Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex) trong phân loại Escherichia Coli gây tiêu chảy doc

TCNCYH 22 (2) - 2003 Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex) trong phân loại Escherichia coli gây tiêu chảy Trần Trí Tuệ 1 , Lê Văn Phủng 2 1 Trung tâm Y tế dự phòng Lào cai 2 Đại học Y Hà Nội Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi trong xác định các chủng E. coli gây tiêu chảy đã đợc nghiên cứu chi tiết. Sự phân bố của 300 chủng E. coli phân lập từ các bệnh phẩm: phân (150), nớc tiểu (40), máu (30), dịch mật (40), mủ (40) cũng đã đợc xác đinh bằng PCR đa mồi dùng trong tiêu chảy. ADN đợc tách chiết từ các chủng E. coli và các chủng chuẩn khác thuộc Enterobacteriaceae, sau đó tiến hành phản ứng PCR với 8 cặp mồi. Kết quả nh sau: 1. Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi (8 cặp) so với chủng chuẩn là 100%. 2. Độ đặc hiệu của phản ứng PCR với 8 cặp mồi đã chọn từ các vi khuẩn: Citrobacter freundii, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Edwasdsiella tarda, Escherichia coli ATCC 25922 là 100%. 3. Không phân biệt đợc EIEC với Shigella bằng phản ứng PCR với bộ mồi đã thiết kế cho EIEC Jal. 4. Các chủng E. coli gây tiêu chảy đợc phân lập từ trẻ em khoẻ mạnh là 10% (EAEC 6,7%; EHEC 0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC 1,33%). 5. Các chủng E. coli gây tiêu chảy đợc phân lập từ mủ, dịch mật, máu, nớc tiểu là 1,33% và có sự phân bố không đồng đều theo vị trí gây bệnh. I. Đặt vấn đề Tiêu chảy là một bệnh khá phổ biến ở các nớc trên thế giới, đặc biệt tại các nớc đang phát triển. Tỷ lệ mắc và tử vong do tiêu chảy rất cao ở trẻ em. Theo ớc tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm có trên 1 tỷ lợt trẻ em dới 5 tuổi bị tiêu chảy với gần 5 triệu trẻ tử vong [5]. ở nớc ta, tiêu chảy là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dỡng, là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 2 ở trẻ em (chỉ xếp sau nhiễm khuẩn đờng hô hấp). Nhiều tác nhân vi sinh vật khác nhau có thể gây ra tiêu chảy, trong đó Escherichia coli thờng chiếm tỷ lệ cao. Theo nghiên cứu của các tác giả trên thế giới tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em từ 21-60%, còn ở Việt Nam tỷ lệ này là 23,4 - 44,8% [1, 2, 3, 7, 9, 10]. Nhiều phơng pháp chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy đã đợc áp dụng. Ngay từ những năm 40, ngời ta đã sử dụng phơng pháp định type huyết thanh. Sau này các phơng pháp chẩn đoán khác nh ELISA, thử độc tính trên nuôi cấy tế bào, các tính chất sinh hoá, sự ly giải bởi phage đã đợc áp dụng. Song, chúng cũng đều là các phơng pháp gián tiếp và đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp, nên ít đợc ứng dụng trong phân loại các E. coli gây tiêu chảy. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, nhiều phơng pháp chẩn đoán mới đã ra đời cho phép phát hiện đợc các gien đặc hiệu, quyết định khả năng gây bệnh của E. coli, trong đó 2 phơng pháp, PCR và lai ADN, đợc áp dụng phổ biến nhất. 5 TCNCYH 22 (2) - 2003 ở Việt Nam, việc chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy, chỉ sử dụng phơng pháp quai ruột và định type huyết thanh và cũng chỉ dừng lại ở ETEC (Enterotoxingenic E. coli) và EPEC (Enteropathogenic E. coli), EIEC (Enteroinvasive E. coli), EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli). PCR chẩn đoán E. coli trên thế giới đã đợc dùng phổ biến nhng các tác giả đều chỉ dùng đơn thuần một cặp mồi cho một phản ứng, do vậy tốn kém vật liệu và thời gian. Bởi vậy, việc nghiên cứu áp dụng một kỹ thuật phù hợp với nhiều cặp mồi, nhằm phát hiện nhiều loại E. coli gây tiêu chảy trong một phản ứng là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thiết thực. Trớc tình hình đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu: 1. Tìm hiểu độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi trong xác định E. coli gây tiêu chảy. 2. Tình hình phân bố các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ phân, máu, nớc tiểu, mủ và mật. II. Đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng - Chủng E. coli mẫu gồm: ETEC ATCC 35401, EHEC ATCC 43890, EHEC ATCC 43889, EPEC ATCC 43887, EIEC ATCC 43893, EAEC ATCC 130C2 do Viện Karolinska Thụy Điển cung cấp. - Chủng chuẩn của họ vi khuẩn đờng ruột: - Chủng Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Citrobacter freundii, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda, Escherichia coli ATCC 25922 do Trung tâm lu trữ nguồn gene vi sinh vật gây bệnh, bộ môn Vi sinh vật trờng Đại học Y Hà Nội cung cấp. - Chủng E. coli từ bệnh phẩm: phân (150), nớc tiểu (40), máu (30), mật (40), mủ (40) đã đợc xác định bằng các phơng pháp thông thờng. 2. Vật liệu - Môi trờng nuôi cấy vi khuẩn: Sorbitol Mac Conkey, DCA. - Môi trờng dùng trong chẩn đoán gồm: KIA, ure-indol, mannitol - di động, Citrat Simmons. - Môi trờng cấy vi khuẩn chuẩn bị cho tách chiết ADN: thạch thờng đĩa. - Sinh phẩm, máy móc dùng trong PCR: + 8 cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 5 loại E.coli gây tiêu chảy: LT l-LT r, STI2 l-STI2 r, VT1 l-VT1 r, VT2 l-VT2 r, eae u-eae l, SHIG 1-SHIG 2, bfp2 u-bfP2 l, EA L-EA U. + Máy ly tâm lạnh (Beckman Avanti TM 30), máy điều nhiệt tự động Thermal Cycler (Eppendorf Đức), bộ điện di ngang (Advance Co.LTD, Nhật Bản), máy chụp ảnh gel và phim ảnh Kodak cỡ 667. 3. Phơng pháp - Từ các chủng E.coli mẫu, các chủng thuộc họ vi khuẩn đờng ruột đã kể ở trên và các chủng vi khuẩn, bệnh phẩm đợc tách chiết ADN bằng nhiệt theo quy trình của Viện Krolinska Thụy Điển. - Sau đó tiến hành chạy phản ứng PCR đa mồi (8 cặp mồi) với chu kỳ nh sau: 1 chu kỳ 96 o C/4"; 30 chu kỳ: 94 o C/20", 50 o C/20", 72 o C/10"; 1 chu kỳ: 72 o C/7" giữ ở 4 o C. - Sản phẩm của phản ứng PCR đa mồi đợc tiến hành điện di trên thạch agarose 1,5%. Từ các chủng E.coli mẫu để xác định độ nhạy, các chủng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đờng ruột để xác định độ đặc hiệu còn các chủng từ bệnh phẩm để xác định tình hình phân bố các chủng E. coli gây tiêu chảy. 6 TCNCYH 22 (2) - 2003 III. Kết quả 1. Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ 5 chủng E.coli mẫu 1. Chứng âm 2. EIEC (320 bp) 3. EHEC (130, 298, 376 bp) 4. ETEC (147, 322 bp) 5. EAEC (630 bp) 6. EPEC (367, 376 bp) 7. Thang ADN chuẩn 2. Độ đặc hiệu của PCR đa mồi Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi với các vi khuẩn có quan hệ di truyền gần gũi với E. coli 1. Chứng âm 2. Edwardsiella tarda 3. K. pneumoniae 4. P. vulgaris 8 2030 (bp) 1636 1018 506,517 396 344 298 220 201 154 134 9 10 1 2 3 4 5 6 7 2036 (bp) 1636 1018 506, 517 396 344 298 220 201 154 7 TCNCYH 22 (2) - 2003 5. C. Freundii 6. S. typhi 7. E. coli ATCC 25922 8. Chứng dơng ETEC (147, 322 bp) 9. . Chứng dơng EAEC (630 bp) 10. Thang ADN chuẩn 3. E. coli gây bệnh ở đờng tiêu hoá Bảng 1: Kết quả phát hiện các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ phân trẻ em < 5 tuổi (n = 150) Tên chủng PCR (+) % EAEC 10 6,7 EHEC 1 0,66 EIEC 2 1,33 EPEC 0 0 ETEC 2 1,33 Tổng cộng 15 10 4. E. coli có khả năng gây tiêu chảy có mặt ở ngoài đờng tiêu hoá Bảng 2: Kết quả phân loại các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ các bệnh phẩm ngoài đờng tiêu hoá (n = 150) Tên chủng PCR (+) % EAEC 2 1,3 EHEC 0 0 EIEC 0 0 EPEC 0 0 ETEC 0 0 Tổng cộng 2 1,3 IV. Bàn luận Về độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi: kết quả độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi của các chủng E. coli mẫu là 100%. Mặc dù sử dụng nhiều cặp mồi hơn song chúng tôi thấy rằng không có hiện tợng ức chế lẫn nhau giữa các cặp mồi trên. Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả trớc nh Katsuaki Hoshino Or Jan Olsvik, Akioabe, Sandrinsa Tacyphipps mặc dù chúng tôi sử dụng nhiều cặp mồi hơn. Chúng tôi cũng tiến hành thử nghiệm độ lặp lại (100 lần) với các chủng E. coli mẫu. Kết quả độ lặp lại của PCR trong các chủng E. coli mẫu là 100% (trừ EIEC). Nh vậy độ tin cậy của kết quả này rất cao. PCR đa mồi cũng đợc dùng để xác định các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy từ các bệnh phẩm lâm sàng. Các chủng này đã đợc xác định bằng phơng pháp PCR đơn mồi là chắc chắn có gien gây bệnh, chúng đợc coi nh những chủng chuẩn. Kết quả của chúng tôi cho thấy bằng phơng pháp PCR đa mồi có khả năng phát hiện tất cả các chủng này. Với kết quả này, chúng ta có thể áp dụng kỹ thuật trên để chẩn đoán nhanh, chính xác các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy. Về độ đặc hiệu của PCR đa mồi: PCR đa mồi cũng đợc dùng để tiến hành thử nghiệm độ đặc hiệu với 7 chủng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đờng ruột, chúng có mối quan hệ chặt chẽ với E. coli có khả năng gây tiêu chảy về nhiều mặt. Xét về mặt di truyền học, chất liệu di truyền của chúng tơng đối giống với E. coli gây tiêu chảy. Thậm chí chủng thử nghiệm là E. coli ATCC 25922 giống hệt E. coli gây tiêu chảy về hình thái, tính chất sinh vật hoá học, kháng nguyên và tính chất di truyền không mấy khác biệt, vậy mà, độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi vẫn là 100%. Tiến hành thử nghiệm lặp lại, độ đặc hiệu cho kết quả 100%. Nh vậy với độ đặc hiệu cao, PCR đa mồi là phơng pháp chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy đáng tin cậy, rất hữu ích khi đa vào áp dụng thực tế chẩn đoán. Tiến hành xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR với các chủng Shigella thì thấy rằng không thể phân biệt đợc các chủng Shigella với E. coli bằng PCR với các cặp mồi đã thiết kế cho EIEC. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của các tác giả trên thế giới vì Shigella và EIEC rất giống nhau về mặt di truyền học. Để phân biệt chúng cần phải thiết kế một số cặp mồi đặc hiệu hơn. E. coli gây bệnh ở đờng tiêu hoá: Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấy rằng tỷ lệ E. coli có khả năng gây tiêu chảy ở đờng tiêu hoá là 10%. Kết quả này tơng đơng với nghiên cứu 8 TCNCYH 22 (2) - 2003 của các tác giả khác thuộc các nớc lân cận nh Lào 11%, ân Độ 9%, Tây Thái Lan 7%, nông thôn Israel 11% [4, 6, 8, 10] tuy hơi cao hơn so với kết quả nghiên cứu của một số tác giả trong nớc nghiên cứu trớc đây nh: Hoàng Tiến Mỹ 1,6%; Nguyễn Phơng Lan 3,5%; Hoàng Thu Thuỷ 5% [1, 2, 3]. Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ nhiễm EAEC là cao nhất 6,7%, đây là một tác nhân gây bệnh mới đợc quan tâm gần đây. Tuy nhiên theo kết quả nghiên cứu của các tác giả trong nớc và các nớc lân cận nh Lào, Thái Lan [8, 10] thì cha phát hiện đợc các trờng hợp nhiễm EAEC nào. Trái lại tỷ lệ này đặc biệt cao ở các nớc Châu Mỹ 15-31% [7, 9]. Chúng tôi không phát hiện đợc 1 trờng hợp nhiễm EPEC nào, điều này không có nghĩa là chủng vi khuẩn này không gây bệnh ở Việt Nam mà có thể do cỡ mẫu của chúng tôi còn nhỏ nên cha phản ánh tình hình gây bệnh của vi khuẩn này. Chúng tôi cũng phát hiện đợc tỷ lệ nhiễm EHEC là 0,66%, đây là chủng vi khuẩn ít gặp ở Châu âu, Bắc Mỹ thì ngày nay đã xuất hiện ở trẻ khoẻ mạnh ở Việt Nam. Chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy ở 3 cộng đồng dân c khác nhau nh Sa Pa (Lào Cai), Thanh Trì (Hà Nội), Cát Bà (Hải Phòng) với 50 mẫu. Kết quả cho thấy: tỷ lệ E. coli có khả năng gây tiêu chảy ở 3 cộng đồng dân c là khác nhau. Tại Sa Pa tỷ lệ E. coli có khả năng gây tiêu chảy là 20%, cao hơn hẳn Thanh Trì 6% và Cát Bà 4%. Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Tuy nhiên sự khác biệt giữa tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy ở Cát Bà và Thanh Trì không có ý nghĩa thống kê (p<0,05). E. coli có khả năng gây tiêu chảy có mặt ở ngoài đờng tiêu hoá : tỷ lệ phân lập đợc E. coli gây tiêu chảy ở ngoài đờng tiêu hóa là 1,33%, thấp hơn E. coli gây bệnh ở đờng tiêu hoá với 1 tỷ lệ có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Chúng tôi phát hiện đợc một chủng EAEC phân lập từ nớc mật và một chủng EAEC phân lập từ mủ. Điều này gợi ý cho chúng ta thấy rằng các chủng E. coli ngoài khả năng gây tiêu chảy còn có khả năng gây bệnh ở những nơi khác. Tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy gây bệnh ở ngoài đờng tiêu hóa thấp hơn E. coli gây bệnh ở đờng tiêu hóa với một tỷ lệ có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). V. Kết luận Qua nghiên cứu chúng tôi có một số kết luận sau: 1. Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi (8 cặp) với các chủng chuẩn là 100%. 2. Độ đặc hiệu của phản ứng PCR 8 cặp mồi đã chọn với các vi khuẩn Citrobacter freundii, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda, Escherichia coli ATCC 25922 là 100%. 3. Không phân biệt đợc EIEC với Shigella bằng phản ứng PCR với cặp mồi (đã thiết kế cho EIEC) ial. 4. Tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy phân lập ở trẻ khoẻ mạnh là 10% trong đó EAEC 6,7%; EHEC 0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC 1,33%. Có sự phân bố không đồng đều giữa 3 địa phơng đó là: Sa Pa 20%, Thanh Trì 6%, Cát Bà 4%. 5. Tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy phân lập từ mủ, mật, nớc tiểu và máu là 1,33% và có sự phân bố không đồng đều giữa các vị trí gây bệnh: mủ 2,5%, mật 2,5%, máu 0%, nớc tiểu 0%. Cảm ơn: Công trình này đợc thực hiện tại Labo trung tâm Y sinh học và Bộ môn Vi sinh Y học trờng Đại học Y Hà Nội. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Phơng Lan, Nguyễn Thị Kim Tiến, Lê Xuân Sơn (1998), Tác nhân vi sinh vật trong tiêu chảy kéo dài của trẻ dới 5 tuổi tại cộng đồng. Tạp chí Vệ sinh phòng dịch,2 (36): 50. 2. Hoàng Tiến Mỹ (1997), Khảo sát các vi khuẩn thờng gây tiêu chảy cấp ở mọi lứa tuổi và tính kháng thuốc. Luận án Tiến sỹ Y khoa, Trờng Đại học Y dợc TP. Hồ Chí Minh. 3. Hoàng Thu Thủy (1988), Góp phần nghiên cứu các chủng Escherichia coli gây tiêu chảy 9 TCNCYH 22 (2) - 2003 cấp ở trẻ em tại Hà Nội. Luận án Phó tiến sỹ y học, Viện Vệ sinh dịch tễ. 4. Bhan MK, Raj P, Levine MM (1989), Enteroaggregative Escherichia coli associated with persistent diarrhea in a cohort of rural children in India. J. Infect Dis, 159(6): 1061- 4. 5. Jan Holmgren and Ann- Mari Svennerholm (1992), Bacterial enteric infection and vaccine development. Gastroenterology Clinics of north America, 21(2): 283-302. 6. Lerman Y., Slepon R., Cohen D (1994), Epidemiology of acute diarrhea disease in children in a high standard of living rural settlement in Israel. J. Pediatrics infect. Dis, 13(2): 116-22. 7. Paniagua M., Espinoza ., Ringman M (1997), Analysis of incidence of infection with enterotoxigenic Escherichia coli in a prospective cohort study of infant diarrhea in Nicarago. J. Clin. Microbiol, 35 (6): 1404 - 1410. 8. Peter Echeverria, Charles W.Hoge (1994), Etiology of diarrhea in a rural community in Western Thailand: Importance of enteric vruses and enterovirulent Escherichia coli". J. infect. Dis, 169: 916-9. 9. Quiroga M, Oviedo P (2000), Asymptomatic infections by diarrheagenic Escherichia coli in children from Misiones, Argentina, During the first twenty months of their lives. Rev. Isnt. Med. Trop. Saopaulo, 42 (1): 9-15. 10. Yamashiro T, Nakasone N, Higa N (1998), Etiological study of diarrheal patients in Vientiane, Lao Peoples Democratic Republic. J. Clin. Microbiol, 36(8): 2195-9. Summary study on multiplex PCR in diagnosis of diarrhea-causing E. coli The study used 300 E. coli strains isolated from specimens: stool (150), urine (40), blood (30), billiary fluid (40), pus (40) to find sensitivity and specificity of multiplex PCR in diagnosis of E. coli strains causing diarrhea and distribution of E. coli which have ability causing diarrhea in these specimens. DNA was extracted from E. coli control strains, reference strains belong to Enterobacteiaceaer and E. coli strains from Karolinska Institute (Sweden) and then carrying out multiplex (8 primer pairs) PCR reaction. The results were showed as following: 1. Sensitivity of multiplex PCR (8 pairs) with standard strains was 100%. 2. Specificity of the PCR with the bacteria such as: Citrobacter freundii, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, Edwasdsiella tarda, Escherchia coli ATCC 25922 was 100%. 3. Unable to differentiate EIEC with Shigella by PCR reaction with the primer-pairs designed for EIEC jal. 4. Percentage of E. coli strains causing diarrhea isolated from healthy children was 10% (EAEC 6,7%; EHEC 0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC 1,33%). Having unbalance distribution among 3 studied areas: Sapa 20%, Thanh Tri 6%, Cat Ba 4%. 5. Percentage of E. coli strains causing diarrhea isolated from pus, billiary fluid, blood, urine was 1,33%. 10 . TCNCYH 22 (2) - 2003 Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex) trong phân loại Escherichia coli gây tiêu chảy Trần Trí Tuệ 1 ,. của phản ứng PCR đa mồi trong xác định E. coli gây tiêu chảy. 2. Tình hình phân bố các chủng E. coli có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ phân, máu,