0 l Primer TR (10 M); 0,2 l 5U/l Taq DNA polymerase; 2,5 l DNA khuụn v 12,8 l H2O iu kin chu trỡnh nhit ca phn ng bao gm: bin tớnh ban u 95oC 10 phỳt; 35 chu k khuch i gm bin tớnh 95oC 30 giõy, gn mi 59oC 30 giõy, kộo di mi 72oC 60 giõy; kộo giai cui cựng 72oC phỳt; bo qun mu 8oC cho n ly sn phm nhy ca phn ng multiplex PCR c xỏc nh l 1,15.10-5ng DNA khuụn/l ó xỏc nh c hiu ca phn ng multiplex PCR vi cỏc chng vi khun kim nh Kt qu cho thy k thut mutliplex PCR s dng cp mi ViaBF-ViaBR v TF-TR cho phộp phỏt hin nhanh v chớnh xỏc Salmonella Typhi 5.2 Kin ngh Tip tc th nghim k thut multiplex PCR ó phỏt trin nghiờn cu ny trờn mt s lng ln mu Salmonella Typhi v cỏc chng vi khun kim nh ỏnh giỏ mc õm tớnh gi v dng tớnh gi xỏc nh nhy v c hiu tng i ca k thut 45 Th nghim kh nng ca k thut phỏt hin Salmonella Typhi trc tip t mu thc phm v mu bnh phm Tip tc nghiờn cu to kit phỏt hin nhanh Salmonella Typhi t k thut ó c phỏt trin nghiờn cu ny 46 TI LIU THAM KHO I Ti liu ting vit Nguyn Tun Anh, Nguyn Minh Tõm, Trnh Th Thanh Huyn, Ngụ Quang Hng, Phớ Th Thu Hin, Nguyn Th Hong (2014), Xõy dng qui trỡnh multiplex PCR phỏt hin mt s vi khun gõy tiờu chy cp ln, Tp sinh hc s 36 Lờ Huy Chớnh (2007),Vi sinh vt Y hc, NXB Y hc Nguyn Vn Duy (2011), Nghiờn cu phỏt trin k thut DNA macroarray nhm phỏt hin nhanh tớnh khỏng Rifampicin v Isoniazid vi khun lao, Lun ỏn tin s k thut, Trng i hc Bỏch Khoa H Ni Nguyn Tin Dng (2002), Phỏt hin phõn bit Salmonellaspp,Salmonella enterica bng phng phỏp PCR v kho sỏt tn s xut hin tng i ca Salmonella enterica I thy sn, nc t nhiờn, Trng i hc Khoa hc T nhiờn TP H Chớ Minh Nguyn Lõn Dng (2005), Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc - Tp 2, NXB khoa hc v k thut BS Nguyn Thanh H(2007) ,Giỏo trỡnh ký sinh trựng, NXB H Ni Dng Vn Hp, Nguyn Lõn Dng (2007), Phõn loi vi sinh bng Sinh Hc Phõn T, NXB giỏo dc Vit Nam ThS.BSCK II Trn Vn Hng, ThS.BS Nguyn oan Trinh (2010), Vi sinh vt Y hc Trn Th Phi La (2011), Thng hn mt nan gii, Hi tho khoa hc v bnh thng hn phớa nam 10 Nguyn Thanh Long (2012), Bỏo cỏo tỡnh hỡnh cỏc bnh truyn nhim gõy dch v cỏc gii phỏp phũng chng, B Y t 47 11 Th Phng Linh (2012), k thuõt ELISA giỏn tip k thut xột nghim ký sinh trựng ng rut,Vin st rột - Ký sinh trựng - cụn trựng TP H Chớ Minh 12 Trn Th Xuõn Mai, Vừ Th Thanh Phng, Trn Th Hong Yn, Nguyn Vn Bộ(2011), Phỏt hin nhanh Salmonellaspp, Salmonella enterica hin din thc phm bng k thut PCR a mi, Tp khoa hc s 20, trang 198-208 13 Phm Thu Minh, Phan Thu Dũng, Trng Xuõn Liờn v cs (2007), Phat hin Salmonellaspptrong thc phm bng phng phỏp PCR Vin Pasteur TP.H Chớ Minh 14 Nguyn Duy Minh (2009), T in sinh hc, NXB giỏo dc Vit Nam 15 Nguyn Th Thanh Nhn (2009), Biu hin cỏc protein khỏng nguyờn ( H:gmv SEFA) ca S.Enteritidis trờn b mt ca t bo E.coli v Staphylococcus carnosus, Vin sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt 16 Nguyn Trớ Nhõn, Nguyn Hng Nhó Trõn, ng Th Phng Tho, Trn Linh Thc (2005), To dũng v biu hin gene mó húa khỏng nguyờn H,g:mcaSalmonella enteritidis t bo E.coli,Hi tho khoa hc ton quc v Cụng ngh sinh hc, hng 8.2, H Ni 17 ThS on Th Nguyn (2009), Vi sinh vt, NXB giỏo dc Vit Nam 18 ng Th Oanh (2013), Nghiờn cu t l lu hnh v phõn type cỏc chng Salmonella tht g ti sng ti bn tnh Trung v Nam B ca Vit Nam, i hc khoa hc T nhiờn 19 Ts Lờ Th Oanh(2012), Vi sinh vt y hc, NXB giỏo dc Vit Nam 20 Ts.Trn Cm Võn(2005), giỏo trỡnh vi sinh vt hc mụi trng, NXB i hc Quc gia H Ni 21 PGS.TS Lờ Vn Phng (2012), Vi khun y hc, NXB giỏo dc Vit Nam 48 22 Trn Linh Thc (2002), Phng phỏp phõn tớch vi sinh vt nc, thc phm v m phm, NXB giỏo dc 23 Nguyn V Trung (2009), nhy v c hiu ca PCR a mi xỏc nh trc tip Salmonellat bnh phm phõn, Tp Y hc thc hnh II Ti liu ting anh 24 Arunava D., Hari S S., Shalini U., Ganeshkumar A., Karthikeyan M., (2012), Molecular Characterisation of Salmonella enterica Serovar Typhi Isolated from Typhoidial Humans, Malaysian J Microbiol 8(3), pp 148- 155 25 Babalola O O., (2003), Moleculer techniques: An overview of method for the detection of bacteria, African Journal of Biotechnology Vol 2(12), pp.710-713 26 Bernner H W F., Stubbs D A., (1991), Phage typing of Salmonella enterica in the United State, J Clin Microbiol 29(12), pp 2817-2823 27 Crump J A., Luby S P, Mintz E D (2004), The global burden of typhoid fever, Bull World Health Organ, 82: 346-353 28 Foroshani N.S., Karami A and Pourali F (2013) Simultaneous and Rapid Detection of Salmonella Typhi, Bacillus anthracis, and Yersinia pestis by Using Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) Iran Red Cres Med J 2013;15(11):e9208 29 Fabre L., Hello S L., Roux C., I-Jeanjean S., Weill X F (2014), CRISPR is a optimal Target for the design of specific PCR assays for Salmonella enterica SerotypesTyphi and ParaTyphiA, Freely available online 30 Freitas C G., Santana A P., Silva P H., Gonỗalves V S., BarrosMde A., Torres F A., Murata L S., Perecmanis S (2010), PCR multiplex for detection of Salmonella Enteritidis, Typhi and Typhimurium and occurrence in poultry meat, Int J Food Microbiol, 139(1-2), pp 15-22 49 31 H.Herikstad, Y.Motarjemi, R.V.Tauxe (2002), Salmonella surveillance: a global survey of public health serotyping, Epidemiol Infect129 1-8 32 Imen S B., Ridha M., Makjoub A., (2007), Laboratory typing method for diagnostic of Salmonella strain, Monastir University Tunisia 33 Kumar S, Balakrishna K and Batra H V (2006) Detection of Salmonella enterica serovar Typhi (S Typhi) by selective amplification of invA, viaB, fliC-d and prt genes by polymerase chain reaction in mutiplex format Letters in Applied Microbiology 42, pp: 149-154 34 Kidgell C., Reichard U., Wain J., Linz B., Torpdahl M., Dougan G., Achtman M (2002), "Salmonella Typhi, the causative agent of typhoid fever, is approximately 50,000 years old", Infect Genet Evol, 2, pp 39-45 35 Mousavi S L., Salimiyan J., Rahgerdi A K., Amani J., Nazarian S., Ardestani H (2006), A rapid and specific PCR-ELISA for detecting Salmonella Typhi, Iranian J Clin Infect Dis., 1(3), pp 113-119 36 Popoff M Y., Minor L L (1997), Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 7th revision, World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Pasteur Institute, Paris, France 37 Pui C F., Wong W C., Chai L C., Lee H Y., Noorlis A., Zainazor T C T., Tang J Y H., Ghazali F M., Cheah Y K., Nakaguchi Y., Nishibuchi M., Radu S (2011), Multiplex PCR for the concurrent detection and differentiation of Salmonellaspp., Salmonella Typhi and Salmonella Typhimurium, Trop Med Health, 39(1), pp 9-15 38 Stephen G L., Herbert L DuPont, Linda Gaul, Raouf R Arafat, Beatrice J Selwyn, Joan Rogers, Eric Casey, (2010), Pulsed-field Gel Electrophoresis for Salmonella Infection Surveillance, Texas, USA, 2007, Emerg Infect Dis, 16(6) pp 983-985 50 39 Thong K L., Teh, C S J v Chua K H.,(2014) Development and evaluation of a Multiplex Polymerasechain Reaction for the detection of Salmonellaspecies, Tropical Biomedicine 31(4): 689-697 40 Taniuchi M., Verweij J J., Houpt E R (2011), Multiplex PCR method to detect Cyclospora, Cystoisospora, and Microsporidia in stool samples, Diagn Microbiol Infect Dis, 71(4), pp 386-390 41 Wilson M.A.R., Rimler B and Hofman L.J (1992) Comparisom of DNA fingerprints and somatic serotypes of serogroup B and E Pasteurella multocida J Clin Microbiol, 30 (6): 1518-1524 42 Ruschel L., Pinheiro V., Dias S.,(2007), Polymerase chain rection for the detection of Salmonellain artificially inoculated chicken meat, Review Insitu Medical Tropical SaoPaulo Vol (5) pp 247-250 [...]... multiplex PCR để phát hiện nhanh chóng và trực tiếp sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella enteritidis, Salmonella Typhi và Salmonella Typhimurium xuất hiện trong thịt gia cầm [30] Ở Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh Năm 2011, Trần Thị Xuân Mai đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện nhanh Salmonellaspp, Salmonella enterica hiện diện... phát hiện nhanh Salmonella Typhi bằng kỹ thuật multiplex PCR 1.3 Mục tiêu nghiên cứu - Lựa chọn được các cặp mồi đặc hiệu cho Samonella Typhi - Tối ưu được phản ứng mutiplex PCR phát hiện nhanh Samonella Typhi - Xác định được độ nhạy của kỹ thuật multiplex PCR phát hiện SamonellaTyphi 3 1.4 Ý nghĩa của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Samonella Typhi bằng kỹ thuật. .. Salmonella Typhi Gen chỉ thị là gen không thể thiếu cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các công trình nghiên cứu về phương pháp phát hiện Salmonella Typhi bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các gen làm chỉ thị phân tử như: Pui C F và cộng sự [37] đã sử dụng gen 23S rRNA làm gen chỉ thị để phát hiện 20 Salmonella Typhi Nargess S F và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật multiplex PCR khuếch đại gen invA, hp để phát hiện. .. thuật multiplex PCR khuếch đại gen invA, hp để phát hiện nhanh Salmonella Typhi Thong K L và cộng sự [39] đã sử dụng kỹ thuật multiplex PCR khuếch đại gen hil, spa, typ, IAC để phát hiện Salmonellaspecies.S Kumar và cộng sự (2005) đã sử dụng multiplex PCR để khuếch đại bốn trình tự gen invA, viaB, flic-d, prt nhằm phát hiện vi khuẩn Salmonella Typhi Gen prt là một phần của cụm gen rfb và mã hóa cho... (2011) đã sử dụng multiplex PCR để phát hiện nhanh đồng thời và sự khác biệt của vi khuẩn Salmonella spp, Salmonella Typhivà Salmonella Typhimurium Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình multiplex PCR có độ đặc hiệu cao cung cấp một phương pháp tiếp cận nhanh chóng và đáng tin cậy cho phép giám sát hiệu quả của các chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh [37] De 24 Freitas CG và cộng sự (2010) đã sử dụng multiplex. .. chết ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc - Đòi hỏi người thực hiện phải thành thạo về thao tác 23 2.5.3 Ứng dụng của multiplex PCR trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh So với các kỹ thuật phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh khác, kỹ thuật multiplex PCR là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức... multiplex PCR và mồi trong đó là cặp mồi đặc hiệu của vi khuẩn Yersinia pestis, Bacillus anthracis, và Salmonella Typhi Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của Khoa CNSH & CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh Salmonella Typhi 1.2 Mục đích nghiên cứu Xây dựng được quy trình phát. .. (2009) đã nghiên cứu “Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR đa mồi xác định trực tiếp Salmonella từ bệnh phẩm phân” sử dụng kỹ thuật multiplex- 25 PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho Salmonella và V cholerae với mục đích sử dụng để phát hiện cùng một lúc hai vi khuẩn này trong bệnh phẩm phân tiêu chảy Trên lâm sàng, việc xác định nhanh các vi khuẩn Salmonella bằng một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, sẽ có... quả, có thể được sử dụng để phát hiện các vi sinh vật từ các mẫu thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật trong vòng chưa đầy 24 giờ sẽ cho kết quả chính xác thay vì 4 - 5 ngày bằng phương pháp nuôi cấy thông thường [33] Đã và đang có nhiều nghiên cứu về ứng dụng này Điển hình như Nargess S F, Ali K, Fatemeh P (2013) đã tiến hành nghiên cứu sử dụng multiplex PCR phát hiện nhanh đồng thời Salmonella Typhi, Bacillus... paratose Gen này hiện diện trong phân loài Typhi, ParatyphiA và vài phân loài khác [33] Seyed Latif Mousavi và cộng sự (2006) đã sử dụng gen rfbE làm gen chỉ thị để phát hiện S Typhi bằng phương pháp PCR- ELISA, cặp mồi BS1 và BS2 đã được sử dụng để khuếch đại gen rfbE , kết quả của nghiên cứu cho thấy quy trình có độ đặc hiệu đạt 100% và giúp tăng độ nhạy lên 100 lần, giới hạn phát hiện trong PCR- ELISA là