PHÂN LẬP VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE, SO SÁNH MỨC ĐỘ GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEO CAI SỮA VÀ HEO THỊT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE, SO SÁNH MỨC ĐỘ GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEO CAI SỮA VÀ HEO THỊT Họ tên sinh viên : HUỲNH LÊ NGỌC DIỄM Ngành : Thú Y Lớp : Thú Y 29 Niên khóa : 2003 - 2008 Tháng 09/2008 PHÂN LẬP VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE, SO SÁNH MỨC ĐỘ GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEO CAI SỮA VÀ HEO THỊT Tác giả HUỲNH LÊ NGỌC DIỄM Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu Cấp bác sỹ ngành Thú y Giáo viên hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Phước Ninh BSTY Đỗ Tiến Duy BSTY Lâm Thị Tú Anh Tháng 09/2008 i LỜI CẢM TẠ Kính dâng lên cha mẹ, người sinh thành, dạy dỗ, nuôi nấng điểm tựa tinh thần cho sống Xin trân trọng cảm ơn: Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Ban chủ nhiệm Bộ môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập nghiên cứu tơi Trân trọng biết ơn quý thầy, cô: Khoa Chăn Nuôi Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM truyền đạt kiến thức quý báu tận tình dẫn em suốt q trình học tập Khắc ghi cơng ơn: ThS Nguyễn Thị Phước Ninh BSTY Đỗ Tiến Duy BSTY Lâm Thị Tú Anh Đã tận tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ em nhiều suốt q trình thực nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp Xin cảm ơn: Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Ban quản lý Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Ban quản lý Trạm Thú Y quận Bình Thạnh Ban quản lý Trạm Thú Y quận Ban Giám Đốc Xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong Các cô chú, anh chị công tác Bệnh Viện Thú Y, Trung Tâm Phân Tích, xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Xin gửi lời cảm ơn đến tất bạn bè tôi, lớp thú y 29 giúp đỡ chia vui buồn thời gian học tập ii TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đề tài “Phân lập ứng dụng kỹ thuật PCR để phát Mycoplasma hyopneumoniae, so sánh mức độ gây bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo cai sữa heo thịt” thực tháng từ ngày 15/2/2008 đến ngày 15/8/2008 Bệnh Viện Thú Y Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nơng Lâm TP HCM Nghiên cứu nhằm góp phần xây dựng phương pháp chẩn đốn Mycoplasma hyopneumoniae (MH) hữu hiệu phòng thí nghiệm đồng thời có nhận định khái quát mức độ gây bệnh MH heo cai sữa heo thịt để từ ứng dụng vào việc chẩn đốn, điều trị phòng bệnh MH đạt hiệu cao Mẫu phổi heo cai sữa heo thịt có bệnh tích nghi ngờ MH thu thập để đánh giá bệnh tích đại thể theo cơng thức Christensen (1999) Rice (2000), dùng môi trường Friis để phân lập xác định MH kỹ thuật PCR  Đánh giá bệnh tích mức độ hư hại 63 phổi heo cai sữa 146 phổi heo thịt cho kết sau: - Trên heo cai sữa: tỷ lệ phổi có bệnh tích 92,06% (58/63) - Trên heo thịt: tỷ lệ phổi có bệnh tích 91,78% (134/146)  Đánh giá tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng nghi ngờ MH cho kết sau: - Trên heo cai sữa: tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng nghi ngờ MH 79% (46/58) Bệnh tích tập trung chủ yếu điểm tức khoảng 25-50% bề mặt phổi - Trên heo thịt: tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng nghi ngờ MH 85,82% (115/134) Bệnh tích tập trung chủ yếu điểm (khoảng 25-50% bề mặt phổi)  Tỷ lệ phân lập MH môi trường thạch Friis từ mẫu phổi heo thịt cho kết dương tính 68,75% (11/16)  Kỹ thuật PCR để xác định MH phổi có bệnh tích nghi ngờ MH cho kết sau: - Trên heo cai sữa: tỷ lệ dương tính 44,44% (4/9) - Trên heo thịt: tỷ lệ dương tính 47,06% (8/17) Qua kết nhận thấy tỷ lệ bệnh đường hô hấp heo cai sữa heo thịt cao bệnh nghi ngờ MH chiếm tỷ lệ lớn Đồng thời kết cho thấy mức độ gây bệnh MH phổi heo cai sữa heo thịt tương đương iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm tạ ii Tóm tắt khóa luận iii Mục lục iv Danh sách từ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Danh sách sơ đồ biểu đồ .x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương CƠ SỞ LÝ LUẬN .3 2.1 Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm 2.1.1 Lịch sử phân bố địa lý .3 2.1.2 Căn bệnh học 2.1.2.1 Phân loại 2.1.2.2 Đặc điểm M hyopneumoniae .5 2.1.3 Truyền nhiễm học 2.1.3.1 Loài vật mắc bệnh .7 2.1.3.2 Chất chứa bệnh 2.1.3.3 Đường truyền lây .8 2.1.3.4 Cách sinh bệnh 2.1.4 Triệu chứng 10 2.1.4.1 Thể cấp tính .10 2.1.4.2 Thể mãn tính 10 2.1.4.3 Thể viêm phổi phức hợp 11 2.1.5 Bệnh tích .11 iv 2.1.5.1 Bệnh tích đại thể .11 2.1.5.2 Bệnh tích vi thể 11 2.1.6 Chẩn đoán .12 2.1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 12 2.1.6.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 13 2.1.7 Điều trị 18 2.1.8 Phòng bệnh 19 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 21 3.1 Thời gian địa điểm 21 3.1.1 Thời gian .21 3.1.2 Địa điểm .21 3.2 Vật liệu dụng cụ thí nghiệm 21 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm .21 3.2.2 Dụng cụ thu thập mẫu 21 3.2.3 Dụng cụ xử lý mẫu phân lập MH phòng thí nghiệm 22 3.3 Đối tượng nghiên cứu 22 3.4 Nội dung 22 3.5 Phương pháp tiến hành 23 3.5.1 Đánh giá mức độ phân bố bệnh tích chung bệnh tích nghi ngờ MH phổi heo cai sữa heo thịt 23 3.5.2 Phân lập MH .24 3.5.2.1 Thu thập mẫu .24 3.5.2.2 Xử lý mẫu 25 3.5.2.3 Môi trường nuôi cấy 25 3.5.3 Kỹ thuật PCR để xác định MH 25 3.5.3.1 Xử lý mẫu 25 3.5.3.2 Ly trích DNA từ mẫu phổi 26 3.5.3.3 Ly trích DNA từ khuẩn lạc 26 3.5.3.4 Phản ứng PCR để phát MH .26 3.6 Tính tốn kết .27 v Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết đánh giá bệnh tích gây hư hại phổi 28 4.1.1 Đánh giá bệnh tích gây hư hại chung phổi 28 4.1.2 Đánh giá bệnh tích hư hại phổi có tính định hướng MH 29 4.1.2.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ MH 29 4.1.2.2 Đánh giá mức độ hư hại phổi có bệnh tích nghi ngờ MH 32 4.2 Kết phân lập MH 37 4.2.1 Phân lập MH môi trường thạch Friis 37 4.2.2 Kết xác định MH kỹ thuật PCR mẫu phổi 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT APP : Actinobacillus pleuropneumoniae BHI : Brain Heart Infusion broth Bp : Base pair CF : Complement fixation DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleic triphosphate ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay F : Forward FITC : Fluorescein isothicyanate IHA : Indirect hemagglutination IHC : Immunohistochemistry kb, kDa : Kilobase pairs, kilo dalton MH : Mycoplasma hyopneumoniae PRRSV : Porcine reproductive and respriratory syndrome virus PBS : Phosphate buffered saline PCR : Polymerase Chain Reaction PPLO : Pleuro-Pneumoniae-Like-Organism R : Reverse SDS : Sodium Dodecyl Sulfat SPF : Specific Pathogen Free Taq : Thermus aquaticus TBE : Tris borate EDTA TE : Tris EDTA TMRI : Tetramethylrhodamine isothiocyanate UI : Unit international UV : Utral violet µl : Microlit vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hóa để xác định MH .6 Bảng 2.2 Nhiệt độ tối ưu với chuồng heo Bảng 3.1 Bố trí trí nghiệm 22 Bảng 4.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích đánh giá 28 Bảng 4.2 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ MH heo cai sữa heo thịt 29 Bảng 4.3 Các bệnh tích thường gặp phổi heo đánh giá 31 Bảng 4.4 Tỷ lệ hư hại phổi có bệnh tích nghi nhiễm MH 32 Bảng 4.5 Tỷ lệ hư hại phổi nghi nhiễm M hyopneumoniae mức độ 34 Bảng 4.6 Điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ M hyopneumoniae phổi 35 Bảng 4.7 Kết xác định MH từ khuẩn lạc nghi ngờ kỹ thuật PCR 38 Bảng 4.8 Kết xác định MH mẫu phổi kỹ thuật PCR 39 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Phổi heo thịt có bệnh tích nhục hóa thùy đỉnh, thùy thùy hồnh cách mơ .36 Hình 4.2 Phổi heo cai sữa có bệnh tích nhục hóa thùy đỉnh thùy 37 Hình 4.3 Khuẩn lạc MH sau ngày nuôi cấy .39 Hình 4.4 Kết chạy PCR mẫu thạch phổi heo thịt .41 ix 4.1.2.2 Đánh giá mức độ hư hại phổi có bệnh tích nghi ngờ MH Tiến hành đánh giá phần trăm hư hại trên thùy phổi, phổi trái, phổi phải phổi theo công thức đề nghị Christensen (1999) Kết trình bày qua bảng 4.4 Bảng 4.4 Tỷ lệ hư hại phổi có bệnh tích nghi nhiễm MH Số mẫu phổi heo cai sữa (n=46) Tỷ lệ (%) Thùy đỉnh 53,52 Thùy 50,89 Thùy hoành cách mô 42,04 Thùy đỉnh 49,50 Phổi Thùy 52,43 phải Thùy hồnh cách mơ 40,04 Thùy phụ 45,78 Phổi trái Phổi Số mẫu phổi heo thịt (n=115) 38,08 Thùy 41,97 Thùy hồnh cách mơ 39,60 Thùy đỉnh 41,22 Phổi Thùy 45,97 phải Thùy hồnh cách mơ 42,02 Thùy phụ 47,71 trái Phổi -32- 44,52 44,32 Tỷ lệ (%) Thùy đỉnh Phổi 44,82 39,77 41,71 43,00 Tỷ lệ % 46 45 44,82 44,52 44,32 44 43 43 41,71 42 41 40 39,77 39 38 37 Phổi trái Phổi phải Heo cai sữa Cả phổi Heo thịt Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ hư hại trung bình phổi có bệnh tích nghi nhiễm MH Qua bảng 4.4 thấy: - Trên heo cai sữa: tỷ lệ hư hại trung bình phổi trái (44,82%) lớn tỷ lệ hư hại trung bình phổi phải (44,32%) phần trăm hư hại phổi 44,52% Sự khác biệt tỷ lệ hư hại phổi trái phổi phải khơng có ý nghĩa mặt thống kê với P>0,05 Kết cho thấy mức độ hư hại trung bình phổi heo cai sữa nghi ngờ nhiễm MH mức trung bình - Trên heo thịt: tỷ lệ hư hại trung bình phổi trái (39,77%) thấp tỷ lệ hư hại trung bình phổi phải (43%) phần trăm hư hại phổi 41,71% Sự khác biệt tỷ lệ hư hại phổi trái phổi phải khơng có ý nghĩa mặt thống kê với P>0,05 Kết cho thấy mức độ hư hại phổi heo thịt nghi ngờ nhiễm MH mức trung bình - Tỷ lệ hư hại trung bình phổi heo cai sữa (44,52%) cao tỷ lệ hư hại trung bình phổi heo thịt (41,71%) Tuy nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê với P>0,05 Kết cho thấy mức độ gây hư hại MH phổi heo cai sữa heo thịt tương đương Mức độ hư hại phổi lứa heo mức trung bình bệnh tích đại thể bị ảnh hưởng kháng sinh trình điều trị việc tiêm phòng vaccin chống MH làm giảm mức độ biểu bệnh tích phổi -33- Nếu chia theo mức độ hư hại (%) tần số xuất phổi tính điểm theo Rice (2000) biểu qua bảng 4.5 Bảng 4.5 Tỷ lệ hư hại phổi nghi nhiễm M hyopneumoniae mức độ Mức độ hư hại Điểm (%) Heo cai sữa Heo thịt Số lượng mẫu Tỷ lệ Số lượng mẫu Tỷ lệ hư hại (n=46) (%) hư hại (n=115) (%) P 0,05 25-50% 18 39,13 41 36,65 P>0,05 50-75% 19,57 23 20,00 P>0,05 >75% 19,57 18 15,65 P>0,05 P P>0,05 P0.05 - Trên heo thịt: mức độ hư hại phổi có bệnh tích nghi ngờ MH tập trung chủ yếu điểm chiếm tỷ lệ 36,65% thấp điểm có tỷ lệ 15,65% Sự khác biệt tỷ lệ hư hại phổi khảo sát mức độ có ý nghĩa mặt thống kê với P0,05 Điều chứng tỏ mức độ gây hư hại phổi MH heo cai sữa heo thịt tương đương nằm khoảng từ 25-50% bề mặt phổi Bệnh tích nhục hóa Hình 4.1 Phổi heo thịt có bệnh tích nhục hóa (mũi tên đen) thùy đỉnh, thùy thùy hồnh cách mơ định hướng MH -36- Bệnh tích nhục hóa Hình 4.2 Phổi heo cai sữa có bệnh tích nhục hóa (mũi tên đen) thùy đỉnh thùy định hướng MH 4.2 Kết phân lập MH 4.2.1 Phân lập MH môi trường thạch Friis Trên mẫu phổi heo thịt có bệnh tích đặc trưng MH gây ra, chúng tơi tiến hành phân lập 16 mẫu phổi có bệnh tích tập trung chủ yếu điểm có mức độ hư hại khoảng 25-50% Theo Quinn (1994), mẫu phổi phân lập nên thu thập từ đàn heo giai đoạn sớm trình hình thành bệnh lúc kháng thể chưa hình thành có với hàm lượng khơng cao Qua q trình phân lập mơi trường thạch, khuẩn lạc nghi ngờ MH có dạng tròn lồi sau 3-14 ngày ni cấy, đường kính khuẩn lạc khoảng 200-400m sau 5-10 ngày sau 10-14 ngày ni cấy kích thước khuẩn lạc khoảng 250-650m, khơng có dạng hình trứng chiên (hình 4.3) Từ 16 mẫu phổi heo thịt phân lập môi trường thạch Friis, sau dùng kỹ thuật PCR để xác định diện MH, kết trình bày qua bảng 4.7 -37- Bảng 4.7 Kết phân lập MH môi trường thạch Friis Kết phân lập M hyopneumoniae (n=16) Số mẫu Tỷ lệ (%) 11 68,75 Số mẫu Tỷ lệ (%) 31,25 Dương tính Âm tính Tỷ lệ % 80 70 68,75 60 50 40 31,25 30 20 10 Dương tính Âm tính Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ nuôi cấy MH môi trường thạch Friis Qua bảng 4.7 cho thấy tỷ lệ phân lập dương tính với MH cao (68,75%), kết phân lập nghiên cứu cao kết nghiên cứu khác Võ Thị Hoàng Sang (2006) 25%, Nguyễn Thị Khánh Minh (2007) 18,18% thấp kết Nguyễn Thị Thanh Trúc (2006) 76,09%, Hoàng Văn Đức (2008) 100% -38- Tỷ lệ âm tính 31,25% thu thập mẫu từ heo có tiêm phòng vaccin điều trị kháng sinh gây ức chế tăng trưởng MH trình phân lập Hình 4.3 Khuẩn lạc MH sau ngày nuôi cấy 4.2.2 Kết xác định MH kỹ thuật PCR mẫu phổi Từ 17 mẫu phổi heo thịt mẫu phổi heo cai sữa thu thập có bệnh tích đặc trưng MH gây nên, chúng tơi dùng kỹ thuật PCR để xác định diện MH Kết trình bày qua bảng 4.8 Bảng 4.8 Kết xác định MH mẫu phổi kỹ thuật PCR Heo cai sữa (n=9) Heo thịt (n=17) Kết P Số mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ (%) Dương tính 44,44 47,06 Âm tính 55,56 52,94 -39- P>0,05 Tỷ lệ % 60 50 55,56 44,44 47,06 52,94 40 30 20 10 Dương tính Âm tính Heo cai sữa Heo thịt Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ phổi dương tính với MH qua kiểm tra kỹ thuật PCR Qua bảng 4.8 cho thấy tỷ lệ dương tính với MH qua chẩn đoán kỹ thuật PCR mẫu phổi heo thịt (47,06%) thấp phân lập MH thạch Friis (68,75%), nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê với P>0,05 Kết PCR phổi heo thịt thấp thạch q trình nghiên cứu hóa chất dùng ly trích bảo quản thời gian dài nên bị giảm chất lượng, đồng thời kỹ thuật viên chưa có đủ kinh nghiệm nên làm giảm hiệu ly trích Các phân tử nucleotide acid tách chiết khơng trạng thái ngun vẹn tối đa mà bị gãy nghiền lắc mạnh hay bị thủy giải enzyme nội bào giải phóng mơi trường tế bào bị phá vỡ từ làm kết chẩn đốn MH thấp Qua bảng 4.8 cho thấy tỷ lệ dương tính với MH qua chẩn đoán kỹ thuật PCR mẫu phổi heo cai sữa (44,44%) thấp heo thịt (47,06%), nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê với P>0,05 Kết chẩn đoán MH mẫu phổi heo thịt kỹ thuật PCR thấp kết Võ Thị Hoàng Sang (2006) 50%, Nguyễn Thị Thanh Trúc (2006) 88,89% cao kết ghi nhận Nguyễn Thị Khánh Minh (2007) 13,64%, Hoàng Văn Đức (2008) 33,33% -40- Hình 4.4 Kết chạy PCR mẫu thạch phổi heo thịt Ghi chú: DC: đối chứng; P: phổi; T: thạch Mẫu P133, P134, P144, P136, P135: dương tính Mẫu T133, T119, T117: dương tính -41- Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian tiến hành đề tài « Phân lập ứng dụng kỹ thuật PCR để phát Mycoplasma hyopneumoniae So sánh mức độ gây bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo cai sữa heo thịt » rút kết luận sau: - Tỷ lệ phổi có bệnh tích chung heo cai sữa 92,06% cao heo thịt có tỷ lệ phổi có bệnh tích chung 91,78% - Tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng MH heo cai sữa 79% thấp heo thịt có tỷ lệ bệnh tích đặc trưng MH 85,82% - Trên lứa heo bệnh tích tập trung chủ yếu điểm vào khoảng 25-50% bề mặt phổi - Tỷ lệ phân lập MH môi trường thạch Friis từ mẫu phổi heo thịt cho kết dương tính 68,75% - Kỹ thuật PCR để xác định MH mẫu phổi heo cai sữa cho kết dương tính 44,44% heo thịt có kết dương tính 47,06% Trên hạng heo có tỷ lệ bệnh đường hơ hấp cao bệnh nghi ngờ MH chiếm tỷ lệ lớn Tỷ lệ bệnh nghi ngờ MH heo cai sữa thấp heo thịt mức độ hư hại phổi heo cai sữa nghi ngờ MH cao heo thịt, nhiên khác biệt không đáng kể Do chúng tơi nhận thấy mức độ gây bệnh MH heo cai sữa heo thịt tương đương 5.2 Đề nghị - Nên tiếp tục điều tra tình hình nhiễm bệnh chung bệnh MH đường hô hấp lứa heo khác heo nái, heo nọc, heo theo mẹ…để từ có nhận định khái quát mức độ bệnh lứa heo - Thực nuôi cấy MH môi trường canh Friis - Thử nghiệm số đặc tính sinh hóa, kháng sinh đồ, tiêm thú thí nghiệm để xác định đặc tính sinh học mầm bệnh có hướng điều trị hiệu - Nên sử dụng phương pháp chẩn đoán MH kỹ thuật PCR kết hợp với phương pháp chẩn đốn khác kết nhanh, xác tin cậy -42- TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN TIẾNG VIỆT Quách Tuyết Anh, 2003 Một số kinh nghiệm ứng dụng kỹ thuật PCR để phát Mycoplasma hyopneumoniae mẫu bệnh tích phổi heo nhục hóa LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 2004 Di truyền phân tử Nhà xuất Nông Nghiệp Trang 331-348 Tô Minh Châu, 2001 Bài giảng môn vi sinh đại cương Tủ sách Đại Học Nông Lâm TP HCM Trang 25-26 trang 133 Tô Minh Châu Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Tủ sách Đại Học Nông Lâm TP HCM Trang 94-97 Trần Thị Kim Chi, 1999 Khảo sát bệnh đường hô hấp heo kết sử dụng vaccin phòng chống bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo sơ sinh đến tháng tuổi LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Trần Thị Dân, 2004 Phát Mycoplasma hyopneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae heo kỹ thuật PCR Đề tài cấp bộ, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Đỗ Tiến Duy, 2004 Chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể, vi thể kỹ thuật ELISA heo thịt giết mổ xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Hoàng Văn Đức, 2008 Phân lập ứng dụng kỹ thuật PCR để phát Mycoplasma hyopneumoniae phổi heo thịt trại chăn nuôi công nghiệp tỉnh Đồng Nai LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Nguyễn Thị Ngọc Hạnh, 2002 Điều tra tỷ lệ nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae heo kỹ thuật ELISA hai xí nghiệp chăn ni heo công nghiệp TP HCM LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nơng Lâm TP HCM 10 Lâm Chí Hiếu, 2004 Chẩn đốn Mycoplasma hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể, vi thể kỹ thuật ELISA heo thịt giết mổ sở chế biến thực phẩm Nam Phong TP HCM LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 11 Lê Văn Hùng, 2002 Giáo trình miễn dịch học thú y Nhà xuất Nơng Nghiệp -43- 12 Nguyễn Văn Khanh, 2004 Thú y bệnh học đại cương Nhà xuất Nông Nghiệp 13 Nguyễn Văn Khanh, 2005 Thú y giải phẫu bệnh chuyên khoa Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 14 Nguyễn Thanh Liêm, 2004 Khảo sát tình hình nhiễm bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo nuôi thịt LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 15 Nguyễn Thị Khánh Minh, 2007 Chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae mẫu phổi heo giết mổ xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 16 Lê Văn Minh, 2002 Đánh giá hiệu sử dụng vaccine Respisure – One việc phòng bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo thịt xí nghiệp chăn nuôi heo Đồng Hiệp TP HCM LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 17 Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006 Bệnh truyền nhiễm gia cầm, bệnh truyền nhiễm chung Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Trang 21-27 18 Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006 Các phương pháp chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae (MH) phòng thí nghiệm Chun đề tiến sĩ, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 19 Nguyễn Như Pho, 2003 Bệnh viêm phổi Mycoplasma heo Nhà xuất Nông Nghiệp TP HCM 20 Nguyễn Như Pho, 2007 Bài giảng bệnh nội khoa gia súc Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 21 Trần Thanh Phong, 1996 Bệnh truyền nhiễm vi trùng heo Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 22 Nguyễn Vĩnh Phước, 1978 Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc Nhà xuất Nông Nghiệp Trang 320-322 23 Lê Đức Trình, 2001 Sinh học phân tử tế bào Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Trang 233-235 24 Vân Minh Tâm, 2005 Chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae heo thịt thu thập xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM -44- 25 Nguyễn Thoại Thức, 2005 Chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae heo thịt giết mổ xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong TP HCM LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 26 Huỳnh Thị Thanh Thủy, 2006 Môi trường sức khỏe vật nuôi Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Trang 3, 6, 9, 15, 17 27 Dương Thị Thu Thủy, 2004 Khảo sát kháng thể mẹ truyền bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 28 Vân Minh Tiên, 2002 Đánh giá hiệu sử dụng vaccine respisure việc phòng bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 29 Nguyễn Thị Thanh Trúc, 2006 Chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae heo thịt thu thập xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong TP HCM LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 30 Võ Thị Hoàng Sang, 2006 Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae phổi heo thu thập xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong LVTN, Khoa CNTY, trường Đại Học Nông Lâm TP HCM TIẾNG NƯỚC NGOÀI 31 Barbara E Straw, Sylvie D’Allaire, William L Mengelling and David J Talor, 1999 Disease of swine Iowa State Uni.Press/Ames, Iowa, USA 32 Baseman J B, and Tully J G, 1997 Mycoplasma: sophisticated, reemerging, and burdened by their notoriety Emerg Infect Dis 33 Calsamiglia M., Collins J.E., 2000 Correlation between the presence of enzootic pneumonia lesion and detection of M hyopneumoniae in bronchial swabs by PCR Journal of Veterinary Microbiology 34 Christensen G , 1990 Disease of respiratory system In disease of swine Iowa state university press Ames, Iowa, USA 35 Carlton L Gyles and Charles O Thoen, 1993 Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals 36 G R Carter and John R Cole, Jr 1990 Classification, normal flora, and laboratory safety Academic Press, Inc -45- 37 Toan Nguyen Tat, 2004 Comparative evaluation of isolation, PCR detection and clinico – pathological diagnostic approstic approaches in field cases of Mycoplasma hyopneumoniae infection in selection farms of Luzon, Philippines Master of science (Veterinary Medicine) University of the Philippines Los Banos 38 Peter C T Hannan, 1999 Guidelines and recommendations for antimicrobial minimum inhibitory concentration (MIC) testing against veterinary Mycoplasma species Mycoplasma Experience Ltd, Norbury Road, Reigate, Surrey, RH29BY, UK P 380 39 P J Quinn, M E Carter, B K Markey, 1994 Clinical veterinary microbiology Mosby International, England 40 R F Rose, P Whitlestone, 1983 Recovery, indentification of and serological response Mycoplasma Methods in Mycoplasmology (II) Academic press, Inc, 1983 P 115-127 -46- ...PHÂN LẬP VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE, SO SÁNH MỨC ĐỘ GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEO CAI SỮA VÀ HEO THỊT Tác giả HUỲNH LÊ... tài Phân lập ứng dụng kỹ thuật PCR để phát Mycoplasma hyopneumoniae, so sánh mức độ gây bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo cai sữa heo thịt thực tháng từ ngày 15/2/2008 đến ngày 15/8/2008 Bệnh. .. tài Phân lập ứng dụng kỹ thuật PCR để phát Mycoplasma hyopneumoniae, so sánh mức độ gây bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo cai sữa heo thịt 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xác định Mycoplasma