ỨNG DỤNG kỹ THUẬT BOBS để PHÁT HIỆN một số hội CHỨNG LỆCH bội và mất đoạn NHỎ NHIỄM sắc THỂ của THAI TRONG CHẨN đoán TRƯỚC SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHAN THỊ THU GIANG øng dụng kỹ thuật Bobs để phát số hội chứng lệch bội đoạn nhỏ nhiễm sắc thể thai chẩn đoán trớc sinh LUN VN THC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHAN THỊ THU GIANG øng dông kü thuËt Bobs để phát số hội chứng lệch bội đoạn nhỏ nhiễm sắc thể thai chẩn đoán trớc sinh Chuyờn ngnh : Y sinh hc - Di truyền Mã số : 60720106 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, nhận hướng dẫn quý báu, giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, anh chị, bạn bè gia đình Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, phòng Quản lí đào tạo Sau đại học, Bộ mơn Y sinh học – Di truyền trường Đại học Y Hà Nội, Trung tâm Chẩn đoán trước sinh – Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương tạo điều kiện, giúp đỡ tơi tận tình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan người hết lịng giúp đỡ, dạy bảo, dìu dắt, hướng dẫn tơi suốt q trình làm luận văn trình nghiên cứu, học tập, truyền cho niềm say mê nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới anh chị kỹ thuật viên Trung tâm Chẩn đoán trước sinh – Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương hướng dẫn, giúp đỡ tơi nhiệt tình q trình nghiên cứu Các Thầy cô hội đồng khoa học thông qua đề cương đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Xin cảm ơn bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ln động viên tôi, bạn bè giúp đỡ, chia sẻ khó khăn với tơi suốt q trình hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2017 Phan Thị Thu Giang LỜI CAM ĐOAN Tôi Phan Thị Thu Giang, học viên lớp Bác sỹ nội trú khóa 40, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Y sinh học – Di truyền, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Hồng Thị Ngọc Lan Cơng trình không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 18 tháng 09 năm 2017 Người viết cam đoan Phan Thị Thu Giang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFP AS BN BoBs CGH DGS DNA DTBS FISH HC HTM IC ID KQ MDS MLPA NST PAPP – A PCR PWS QF – PCR RAT SMS TKSSG uE3 UPD WBS WHS βhCG : Alpha fetoprotein : Angelman Syndrome LGS : Langer – Giedion Syndrome : Bệnh nhân : Bacterial artificial chromosome – on – beads : Microarray – based comparative genomic hybridization : DiGeorge Syndrome : Acid Deoxyribonucleic : Dị tật bẩm sinh : Fluorescent in stitu hybridization : Hội chứng : Huyết mẹ : Imprinting centre : Impriting detect : Kết : Miller – Dieker Syndrome : Multiplex ligation-dependent probe amplification : Nhiễm sắc thể : Pregnancy – associated plasma protein A : Polymerase chain reaction : Prader – Willi Syndrome : Quantitative fluorescent - polymerase chain reaction : Rapid aneuploidy testing : Smith – Magenis Syndrome : Tăng khoảng sáng sau gáy : Unconjugated Estriol : Maternal uniparental disomy 15 : William – Beuren Syndrome : Wolf – Hirschhorn Syndrome : Beta – Human chronic gonadotropin MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Một số hội chứng vi đoạn NST phát kỹ thuật BoBs 1.2 Tầm quan trọng chẩn đoán trước sinh .17 1.3 Đối tượng cần làm chẩn đoán trước sinh 18 1.4 Xét nghiệm trước sinh không xâm lấn 20 1.5 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh 23 1.5.1 Các phương pháp lấy tế bào thai 23 1.5.2 Những kỹ thuật di truyền áp dụng chẩn đoán trước sinh 24 1.6 Kỹ thuật Bacs-on-Beads 28 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu .35 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 35 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ .36 2.2 Địa điểm nghiên cứu địa điểm phân tích mẫu 36 2.3 Thời gian nghiên cứu 36 2.4 Phương tiện nghiên cứu 36 2.4.1 Dụng cụ .36 2.4.2 Hóa chất 37 2.5 Phương pháp nghiên cứu 37 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu .37 2.5.2 Cỡ mẫu nghiên cứu .37 2.6 Kỹ thuật sử dụng 37 2.6.1 Chuẩn bị mẫu DNA .39 2.6.2 Tách chiết DNA 39 2.6.3 Phương pháp định lượng DNA 39 2.6.4 Các bước quy trình thực kỹ thuật BoBs 40 2.7 Phân tích kết 45 2.8 Xử lý phân tích số liệu .47 2.9 Đạo đức nghiên cứu 47 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 Một số đặc điểm sinh học nhóm đối tượng nghiên cứu 48 3.1.1 Tuổi thai phụ .48 3.1.2 Tuổi thai 49 3.2 Kết kỹ thuật Bobs 50 3.3 Đánh giá giá trị kỹ thuật BoBs 51 3.3.1 Hình ảnh siêu âm thai nghiên cứu .51 3.3.2 Kết siêu âm thai với trường hợp có kết BoBs bất thường 52 3.3.3 Kết sàng lọc huyết mẹ nhóm nghiên cứu 53 3.3.4 Kết sàng lọc HTM với trường hợp có kết BoBs bất thường 54 3.3.5 Sự tương đồng kỹ thuật BoBs kỹ thuật di truyền tế bào .55 3.3.6 Kết di truyền tế bào nhóm nghiên cứu 55 Chương 4: BÀN LUẬN .70 4.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu 70 4.1.1 Về tuổi thai phụ 70 4.1.2.Về tuổi thai 72 4.2 Bàn luận kết kỹ thuật BoBs 73 4.3 Đánh giá giá trị kỹ thuật BoBs 74 4.3.1 Đối chiếu kết siêu âm thai với kết BoBs .74 4.3.2 Đối chiếu kết sàng lọc huyết mẹ với kết BoBs 79 4.3.3 Đánh giá tương đồng kỹ thuật BoBs kỹ thuật di truyền tế bào 80 4.3.4 Đối chiếu kết kỹ thuật BoBs với kết di truyền tế bào 82 KẾT LUẬN 89 KIẾN NGHỊ 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh đặc điểm chẩn đoán trước sinh làm phương pháp khác 31 Bảng 2.1 Bảng tính nồng độ DNA cần cho phản ứng Bobs 41 Bảng 2.2 Bảng tính thể tích dung dịch Labeling Mix 41 Bảng 2.3 Bảng tính thể tích dung dịch Hybridization Bead Mix 43 Bảng 2.4 Bảng tính thể tích dung dịch Reporter Mix 44 Bảng 2.5 Các loại đột biến tương ứng với tỷ lệ tín hiệu huỳnh quang 45 Bảng 3.1 Tuổi trung bình thai phụ .48 Bảng 3.2 Tuổi thai thời điểm chọc hút nước ối .49 Bảng 3.3 Kết chẩn đoán kỹ thuật BoBs 50 Bảng 3.4 Đối chiếu kết BoBs với hình ảnh siêu âm thai .51 Bảng 3.5 Đối chiếu kết siêu âm thai với trường hợp có kết BoBs bất thường 52 Bảng 3.6 Đối chiếu kết sàng lọc huyết mẹ với kết BoBs .53 Bảng 3.7 Đối chiếu kết sàng lọc huyết mẹ với trường hợp có kết BoBs bất thường 54 Bảng 3.8 Đối chiếu kết kỹ thuật BoBs với kết di truyền tế bào .55 Bảng 3.9 So sánh chi tiết trường hợp bất thường kỹ thuật BoBs kỹ thuật di truyền tế bào .56 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố thai phụ theo tuổi 48 Biểu đồ 3.2 Sự tương đồng kết di truyền tế bào kỹ thuật BoBs 55 76 Trần Danh Cường (2011) Gía trị siêu âm hình ảnh khơng phân chia não trước chẩn đốn trước sinh Tạp chí y học., 74, 247 – 251 77 B G (2001) La pratique du diagnostic prenatal Masson 78 ISCN (2005 – 2009) An interntional system for nomenclature human cytogenetic 79 Wald N J., Hacks haw A K et al (1999) Integated screening for Down’s symdrome based on test performed during the first and second trimesters New England Journal of Medicine, 341, pp 461 – 467 80 Hoàng Thị Ngọc Lan (2005) Sàng lọc chẩn đoán trước sinh hội chứng Down luận án tiến sỹ Y học trường Đại học Y Hà Nội 81 Giovanni C et al (2005) Re-evaluation of risk for Down syndrome by means of the combined test in pregnant women of 35 years or more Prenat Diagn,, 25, 133-136 82 Practice Bulletin (2016) Screening for Fetal Aneuploidy Obstet Gynecol, 127 (5), e123-137 83 Practice Bulletin (2016) Prenatal Diagnostic Testing for Genetic Disorders Obstet Gynecol, 127 (5), 976-978 84 Wu J., He Z., Lin S et al (2016) Prenatal diagnosis of 1p36.3 microdeletion in a fetus with complex heart defect Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 33 (3), 353-356 85 Practice Bulletin (2016) Screening for Fetal Aneuploidy Obstet Gynecol, 127 (5), 979-981 86 Overhauser J., Huang, Gersh, Wilson, McMahon, JBengtsson, Rojas, Meyer, Wasmuth (1994) Molecular and phenotypic mapping of the short arm of chromosome 5: sublocalization of the critical region for the cridu-chat syndrome Hum Molec Genet,, 3, 247-252 87 Cuckle H., Kellner L.H (1999) On behalf of the Collaborative Study group Collaborative study of maternal urine β-core hCG screening for Down’s syndrome Prenatal Diagnosis, 19, pp 911-917 88 Jockson L et al (1992) Randomized comparison of trancervical and transabdominal chorionic villus sampling New England Journal of Medicine, Vo327, pp 594 – 598 89 Tongsong T W C., Pongsatha S, Sudasana J (2000) Prenatal sonographic diagnosis of Larsen syndrome J Ultrasound Med, 19, 419–421 90 Phan Trình Duyệt (2003) Hướng dẫn thực hành thăm dò sản khoa, Nhà xuất y học 91 Kassanos D A E., Trakakis E et al (2009) Predictive value of increased nuchal translucency as a screening test for the detection of fetal chromosomal abnormalities J Matern Fetal Neonnatal Med, 22 (10), pp 857-862 92 Mansfield E S (1993) Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms Hum Mol Genet, 2, 43-50 93 Ochshorn Y., Jonish A., Yaron Y (2006) Rapid prenatal diagnosis of aneuploidy for Chromosomes 21, 18, 13, and X by quantitative fluorescence polymerase chain reaction Fetal Diagn Ther 2, 326-331 94 Pertl B., Kroisel P., Tului L., Brambati B., Adinolfi M (1999) Rapid detection of chromosome aneuploidies by quantitative fluorescence PCR: first application on 247 chorionic villus samples J Med Genet, 36, 300-303 95 Kozlowski P., Hickmann G., Stressig R., Knippel A.J (2006) Quantitative fluorescent polymerase chain reaction versus cytogenetics: risk-related indication and clinical implementation of nondetected chromosomal disorders Fetal Diagn, Ther 21, 217-223 96 Mansfield E S (1993) Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms Hum Mol Genet, 2, 43-50 97 Xiang B., Valentin D et al (2008) Analytical and clinical validity of wholegenome oligonucleotide array comparative genomic hybridization for pediatric patients with mental retardation and developmental delay Am J Med Genet A,, 146A, 1942–1954 98 Tyson C, Locker R et al (2005) Submicroscopic deletions and duplications in individuals with intellectual disability detected by arrayCGH Am J Med Genet A, 139, 173–185 99 Schouten JP, Waaijer R et al (2002) Relative quantifcation of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification 30 (12) 100 Murugan S, Lakshmi BR (2010) Use of multiplex ligation-dependent probe amplifcation (MLPA) for Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene mutation analysis 132, 303 - 311 101 Kent K.S Lai et al (2006) Detecting exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation (MLPA) 39, 367 – 372 102 Gross S.J., Bajaj K Garry D (2011) Rapid and novel prenatal molecular assay for detecting aneuploidies and microdeletion syndromes Prenatal Diagnosis, 31, 295-366 103 Choy R K., Chen Y., Sun X F et al (2014) BACs-on-beads: a new robust and rapid detection method for prenatal diagnosis Expert Rev Mol Diagn, 14 (3), 273-280 104 Vialard F., Simoni G., Gomes D M et al(2012) Prenatal BACs-onBeads: the prospective experience of five prenatal diagnosis laboratories Prenat Diagn, 32 (4), 329-335 105 Vialard F., Simoni G., Aboura A et al (2011) Prenatal BACs-on-Beads a new technology for rapid detection of aneuploidies and microdeletions in prenatal diagnosis Prenat Diagn, 31 (5), 500-508 106 Piotrowski K., Halec W., Wegrzynowski J et al (2014) Prenatal diagnosis of Langer-Giedion Syndrome confirmed by BACs-on-Beads technique Ginekol Pol, 85 (1), 66-69 107 Sheath K.L., Duffy L., Asquith P et al (2013) Bacterial artificial chromosomes (BACs)-onBeadsTM as a diagnostic platform for the rapid aneuploidy screening of products of conception Mol Med Rep, (650-4) 108 Garcia-Herrero S., Campos-Galindo I., Martinez-Conejero J A et al (2014) BACs-on-Beads technology: a reliable test for rapid detection of aneuploidies and microdeletions in prenatal diagnosis Biomed Res Int, 2014, 590298 109 Shaffer LG, Morton SA, Alliman S, Burleson J, Traylor R et al (2011) The development of a rapid assay for prenatal testing of common aneuploidies and microdeletion syndromes Prenat Diagn, 31(8), 778–787 110 Shaffer L G., Coppinger, J., Morton, S A., Alliman, S., Burleson, J., Traylor, R., Walker, C., Byerly, S., Lamb, A N., Schultz, R., Ravnan, J B., Kashork, C D., Torchia, B S., Sulpizio, S., Sundin, K., Schermer, M., Adler, K., Dallaire, S and Ballif, B C (2011) The development of a rapid assay for prenatal testing of common aneuploidies and microdeletion syndromes Prenat Diagn,, 31, 778–787 111 Cheng Y.K., Wong C Wong H.K (2013) The detection of mosaicism by prenatal BoBs Prenat Diagn, 33, 42-49 112 Piotrowski K., Henkelman M Zajaczek S (2012) Will the new molecular karyotyping BACs-on-Beads technique replace the traditional cytogenetic prenatal diagnostics? Preliminary reports Ginekol Pol, 83 (284-290) 113 García-Herrero S., Campos-Galindo I., Martínez-Conejero et al (2014) BACs-on-Beads technology: a reliable test for rapid detection of aneuploidies and microdeletions in prenatal diagnosis Biomed Res Int, 2014, 114 Nguyễn Thị Vân Anh (2016) Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật BoBs chẩn đoán trước sinh số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể Luận văn tốt nghiệp bác sỹ nội trú Đại học y Hà Nội 115 Phan Thị Minh Ngọc (2011) Một số đặc điểm xét nghiệm đông cầm máu phụ nữ mang thai tháng đầu Hà Nội Tạp chí y học thực hành, 7, 152-154 116 Nguyễn Thị Vân Anh (2013) Nghiên cứu đặc điểm số bất thường đông máu phụ nữ mang thai Trường đại học Y Hà Nội, Hà Nội 117 Sherman S L., Petersen M B., Freeman S B et al (1994) Nondisjunction of chromosome 21 in maternal meiosis I: evidence for a maternal age-dependent mechanism involving reduced recombination Hum Mol Genet, (9), 1529-1535 118 Valderramos S G., Rao R R., Scibetta E W et al (2016) Cell-free DNA screening in clinical practice: abnormal autosomal aneuploidy and microdeletion results Am J Obstet Gynecol, 215 (5), 626.e621-626.e610 119 Nguyễn Duy Ánh (2017) Ứng dụng kỹ thuật Prenatal BoBs chẩn đoán trước sinh số bất thường nhiễm sắc thể bệnh viện phụ sản Hà Nội Tạp chí phụ sản, 15 (02), 30-33 120 Aagaard-Tillery KM, Nyberg DA et al (2009) Role of second-trimester genetic sonography after Down syndrome screening First and Second Trimester Evaluation of Risk Research Consortium Obstet Gynecol, 41, 247-261 121 Phan Thị Ngọc Minh (2016) Chẩn đoán trước sinh hội chứng DiGeorge Y học sinh sản 122 Trần Danh Cường (2005) Một số nhận xét kết chọc hút nước ối chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản Trung ương Nội san Sản phụ khoa, Số đặc biệt, 348-356 123 Hoàng Thị Ngọc Lan, Trần Danh Cường, Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2006) Phân tích NST tế bào ối ni cấy có đối chiếu với kết siêu âm thai test sang lọc trước sinh Tạp chí nghiên cứu y học, phụ trương 40 (1) – 2006 124 Nguyễn Việt Hùng (2006) Xác định giá trị số phương pháp phát dị tật bẩm sinh thai nhi tuổi thai 13 - 26 tuần luận án tiến sỹ Y học trường Đại học Y Hà Nội., 125 Gotsch F., Romero R., Espinoza J et al (2010) Prenatal diagnosis of truncus arteriosus using multiplanar display in 4D ultrasonography The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine, 23 (4), 297-307 126 Biswas A B Furniss F (2016) Cognitive phenotype and psychiatric disorder in 22q11.2 deletion syndrome: A review Res Dev Disabil, 5354, 242-257 127 Chen Y N., Chen C P., Ko T M et al (2016) Prenatal diagnosis of 22q11.2 deletion syndrome associated with right aortic arch, left ductus arteriosus, cardiomegaly, and pericardial effusion Taiwan J Obstet Gynecol, 55 (1), 117-120 128 Nandhagopal R., Udayakumar A M (2014) Cri-du-chat syndrome Indian J Med Res, 140 (4), 570-571 129 Kristoffersen K E., Garmann N G , Simonsen H G (2014) Consonant production and intelligibility in cri du chat syndrome Clin Linguist Phon, 28 (10), 769-784 PHỤ LỤC Locus gen sử dụng kit PHỤ LỤC CÁC BƯỚC THỰC HIỆN 1.1 Chuẩn bị: Chuẩn bị mẫu ADN: - Sau ADN tách chiết đo kiểm tra nồng độ Nồng độ ADN sử dụng cho xét nghiệm từ 50-100 ng - DNA bảo quản môi trường Tris-EDTA (pH 7.2) - oC năm; -20oC vòng năm; -70 oC cho năm 1.2.Các bước thực Quy trình thực với bước chính: + Bước 1: Gắn nhãn DNA: sử dụng enzyme Polymerase để nối nucleotide gắn biotin + Bước 2: Tinh DNA gắn nhãn hóa chất tinh cho sản phẩm PCR + Bước 3: Lai DNA: sản phẩm DNA gắn nhãn lai với hạt BoBs qua đêm + Bước 4: Rửa sản phẩm gắn phân tử huỳnh quang để nhận biết tín hiệu + Bước 5: Sử dụng Luminex 100/200 để đọc tín hiệu BoBsoft để phân tích tín hiệu thành kết Lưu ý: Đưa hóa chất khỏi tủ âm sâu để hóa chất nhiệt độ phòng từ 15 – 30 phút trước sử dụng Đảm bảo hóa chất rã đông trước sử dụng: - Mẫu DNA tinh - Random Primer Solution - Biotin-dNTP Mix - Enzyme Polymerase Đưa hóa chất từ tủ lạnh (2 – oC) để hóa chất nhiệt độ phòng từ 15 – 30 phút trước sử dụng: - Sample Diluent (dung dịch pha loãng) - DNA chứng (nữ) - DNA chứng (nam) Trước sử dụng, lắc (vortex) ly tâm nhanh (spin down) mẫu DNA thực, mẫu DNA chứng hóa chất sử dụng (NGOẠI TRỪ POLYMERASE) Để hóa chất nhiệt độ phòng để đảm bảo độ hòa tan độ đồng tối đa Bước 1: Ghi nhãn DNA (Labeling of Genomic DNA) 1.1.Ghi nhãn đĩa PCR ống PCR 250µL dải ống PCR 1.2.Chuẩn bị phản ứng cho DNA chứng (chứng nam, chứng nữ) Chuyển 50 ng DNA chứng nam chứng nữ vào ống tương đương Thêm Sample Diluent để đủ thể tích ống 24µL 1.3.Chuẩn bị phản ứng cho DNA thực Chuyển 240 ng DNA mẫu thực vào ống tương đương Thêm Sample Diluent để đưa thể tích ống tới 24µL Ghi chú: 24 µL thể tích bắt buộc cho ống mẫu Các mẫu DNA đầu vào với nồng độ 200ng/µL) Nếu nồng độ dải 150 – 200 ng/µL, DNA sử dụng trực tiếp 3.3.Pha lỗng sử dụng dung mơi TE: Thể tích TE cần cho = ((nồng độ đo được/200) x 18.5) – 18.5 µL 3.4.Tạo sơ đồ mẫu cho đĩa thực bước ủ để mẫu đánh dấu với giếng 3.5 Sử dụng bảng sau để chuẩn bị Hybridization Mix cho bước lai ủ Thể tích thừa tính tốn: Hóa chât Thể tích/phản ứng (uL) Hybridization 11 Buffer BACs-on-Beads 1.0 Số phản ứng Thể tích cần (uL) Mix Tổng thể tích Hybridization Mix (uL) 3.6 Đảm bảo Hybridization Buffer đạt nhiệt độ phòng Vortex kỹ lần, lần 10 giây spin down 3.7.Pipette lượng Hybridization Buffer cần thiết vào ống ly tâm 1.5mL Ghi chú: Khi hút dung dịch Hybridization Buffer, hút chậm độ nhớt dung dịch cao 3.8 Vortex BACs-on-Beads Mix kỹ lần, lần 10 giây trước dùng hút lượng thể tích cần thiết vào ống Hybridization Mix 3.9 Ly tâm nhanh Hybridization Mix vortex ký lần, lần 10 giây 3.10 Chuyển 11 uL Hybridization Mix vào giếng sơ đồ bước 3.4 3.11 Chuyển 5µL DNA mẫu tinh vào đáy giếng có chứa Hybridization Mix 3.12 Đậy chặt nắp đĩa cho giếng với nắp thích hợp 3.13.Chuyển đĩa mẫu ủ vào máy TriNEST 52 oC lắc 800 vòng x phút 3.14 Đặt đĩa vào máy PCR biến tính 85 oC phút, hạ nhiệt xuống tới 52 oC 3.15 Khi máy PCR đạt 52 oC, đưa đĩa khỏi máy PCR lần đảm bảo nắp đĩa đóng thật chặt 3.16 Để đĩa nhanh vào máy lắc ủ 52 oC lắc 800 vòng vòng 16 – 20 tiếng 3.17 Lấy túi đá từ tủ lạnh âm sâu để hạ nhiệt máy lắc ủ bước Bước 4: Rửa DNA gắn phân tử báo cáo (DNA Washing and Reporter binding) 4.1.Bật máy Luminex 100/200 để laser hệ thống khởi động trước 30 phút trước sử dụng 4.2 Lấy Wash Buffer từ tủ lạnh 4.3 Bổ sung dung dịch rửa (Wash Buffer 1) cho đủ 125µL cho giếng (nếu sử dụng pipette đa kênh nên lấy thêm lượng dịch cho đủ vào giếng) 4.4 Lấy đĩa ủ lai từ máy lắc ủ (52 oC) cài chế độ 50 oC cho máy lắc ủ 4.5.Tháo nắp giếng cẩn thận nhẹ nhàng Thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Hút lên xuống 10 lần nhanh liên tục để trộn dung dịch 4.6 Ủ đĩa 50 oC ủ lắc 1200 vòng x 20 phút 4.7 Chuẩn bị dụng cụ để hạ máy lắc ủ xuống 37 oC 4.8.Trong lúc chờ đợi, lấy Reporter Concentrate, Reporter Diluent, Wash Buffer từ tủ lạnh chuẩn bị Reporter Mix 4.9.Sử dụng bảng sau để tính tốn lượng hóa chất cần thiết: Hóa chât Thể tích/phản ứng Số phản ứng Thể tích cần (uL) (uL) Reporter 0.45 Concentrate Reporter Diluent 112.5 Tổng thể tích Reporter Mix (uL) 4.10 Hút dung dịch Reporter Diluent vào ống thích hợp 4.11 Trộn dung dịch Reporter Concentrate giây, ly tâm nhanh hút lượng dung dịch cần thiết vào ống Reporter Mix Ngay lập tức, gói ống Reporter Mix vào giấy bạc để tránh ánh sáng 4.12.Trộn dung dịch Reporter Mix giây 4.13 Đĩa lọc 0.45um sử dụng cho rửa gắn phân tử Reporter Tạo sơ đồ mẫu đĩa tương tự bước 3.4 4.14.Đậy lại giếng chưa sử dụng đĩa lọc với miếng dán đĩa nhựa 4.15.Tính tốn thể tích dung dịch rửa (Wash Buffer 2) cần thiết để đảm bảo cho giếng có 0.47 mL (thêm thể tích để bù trừ sử dụng pipette đa kênh) 4.16.Thêm 30uL Wash Buffer vào giếng sử dụng đĩa lọc để tạo ẩm cho giếng Không chạm màng đĩa lọc 4.17.Lấy đãi ủ lai khỏi máy lắc ủ (50 oC) Ngay lập tức, cài đặt máy vào chế độ lắc 37oC Đưa đá tủ âm sâu vào máy lắc ủ, tháo giá đỡ đĩa để hạ nhiệt máy xuống 37 oC Sau đó, chuyển tồn dung dịch giếng đĩa ủ lai sang đĩa lọc tạo ẩm 4.18.Sử dụng hệ hút chân không áp suất 125 mmHg, áp dụng hút giây để hút dung dịch sau chuyển Hút toàn dung dịch giếng dừng lại hết dung dịch 4.19.Thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Không chạm màng lọc Lặp lại bước 4.18 4.20.Cho thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Không chạm màng lọc Lặp lại bước 4.18 4.21 Lau khô đáy đĩa lọc giấy thấm 4.22 Thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Không chạm màng lọc Ghi chú: Đảm bảo máy lắc ủ đạt 37 oC thời điểm Không đợi 15 phút giữ đĩa lọc nhiệt độ phòng bảo khỏi ánh sáng 4.23.Ủ đĩa lọc máy lắc ủ 37 oC 30 phút 4.24 Sau bước ủ với Reporter Mix, sử dụng hút chân không để loại bỏ dung dịch đĩa 4.25 Cho thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Lặp lại bước 4.18 4.26 Lau khô đáy đĩa lọc giấy thấm 4.27 Cho thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Không chạm màng lọc Ghi chú: Không hút chân không sau bước Đĩa lọc chuyển đọc với hệ thống Luminex 100/200 Nếu bước đo không thực ngay, gói đĩa giấy bạc để bảo vệ khỏi ánh sáng ... bội đoạn nhỏ nhiễm sắc thể thai chẩn đoán trước sinh? ?? với hai mục tiêu: Mô tả số lệch bội đoạn nhỏ NST thai chẩn đoán trước sinh kỹ thuật Bobs Đánh giá giá trị kỹ thuật Bobs chẩn đoán trước sinh. .. đó, kỹ thuật BoBs sử dụng cho chẩn đoán trước sinh phù hợp Kỹ thuật áp dụng phổ biến giới, Việt Nam kỹ thuật BoBs cịn chúng tơi tiến hành đề tài: ? ?Ứng dụng kỹ thuật Bobs để phát số hội chứng lệch. .. GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHAN THỊ THU GIANG øng dụng kỹ thuật Bobs để phát số hội chứng lệch bội đoạn nhỏ nhiễm sắc thể thai chẩn đoán trớc sinh Chuyờn ngnh : Y sinh học