Ứng dụng kỹ thuật NAT để phát hiện sớm HIV, HBV, HCV ở người cho máu

Bộ y tế ****** Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ ứng dụng kỹ thuật nat để phát hiện sớm hiv, HBV, hcv ở ngời cho máu Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Anh Trí PGS. TS. Bạch Khánh Hòa Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Huyết học Truyền máu TW 6909 26/6/2008 Hà Nội 2008 Bộ y tế ****** Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ ứng dụng kỹ thuật nat để phát hiện sớm hiv, HBV, hcv ở ngời cho máu Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Anh Trí PGS. TS. Bạch Khánh Hòa Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Huyết học Truyền máu TW Cấp quản lý: Bộ Y tế Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2005 đến tháng 12/2007 Tổng kinh phí : 350 triệu đồng (ba trăm năm mơi triệu đồng) Trong đó, kinh phí SNKH: 100% Hà Nội 2008 Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ 1. Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật nat để phát hiện sớm hiv, HBV, hcv ở ngời cho máu. 2. Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Anh Trí. PGS.TS. Bạch Khánh Hòa. 3. Th ký đề tài: Nguyễn Quốc Cờng Trần Vân Chi 4. Danh sách những ngời thực hiện chính: TT Họ và tên cán bộ thực hiện đề tài Học vị, học hàm, chức vụ Cơ quan công tác 1 Nguyễn Chí Tuyển Bác sỹ Viện Huyết học-Truyền máu TW 2 Nguyễn Quốc Cờng Cử nhân Viện Huyết học-Truyền máu TW 3 Chử Thị Thu Hờng Bác sỹ Nội trú Đại học Y Hà Nội 4 Nguyễn Minh Phơng Cử nhân Viện Huyết học-Truyền máu TW 5 Nguyễn Kim Dũng Kỹ thuật viên Viện Huyết học-Truyền máu TW 5. Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 10/2005 đến tháng 12/2007. Lời cảm ơn. Chúng tôi chân thành cảm ơn Vụ Khoa học và Đào tạo - Bộ Y tế, Ban lãnh đạo Viện Huyết học Truyền máu TW, Khoa Thu gom máu - Viện Huyết học - Truyền máu TW, Hãng CHIRON giúp đỡ và tạo điều kiện để chúng tôi hoàn thành tốt đề tài này. Bản tự đánh giá Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài KH&CN cấp Bộ 1. Tình hình thực hiện đề tài so với đề cơng: 1.1/ Về mức độ hoàn thành, khối lợng công việc: đã hoàn thành vợt mức khối lợng công việc so với đề cơng. Đề cơng đặt ra là 6000 mẫu thực hiện 9.392 mẫu. 1.2/ Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN: đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (NAT) thực hiện trong sàng lọc máu. 1.3/ Về tiến độ thực hiện : đã hoàn thành đúng tiến độ đề ra. 2. Về những đóng góp mới của đề tài: Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã đợc công bố trên các ấn phẩm trong và ngoài nớc đến thời điểm kết thúc đề tài, đề tài có những điểm mới sau đây: Về giải pháp Khoa học Công nghệ: ứng dụng kỹ thuật mới trong sàng lọc để thực hiện an toàn truyền máu. Hà Nội, ngày 26 tháng 1 năm 2008. Chủ nhiệm đề tài PGS. TS. Nguyễn Anh Trí Các chữ viết tắt A : Adenine AIDS : Aquired Immune Deficiency Symdrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) Anti HBs : Anti Hepatitis B surface (Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) Anti HBc : Anti Hepatitis B core (Kháng thể kháng kháng nguyên lõi virus viêm gan B) Anti HBe : Anti Hepatitis B e (Kháng thể kháng kháng nguyên e virus viêm gan B) Au : Australia BN : Bệnh nhân C : Cytosin DNA : Acid Desoxyribonucleic ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym) EIA : Enzyme Immunoassay (Kỹ thuật miễn dịch enzym) FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lý thực và dợc phẩm Hoa Kỳ) G : Guanin HBcAg : Hepatitis B core Antigen (Kháng nguyên lõi virus viêm gan B) HBsAg : Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) HBeAg : Hepatitis B e Antigen (Kháng nguyên e virus viêm gan B) HBV : Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) HCV : Hepatitis C virus (Virus viêm gan C) HH-TM TW: Huyết Học Truyền máu Trung Ương IC : Internal Control (Nội kiểm tra) KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể NAT : Nucleic acid testing (Xét nghiệm phát hiện acid nucleic) NCM : Ngời cho máu NCMCN : Ngời cho máu chuyên nghiệp NCMTN : Ngời cho máu tình nguyện NNCM : Ngời nhà cho máu PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) RNA : Acid Ribonucleic wTCR : working Target Capture Reagent (Hóa chất bắt giữ trình tự đích) T : Tymin TTUs : Ten tips Unit (Thanh chứa 10 tip đựng mẫu) TTC : Ten tips Cassette (Thanh có chứa 10 đầu côn để rửa) XN : Xét nghiệm Mục lục đặt vấn đề 1 Chơng I: tổng quan tài liệu 3 1.1. Lịch sử sàng lọc các tác nhân lây bệnh qua đờng truyền máu 3 1.1.1. Trên thế giới 3 1.1.2. Tại Việt Nam 5 1.2. Đặc điểm sinh học của HIV, HCV, HBV 6 1.2.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngời (HIV) 6 1.2.2. Virus viêm gan C 9 1.2.3. Virus viêm gan B 10 1.3. Các biện pháp bảo đảm an toàn truyền máu, phòng lây nhiễm HIV, HBV, HCV qua đờng truyền máu 14 1.3.1. Lựa chọn NCM an toàn 14 1.3.2. Các kỹ thuật sàng lọc huyết thanh HIV, HBV, HCV cho NCM 15 1.4. Kỹ thuật sàng lọc NAT 18 1.4.1. Cơ sở sinh học phân tử 18 1.4.2. Nguyên lý kỹ thuật 20 1.4.3. Các giai đoạn kỹ thuật 21 1.5. Tình hình áp dụng quy trình kỹ thuật sàng lọc NAT để phát hiện sớm NCM nhiễm HIV, HBV, HCV trên thế giới và tại Việt Nam 23 1.5.1. Trên thế giới 23 1.5.2. Tại Việt Nam 24 Chơng 2: đối tợng và phơng pháp 25 nghiên cứu 2.1 Đối tợng nghiên cứu 25 2.2 Vật liệu nghiên cứu 25 2.3 Phơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 27 2.3.2. Kỹ thuật NAT 29 2.4. Xử lý số liệu 37 Chơng III: Kết quả nghiên cứu 38 3.1. Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu 38 3.1.1. Kết quả xét nghiệm NAT của mẫu trộn 8 để phát hiện đồng thời cả 3 loại virus HIV, HBV, HCV 38 3.1.2. Kết quả tỉ lệ không có giá trị trong quá trình xét ngiệm 39 3.1.3. Số lần chạy có không có giá trị trong quá trình xét nghiệm 41 3.1.4. Kết quả xác định loại virus bằng Probe đặc hiệu 41 3.1.5. Kết quả xác định ngời cho máu bị nhiễm virus viêm gan C trong mẫu trộn dơng tính 43 3.1.6. Tỉ lệ nhiễm các virus đợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong nghiên cứu 43 3.1.7. Kết quả RT-PCR của mẫu bị nhiễm virus HCV 43 3.2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đợc các kỹ thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc máu và đào tạo 44 Chơng IV: Bàn luận 45 4.1 . Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu 45 4.1.1. Kỹ thuật NAT 45 4.1.2. Sử dụng trộn 8 46 4.1.3. Tỉ lệ dơng tính khi phát hiện đồng thời cả 3 loại virus HIV, HBV, HCV (Procleix Ultrio Assay) 47 4.1.4. Tỉ lệ không có giá trị trong quá trình xét nghiệm 49 4.1.5. Kết quả xác định loại virus bằng Probe đặc hiệu 51 4.1.6. Kết quả xác định ngời cho máu bị nhiễm virus viêm gan C trong mẫu trộn dơng tính 52 4.1.7. Tỉ lệ nhiễm các virus đợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong nghiên cứu 52 4.1.8. Kết quả RT-PCR và ELISA của mẫu bị nhiễm virus HCV 56 4.2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đợc các kỹ thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc máu và đào tạo 57 Kết luận 60 Kiến nghị 61 Tài liệu tham khảo Danh sách mẫu huyết tơng 1 đặt vấn đề Máu rất quan trọng và cần thiết cho sự sống, nhờ có máu mà nhiều ngời bệnh đã đợc cứu sống. Máu và chế phẩm máu có tầm quan trọng đặc biệt trong điều trị các bệnh máu cũng nh cần để cấp cứu các trờng hợp chảy máu sau đẻ, chảy máu do chấn thơng, tai nạn và thảm họa. Máu quan trọng nh vậy nhng truyền máu có thể gây tai biến cho ngời bệnh [18]. An toàn truyền máu là nội dung xuyên suốt trong chiến lợc truyền máu của Quốc gia, trong đó sàng lọc các tác nhân lây nhiễm qua đờng truyền máu đợc xem là một trong những nội dung then chốt [18]. Các tác nhân gây bệnh có thể đợc truyền từ máu và chế phẩm máu của ngời cho máu (NCM) đã nhiễm bệnh sang ngời thân. Căn nguyên gây các bệnh nhiễm trùng qua đờng máu có rất nhiều [54], [55], tuy nhiên theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới thì 3 virus bắt buộc phải đợc sàng lọc NCM là HIV, HBV, HCV [58], [102]. Trong sàng lọc NCM hiện nay, ngời ta dùng phơng pháp ELISA để phát hiện các kháng thể (KT) và các kháng nguyên (KN) của virus. Phơng pháp này có độ tin cậy khá cao, tuy nhiên nhợc điểm của phơng pháp là phụ thuộc rất nhiều vào đáp ứng miễn dịch của mỗi cá thể, giai đoạn cửa sổ còn khá dài, nguồn NCM cha thực sự an toàn. Do vậy, ngời ta vẫn gặp những trờng hợp bệnh nhân (BN) bị lây nhiễm virus do truyền máu nhiễm virus trong giai đoạn cửa sổ. Từ năm 1999, kỹ thuật NAT đã phát triển cho phép xác định trực tiếp HIV-RNA, HBV-DNA, HCV-RNA. Nhờ sử dụng phơng pháp này, ngời ta có thể loại trừ những mẫu máu có virus mà kỹ thuật huyết thanh học không phát hiện đợc, do đó làm giảm nguy cơ BN bị lây nhiễm virus do truyền máu trong giai đoạn cửa sổ. Cụ thể rút ngắn giai đoạn cửa sổ từ 80-90 ngày còn 23 [...]... còn nhiều hạn chế, vì vậy giai đoạn cửa sổ huyết thanh còn khá dài nên việc lây nhiễm các bệnh qua đờng truyền máu là khó tránh khỏi do không phát hiện đợc [19], [20], [30] Xuất phát từ thực trạng trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm mục tiêu: 1 Nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu 2 Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT)... viêm gan B, xuất hiện rất muộn sau 1-3 tháng kể từ khi HBV xâm nhập vào cơ thể, lúc đó HBsAg thờng hết trong huyết thanh Anti HBs có vai trò bảo vệ cơ thể chống tái nhiễm HBV do đó có giá trị đánh giá khả năng bảo vệ của cơ thể, đồng thời Anti HBs cũng có giá trị đánh giá hiệu quả của vaccin [72] - HBeAg (Hepatitis B e Antigen): Là một KN nhân của virus HBV, xuất hiện sau HBsAg, nồng độ của HBeAg tồn... dấu hiệu tốt của đáp ứng miễn dịch, khả năng lây truyền ở thời kỳ này rất thấp, virus đang trong thời kỳ nghỉ ngơi không sinh sản - HBcAg (Hepatitis B core Antigen): là KN lõi xuất hiện trong nhân tế bào gan, không xuất hiện trong huyết thanh hoặc có xuất hiện trong huyết thanh của những ngời có virus đang phát triển và nhân lên nhng cha có thử nghiệm thơng mại hoá để phát hiện HBcAg rất có giá trị chẩn... Thiết bị ủ trong môi trờng từ ; - Băng dính (Sealing card); - TTUs: Thanh chứa 10 ống nghiệm đựng mẫu; - Giá của TTUs; - TTC: Thanh có chứa 10 đầu côn để rửa 2.3 phơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu ở đây chúng tôi đã áp dụng thiết kế nghiên cứu ngang, tiến cứu để phát hiện số mẫu nhiễm HIV, HBV, HCV trong các mẫu máu đã đợc sàng lọc âm tính với phơng pháp ELISA Các mẫu huyết tơng của NCM đợc... Viện Huyết Học -Truyền Máu Trung Ương, từ 1/2007 bắt đầu tiến hành nghiên cứu ứng dụng quy trình sàng lọc NAT để phát hiện sớm NCM nhiễm HIV, HBV, HCV 25 Chơng II đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tợng nghiên cứu - Tiêu chuẩn tuyển chọn NCM: Dựa theo Điều lệnh truyền máu về tuyển chọn ngời cho máu của Bộ Y Tế đã ban hành năm 1992 [5] và Quy chế truyền máu năm 2007 [6] - Đối tợng nghiên cứu là 9.392... kháng thể thấp trong giai đoạn cửa sổ Điều này cũng đã đợc chứng minh bởi McCoy và cộng sự (1999) [83], ông thông báo rằng 90% ngời nhiễm HCV sản xuất kháng thể trong vòng 3 tháng phơi nhiễm và 10% sản xuất kháng thể trong thời gian lâu hơn nữa, vì vậy nên XN lại trong vòng 6 tháng sau phơi nhiễm Ngoài ra, trong trờng hợp hệ thống miễn dịch bị suy giảm làm giảm hoặc cản trở đáp ứng sinh kháng thể nh... là ngời nghiên cứu thành công trong việc sản xuất kít ELISA thế hệ thứ nhất để chẩn đoán tình trạng nhiễm HCV [18] Năm 1989, tác nhân gây viêm gan non A- non B đã đợc sáng tỏ [18] Các nhà khoa học đã phân lập đợc virus viêm gan C và họ đã lai tạo thành công dòng vô tính của virus từ E.coli chủng C-300-3 và từ kết quả này họ đã 4 sử dụng KN C-300-3 để phát hiện KT chống HCV trong huyết thanh của BN viêm... mỗi monomer trong DNA gọi là nucleotid và trong RNA thì gọi là ribonucleotid Mỗi nucleotid gồm ba thành phần: - Một base nitơ: Có 4 loại là A (Adenin), G (Guanin) và T (Tymin), C (Cytosin) Trong đó A, G là dẫn xuất của purin có kích thớc lớn còn T, C là dẫn xuất của pyrimidin có kích thớc nhỏ hơn - Một phân tử đờng pentose - Một nhóm phosphat Vị trí cácbon trên mạch vòng của đờng pentose đợc đánh dấu... tồn từ thế hệ này sang thế hệ khác Trên cơ sở nghiên cứu bằng phơng pháp nhiễu xạ tia X của Rosalid Franklin và Maurice Wilkins năm 1950, cho thấy DNA là một cấu trúc xoắn, 19 tiếp theo là E Chargaff với quy luật về sự tơng ứng của A và T, của G và C và một số đặc tính hoá học của DNA Năm 1953, J D Watson và F H C Crick đã đa ra mô hình không gian ba chiều của DNA [10] Cả DNA và RNA đều là những phân... trớc khi cơ thể sinh KT trong giai đoạn cửa sổ của bệnh hoặc trong giai đoạn muộn của AIDS khi đó cơ thể có thể ngừng sản xuất KT 1.3.2.2 Thử nghiệm ngng kết hạt vi lợng phát hiện KT kháng HIV Nguyên lý: Đây là phản ứng ngng kết, dạng ngng kết hồng cầu thụ động Phản ứng đợc thực hiện nhờ các hạt gelatin có gắn kháng nguyên HIV1 và HIV-2, các hạt gelatin này sẽ cho phản ứng ngng kết nếu trong huyết thanh . tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm mục tiêu: 1. Nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu. 2. Xây dựng labo sinh học phân. III: Kết quả nghiên cứu 38 3.1. Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu 38 3.1.1. Kết quả xét nghiệm NAT của mẫu trộn. Chơng 2: đối tợng và phơng pháp 25 nghiên cứu 2.1 Đối tợng nghiên cứu 25 2.2 Vật liệu nghiên cứu 25 2.3 Phơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 27 2.3.2. Kỹ thuật NAT 29 2.4.