Nghiên cứu xây dựng panel hồng cầu tại viện huyết học truyền máu trung ương nhằm nâng cao chất lượng an toàn truyền máu về mặt miễn dịch

Những bệnh máu liên quan đến vật chất di truyền có thể là do bẩm sinh: hệ thống gen đã bị tổn thương ngay khi cơ thể được hình thành, các tế bào của cơ thể đều mang gen bất thường.. Một

Chủ nhiệm đề tài : PGS TS Phạm Quang vinh

Cơ quan chủ trì đề tài : viện huyết học - truyền máu TW

6872

22/5/2008

hà nội - 2007

Chủ nhiệm đề tài : PGS TS Phạm Quang vinh

Cơ quan chủ trì đề tài : viện huyết học - truyền máu TW Cơ quan quản lý : Bộ Y tế

Thời gian thực hiện : Từ tháng 10 năm 2003 đến tháng 6 năm 2007

Tổng kinh phí thực hiện đề tài : 260 triệu đồng

Trong đó : Kinh phí SNKH : 260 triệu đồng

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

1 Tên đề tài: “ứng dụng kỹ thuật PCR và FISH nghiên cứu biến đổi ADN

ở một số thể bệnh Lơ xê mi và Hemophilia A”

2 Chủ nhiệm đề tài : PGS TS Phạm Quang vinh

3 Cơ quan chủ trì đề tài : viện huyết học - truyền máu TW

4 Cơ quan quản lý đề tài : Bộ Y tế

5 Thư ký đề tài : ThS Võ Thanh Bình

6 Phó chủ nhiệm đề tài

7 Những người thực hiện :

Đơn vị :

- Khoa Miễn dịch Di truyền - Viện Huyết học - Truyền máu TW

- Khoa Tế bào - Viện Huyết học - Truyền máu TW

- Khoa lâm sàng các bệnh máu viện huyết học - truyền máu TW

- Khoa điều trị hemophilia viện huyết học - truyền máu TW

- Phòng Sinh hoá, Khoa Di truyền - Sinh học phân tử

Viện Vệ sinh Dịch tễ TW

5 ThS Nguyễn Thị Mai - Viện HH-TM TW

6 ThS Võ Thanh Bình - Viện HH-TM TW

7 ThS Nguyễn Quang Tùng - Viện HH-TM TW

8 ThS Vũ Minh Phương - Viện HH-TM TW

9 CN Nguyễn Minh Phương - Viện HH-TM TW

10 BSNT Nguyễn Thiên Lữ - Viện HH-TM TW

chữ viết tắt

AML ( Acute Myeloid leukemia) : Lơ xê mi cấp dòng tuỷ

ALL ( Acute Lymphocytic leukemia) : Lơ xê mi cấp dòng lympho

APL ( Acute promyelocytic leukemia) : Lơ xê mi cấp thể tiền tuỷ bào

FISH ( Fluorescense In situ Hybridization) : Kỹ thuật lai huỳnh quang

MDS ( Myelodysplastic syndrome) : Hội chứng rối loạn sinh tuỷ

MLL ( Mixed Lineage leukemia) : Lơ xê mi cấp lai tuỷ - lympho PCR (polymerase chain reaction) : Phản ứng khuếch đại gen

RT - PCR (Reverse Trans-criptase

Polymerase chain reaction)

: Phản ứng khuếch đại gen đảo ng−ợc

RFLPs ( Restriction Fragment Length

Polymorphism)

: Kỹ thuật cắt ADN bằng enzym hạn chế

Môc lôc

Trang

1.1 BÊt th−êng vËt chÊt di truyÒn vµ bÖnh m¸u 5

1.2.4 C¸c tæn th−¬ng di truyÒn ë bÖnh nh©n Hemophilia A 101.2.5 C¸c ph−¬ng ph¸p ph¸t hiÖn ng−êi mang gen bÖnh

1.3.5 Vai trß ph¸t hiÖn bÊt th−êng di truyÒn trong nghiªn cøu

bÖnh l¬ xª mi

33

Ch−¬ng 2.§èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 36

2.3 Xác định gen hỗn hợp AML/ETO ở lơ xê mi cấp M2 và gen

3.1.1 Tỉ lệ dị hợp tử với dạng đa hình ADN có điểm cắt với

enzym BclI trên intron 18 và HindIII trên intron 19 của

gen yếu tố VIII

54

3.1.2 Xác định người phụ nữ mang gen bệnh dựa vào phân

tích kết quả PCR-RFLPs với BclI

4.1.2 áp dụng PCR-RFLPs với BclI vào chẩn đoán người

mang gen Hemophilia A

Phần A

Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài

Hoàn cảnh ra đời và mục tiêu của đề tài :

Các bất thường ADN là nguyên nhân của nhiều bệnh bẩm sinh, có tính

di truyền mà hai bệnh thường gặp trong chuyên khoa Huyết học - Truyền máu là Thalassemia và Hemophilia Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về gen bệnh gây Thalassemia Một số kết quả đã được ứng dụng trong chẩn đoán sớm và chẩn đoán trước sinh

Trong khi đó bất thường ADN trong Hemophilia rất phức tạp và đa dạng, những hậu quả của bệnh rất nặng nề Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen bệnh, về phát hiện người lành mang gen bệnh để có biện pháp đề phòng ở Việt Nam công tác quản lý, chăm sóc người bệnh Hemophilia chưa thật tốt Tính chất di truyền, đặc điểm gen di truyền chưa được nghiên cứu; chưa có biện pháp hiệu quả xác định người lành mang gen bệnh

Bên cạnh đó một số biến đổi ADN trong tế bào gốc tạo máu có thể đưa

đến hậu quả rối loạn phát triển và gây ra bệnh máu ác tính Mỗi loại bất thường gen có những bệnh cảnh khác nhau Vì vậy năm 2001 Tổ chức Y tế Thế giới đã đưa ra cách xếp loại bệnh máu và cơ quan lympho Theo cách xếp loại này với lơ xê mi cấp cần xem xét trước hết là sự có mặt hay không của các biến đổi gen đặc trưng Để xác dịnh gen này cần thực hiện kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử

Viện Huyết học - Truyền máu trong nhiều năm đã xây dựng Trung tâm Hemophilia và tổ chức các hoạt động tuyên truyền về phát hiện, chăm sóc,

điều trị bệnh Hàng năm số bệnh nhân do Viện quản lý càng tăng lên

Trong những năm qua Viện đã triển khai các kỹ thuật chẩn đoán hiện

đại như xác định CD màng tế bào, phân tích bất thường nhiễm sắc thể trong lơ xê mi Viện là cơ sở đầu ngành của chuyên khoa Huyết học - Truyền máu cần triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng trong chẩn đoán người

mang gen hemophilia, chẩn đoán trước sinh với bệnh này Đồng thời Viện phải tổ chức sớm việc ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán và phân loại mới theo quốc tế Vì vậy đơn vị nghiên cứu đã đề xuất đề tài nhằm mục đích :

1 Sử dụng kỹ thuật PCR xác định các bất thường ADN ở bệnh nhân hemophilia tiến tới tìm người lành mang gen bệnh

2 Triển khai kỹ thuật PCR và FISH trong việc phát hiện một số gen

đặc trưng ở bệnh lơ xê mi cấp, lơ xê mi hạt kinh

Kết quả nổi bật của đề tài:

1 Triển khai được kỹ thuật PCR và FISH ở Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương

- Đưa kỹ thuật hiện đại vào áp dụng và đào tạo được đội ngũ cán bộ

kỹ thuật thực hiện được qui trình kỹ thuật xét nghiệm PCR, FISH làm cơ sở cho việc ứng dụng phương pháp sinh học phân tử chẩn đoán bệnh

- ứng dụng dụng kỹ thuật PCR - RFLPs xác định ADN đa hình gen yếu tố VIII Bước đầu xác định tỷ lệ dị hợp tử của dạng đa hình ADN cắt

bằng enzym BclI là 48% ở phụ nữ bình thường Đây là tỷ lệ có ý nghĩa để

giúp phát hiện người mang gen Hemophilia A

- ứng dụng được kỹ thuật PCR và kỹ thuật FISH để xác định gen hỗn

hợp ABL/BCR ở lơ xê mi kinh dòng tủy ứng dụng kỹ thuật RT PCR phát hiện gen AML/ETO và RAR/PML ở lơ xê mi cấp dòng tủy, tiến tới góp phần phân loại lơ xê mi

2 Xây dựng được qui trình sử dụng kỹ thuật PCR xác định người lành mang gen trong gia đình bệnh nhân Hemophilia A và đã áp dụng để phát hiện được 2 người lành mang gen bệnh, xác định 7 người không mang gen bệnh

3 Đào tạo:

- Một luận văn nội trú (đã bảo vệ)

- Làm cơ sở một luận án Nghiên cứu sinh

Như vậy, dù thuộc loại bệnh nào đều có liên quan đến hoạt động của gen - protein

Các kỹ thuật sinh học đặc biệt là kỹ thuật sinh học phân tử phát triển

đã có đóng góp trong việc chẩn đoán nhiều bệnh và phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh

Những bệnh máu liên quan đến vật chất di truyền có thể là do bẩm sinh: hệ thống gen đã bị tổn thương ngay khi cơ thể được hình thành, các tế bào của cơ thể đều mang gen bất thường Thuộc nhóm này có rất nhiều bệnh nhưng 2 loại bệnh hay gặp là thalassemia và hemophilia Cũng có thể bất thường vật chất di truyền xảy ra ở 1 tế bào gốc tạo máu và tạo ra các tế bào con cháu mang bất thường này Có nhiều bất thường gây rối loạn phát triển tế bào mà điển hình là bệnh ác tính cơ quan tạo máu

Trên thế giới các nghiên cứu phát hiện bất thường vật chất di truyền (ADN) trong các bệnh thalassemia, hemophilia và bệnh ác tính hệ tạo máu đã

được thực hiện ở các trung tâm và các nước phát triển, đang phát triển Kết quả nghiên cứu được ứng dụng trong chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Hemophilia, Thalassemia Riêng đối với bệnh máu, Tổ chức Y tế Thế giới đã

đề nghị xếp loại trước hết căn cứ vào bất thường di truyền [21]

ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu vật chất di truyền trong bệnh Thalassemia Tuy nhiên chưa có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân

tử trong việc xác định đột biến (bất thường ADN) ở bệnh nhân Hemophilia

Chương 1

Tổng quan tài liệu

1.1 Bất thường vật chất di truyền và bệnh máu

Bệnh máu có thể là bệnh của tế bào máu, cơ quan tạo máu hay bệnh liên quan đến hệ thống cầm và đông máu

Tế bào máu được sinh ra ở tủy sinh máu Quá trình sinh máu ở cơ qnan tạo máu là quá trình sinh sản tế bào kèm hiện tượng biệt hoá và trưởng thành Qua quá trình này thì từ một tế bào gốc ban đầu có thể hình thành nhiều loại

tế bào có hoạt động chức năng khác nhau Tế bào sinh sản, biệt hoá, trưởng thành bình thường là nhờ hệ thống gen hoạt động bình thường Gen bị bất thường có thể dẫn đến rối loạn và sinh ra bệnh

Quá trình đông - cầm máu là quá trình chuyển máu từ trạng thái lỏng thành trạng thái rắn để không chảy ra ngoài thành mạch mỗi khi thành mạch

bị tổn thương Để thực hiện quá trình này cần sự nguyên vẹn của tiểu cầu và

có mặt đầy đủ các yếu tố đông máu Các yếu tố đông máu là các protein - đó

là sản phẩm của các gen và hoạt động sinh protein Gen bất thường dẫn đến các yếu tố bất thường đó là bệnh lý, các bất thường di truyền có thể là bất thường bẩm sinh hay mắc phải

1.1.1 Bất thường di truyền bẩm sinh

Cơ sở vật chất di truyền được hình thành khi hình thành hợp tử Hợp tử

là tế bào đầu tiên của cơ thể Các bất thường bẩm sinh thường do bố mẹ truyền cho hay do tổn thương ADN trong quá trình hình thành giao tử Như vậy, nếu hợp tử đã mang bất thường nào thì mọi tế bào đều mang bất thường

đó Tuy nhiên một loại bất thường chỉ thể hiện ở một loại hoạt động

Điển hình trong bất thường này là các bệnh thalassemia, hemophilia, rối loạn chức năng tiểu cầu, hồng cầu và những bệnh liên quan đến sinh tế bào máu như hội chứng Fanconi [1]

1.1.2 Bất thường di truyền mắc phải

Bên cạnh các bất thường vật chất di truyền bẩm sinh có mặt trong tất cả các tế bào thân của cơ thể thì có những bất thường di truyền mắc phải

Mỗi một cơ quan của cơ thể có các tế bào hoạt động chức năng Đó là các tế bào đã được biệt hoá cao độ Quá trình hình thành các tế bào này là quá trình sinh sản tế bào thông qua gián phân từ tế bào gốc của cơ quan, kèm theo tổng hợp nhiều protein đặc trưng Bất thường di truyền có thể hình thành trong các tế bào gốc đầu dòng Những bất thường này có thể là nguyên nhân của một bệnh trong cả quần thể tế bào con cháu Tế bào máu cũng không ngoài qui luật trên Các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu được sinh ra từ tế bào gốc tạo máu Tế bào đầu tiên sinh ra tất cả các dòng gọi là tế bào gốc vạn năng Từ tế bào gốc vạn năng này thông qua sinh sản và biệt hoá tạo nên tế bào gốc định hướng cho các dòng, rồi trưởng thành tạo nên tế bào hoạt động chức năng

Bất thường di truyền xảy ra ở tế bào gốc tạo máu có thể gây ra bệnh máu Bất thường di truyền phát sinh ở tế bào gốc định hướng hồng cầu có thể tạo ra những hồng cầu có màng kém bền vững trong một số điều kiện như bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm Có những bất thường liên quan tới các protein tham gia vào điều hoà sinh sản tế bào gây ra giảm sinh hay tăng sinh ác tính các tế bào máu Hậu quả là các bệnh ác tính của tế bào máu và cơ quan tạo máu

Ngày nay ứng dụng những hiểu biết này, Tổ chức Y tế Thế giới đã thống nhất phân loại bệnh ác tính hệ tạo máu dựa trên các bất thường vật chất

di truyền [21]

1.2 Bất thường di truyền và hemophilia

1.2.1 Giới thiệu bệnh Hemophilia

Hemophilia là một rối loạn chảy máu di truyền hay gặp nhất do giảm hoặc bất thường yếu tố viii (đối với Hemophilia A) hoặc yếu tố ix (đối với

Hemophilia B) Bệnh gặp ở khắp nơi trên thế giới với tỉ lệ khoảng 1: 10.000 trẻ em trai mới sinh Tỷ lệ này không khác nhau giữa các chủng tộc cũng như giữa các vùng địa lí [22] Tại Việt Nam ước tính có khoảng 5.000 người bị bệnh tuy nhiên mới chỉ có khoảng 20% được chẩn đoán và quản lí [4]

Bệnh được mô tả đầu tiên từ thế kỉ thứ 2 trước công nguyên khi các giáo sĩ Do Thái cắt bao qui đầu cho trẻ em nam và thấy ở một số trẻ có chảy máu lâu cầm sau cắt [22] Trải qua thời gian dài, bệnh dần dần được làm sáng

tỏ về biểu hiện cũng như cơ chế sinh bệnh Đặc biệt vào thế kỉ thứ 19, khi nhiều thành viên nam trong gia đình của Nữ hoàng Anh Victoria (1819 - 1901) có biểu hiện chảy máu lâu cầm và chết sớm thì việc tìm hiểu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm, cơ chế sinh bệnh cũng như điều trị trở thành một cuộc cách mạng:

- Năm 1820, schửlein đặt tên bệnh là Hemophilia, có nghĩa là bệnh ưa chảy máu

- Năm 1822, Nasse phát hiện được đặc điểm di truyền của bệnh

- năm 1840, lane ghi nhận sự truyền máu thành công ở bệnh nhân hemophilia

- Năm 1911, addis mô tả thrombin được tạo ra muộn hơn so với người bình thường và hiện tượng này có thể điều chỉnh bởi một lượng nhỏ huyết tương bình thường

- Năm 1939, brinkhous xác nhận bệnh nhân hemophilia có thành phần prothrombin bình thường và sự khiếm khuyết của hệ thống đông máu là do chậm chuyển prothrombin thành thrombin và nguyên nhân là do thiếu một yếu tố gọi là yếu tố chống hemophilia, sau này đựơc Wright đề nghị đặt tên

là yếu tố viii

- Năm 1952, aggeler mô tả bệnh nhân bị ưa chảy máu do thiếu yếu tố tạo thành thromboplastin khác với yếu tố viii và sau này được gọi là yếu tố

ix

- Đến năm 1984, người ta giải mã được trình tự gen yếu tố viii Đây là phát minh có ý nghĩa rất lớn, là nền tảng để sản xuất yếu tố viii/ix tái tổ hợp cũng như phục vụ cho việc chẩn đoán di truyền học, chẩn đoán người mang gen, chẩn đoán trước sinh [22]

1.2.2 Di truyền phân tử yếu tố VIII

Gen sản xuất yếu tố VIII có độ dài 186kb nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể X, tại vị trí Xq28 Vùng mã hóa ARN thông tin có độ dài khoảng 9 kb được chia thành 26 exon, có kích thước từ 69 đến 3106 đôi bazơ (bp) ARN thông tin mã hóa một protein gồm 2351 acid amin Yếu tố VIII

được sản xuất như một protein chuỗi đơn với cấu trúc 6 domain A3-C1-C2) và ở dạng bất hoạt Protein yếu tố VIII sẽ thay đổi khi có sự phân hủy protein Dưới tác dụng của thrombin và yếu tố Xa, yếu tố VIII bị cắt ở vị trí 372 (chỗ nối A1 - A2), 740 (chỗ nối A2-B) và 1689 (chỗ nối B-A3) Khi domain A2 tương tác với phức hợp A1/A3-C1-C2 thì protein yếu tố VIII được hoạt hoá

(a1-A2-B-Hình 1.1: Cấu trúc phân tử gen và protein yếu tố viii

(Theo Tuddenham Egd 1994)

Trên intron 22 có 2 gen khác là F8a và F8b F8a được sao chép theo hướng ngược với gen yếu tố VIII bao gồm 1 exon duy nhất Hai bản copy thêm của F8a nằm tại vị trí tương đương với gen kết thúc 400kb của gen yếu tố VIII trên nhiễm sắc thể X Gen F8b được sao chép cùng hướng với gen yếu tố viii Chức năng và sản phẩm của các gen này hiện còn chưa được biết [14], [22]

1.2.3 Di truyền bệnh Hemophilia:

Do gen sản xuất yếu tố viii nằm trên nhiễm sắc thể x, di truyền lặn vì vậy đa số người bị bệnh là nam giới, còn phụ nữ là người mang gen bệnh Người ta thống kê có khoảng 30% các trường hợp bị bệnh không có tiền sử gia đình, nghĩa là trong gia đình chỉ có một cá thể duy nhất bị hemophilia và trường hợp này được gọi là đơn phát Một trường hợp đơn phát có thể là kết quả của sự truyền gen hemophilia từ các phụ nữ không có triệu chứng qua các đời mà chưa được phát hiện; hoặc từ một đột biến mới ở người mẹ và người mẹ là người mang gen; hoặc là một đột biến mới từ chính bệnh nhân hemophilia (novo mutation) [14], [48], [63]

Nếu bố bị bệnh lấy mẹ bình thường thì tất cả con trai của họ là người bình thường, còn tất cả con gái sẽ là người mang gen bệnh

XY

Con trai bình thường

XY

Con trai bình thường

Mẹ mang gen bệnh Bố bình thường

Nếu bố bị bệnh lấy mẹ mang gen bệnh (trường hợp này rất hiếm gặp

và thường do kết hôn gần) thì 50% con trai của họ là người bị bệnh, 50% con trai bình thường, 50% con gái bị bệnh, 50% con gái là người mang gen bệnh

X h Y

Con trai

bị bệnh

- Có 50% khả năng con trai bị Hemophilia

- Có 50% khả năng con trai bình thường

- Có 50% khả năng con gái trở thành người mang gen bệnh

- Có 50% khả năng con gái trở thành người bị bệnh

1.2.4 Các tổn thương di truyền ở bệnh nhân Hemophilia A:

Gen mã hoá yếu tố viii có kích thước lớn gồm 26 exon và 25 intron Hemophilia có thể là hậu quả của các đột biến điểm, mất một phần hoặc tất cả gen, chuyển đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hoặc đột biến ở bộ ba khởi đầu hay bộ ba kết thúc Các nghiên cứu cho thấy tổn thương di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành kháng thể kháng viii cũng như mức độ nặng của bệnh những bệnh nhân bị mất đoạn lớn nhiễm sắc thể, đột biến bộ

ba khởi đầu hoặc kết thúc và tái tổ hợp giữa các nhiễm sắc thể, đảo đoạn intron 22 thường hay xuất hiện kháng viii hơn những bệnh nhân mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể và đột biến hỗn hợp [14],[22],[42],[48] Sự đảo đoạn là hậu quả của sự tái tổ hợp gen F8a ở intron 22 và 1 trong 2 bản sao của vùng tương ứng trên gen kết thúc của nhiễm sắc thể X với kích thước khoảng 500

kb được tìm thấy ở 28 – 53% bệnh nhân hemophilia thể nặng ở nhiều nước [14]…Độ lớn của gen cũng như tỉ lệ đột biến mới cao dẫn tới khó khăn trong việc xác định trực tiếp tổn thương gen yếu tố VIII [14],[42]

Ngoài các đột biến làm giảm hoặc bất thường tổng hợp yếu tố viii, gen mã hóa yếu tố VIII còn có một số biến đổi không gây bệnh gọi là đa hình (polymorphism) các đa hình có thể xảy ra ở bệnh nhân hemophilia và ở cả những người bình thường chúng có thể nằm trên vùng mã hóa (exon) hoặc không mã hóa (intron) và di truyền liên kết với gen yếu tố viii phân tích các đa hình này có thể giúp phát hiện người mang gen bệnh hemophilia các nghiên cứu cho thấy: bằng kĩ thuật sinh học phân tử, với các phương pháp pcr, rflp…người ta có thể xác định được 88% người mang gen bệnh [14], [38], [48] các dạng đa hình gen yếu tố viii thường được sử dụng trên thế giới là:

biến đổi ở intron 18 với vị trí cắt đặc hiệu của enzym Bcli, ở intron 19 với vị trí cắt đặc hiệu của enzym Hindiii, đoạn lặp 2 nucleotid (CA)n ở intron 13…

1.2.5 Các phương pháp phát hiện người mang gen bệnh Hemophilia:

Người phụ nữ mang gen tuy không biểu hiện bệnh nhưng có khả năng truyền gen bệnh cho thế hệ sau Trong điều kiện của nước ta hiện nay, việc

điều trị bệnh nhân hemophilia còn gặp nhiều khó khăn do chi phí điều trị lớn, vì vậy, đa số bệnh nhân hemophilia không được điều trị đầy đủ dẫn tới tỉ lệ tàn tật cao Chính vì vậy việc phát hiện người mang gen bệnh để tư vấn cho

họ về sinh sản, để có thể sinh ra thế hệ sau khoẻ mạnh là một nhu cầu bức bách và có ý nghĩa nhân văn cao cả

Có nhiều phương pháp phát hiện người mang gen bệnh: dựa vào phân tích phả hệ, dựa vào kiểu hình (tỉ lệ fviii:c/vwf:ag), dựa vào kiểu gen trong đó phương pháp phát hiện người mang gen bệnh dựa trên phân tích kiểu gen có ưu thế là phân tích trực tiếp tổn thương adn vì vậy có thể xác định

chính xác nhiễm sắc thể mang gen bệnh do đó cho phép khẳng định được người mang gen bệnh hay không và có thể sử dụng để chẩn đoán trước sinh cho thai nhi

1.2.5.1 Xác định người mang gen dựa vào phân tích phả hệ và dựa vào

kiểu hình (yếu tố đông máu):

Phân tích phả hệ có thể xác định được người phụ nữ chắc chắn mang gen và người phụ nữ có khả năng mang gen

Người phụ nữ chắc chắn mang gen khi:

- có ít nhất hai con trai bị bệnh

- là con của bệnh nhân hemophilia

- có 1 con trai bị bệnh và có ít nhất 1 người đàn ông trong họ mẹ bị bệnh

Người phụ nữ có khả năng mang gen khi:

và không mang gen và do đó sẽ có những trường hợp không thể kết luận khả năng mang gen được hơn nữa không có chỉ số chung giữa các labo mà tỉ lệ

này cần được xác định ở từng labo đông máu một ví dụ ngưỡng xác định người mang gen ở ấn Độ là 0.7 [14] thì ở Philippin là 0.6 [44], thái lan là 0.82 [59] Mặc dù sự kết hợp phân tích phả hệ và kết quả xét nghiệm yếu tố

đông máu là các yếu tố có ý nghĩa quan trọng, tuy nhiên chúng chỉ cung cấp

cho chúng ta biết được khả năng mà không cho phép khẳng định người phụ

nữ đó có hay không mang gen

1.2.5.2 Xác định người phụ nữ mang gen dựa vào phân tích tổn thương di truyền:

Sau khi gen yếu tố viii và yếu tố ix được nhân lên nhiều lần thì người

ta có thể xác định chính xác tình trạng mang gen cũng như chẩn đoán trước sinh thai nhi hemophilia A và B bằng cách phân tích adn việc phân tích trực tiếp đột biến như trong thalassemia hoặc bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm có thể coi là một biện pháp lí tưởng, có thể áp dụng trong đa số các trường hợp, ngay cả khi cá thể bị bệnh trong gia đình không có mặt để phân tích, hoặc trong gia đình đơn phát Một điều quan trọng cần lưu ý là: ngay cả với phương pháp này, trong trường hợp đơn phát, với một người phụ nữ nghi mang gen có thể không thể loại trừ khả năng mang gen khi không xác định

được đột biến ở người phụ nữ đó vì rất dễ có khả năng thể khảm trong tế bào phôi hoặc tế bào thân của người đó Một người phụ nữ chỉ mang đột biến trong một phần của tế bào phôi sẽ không thể được chẩn đoán bằng phân tích

tế bào máu trong trường hợp đột biến tìm thấy ở người phụ nữ này thì người

đó chính là người mang gen

phân tích gen của bệnh nhân Hemophia A cho thấy có tới hơn 900 đột biến điểm và trên 70 mất đoạn và đảo đoạn trên gen yếu tố viii đã được xác

định [9] chính vì độ lớn của gen cũng như sự đa dạng về đột biến nên trên thực tế phương pháp xác định trực tiếp đột biến rất khó áp dụng

tuy nhiên, đối với các trường hợp Hemophilia A thể nặng thì đột biến nên được sàng lọc đầu tiên là đảo đoạn intron 22 sau đó đến đảo đoạn intron 1; lí do bởi các đột biến này được tìm thấy ở 45-50% bệnh nhân Hemophilia

A thể nặng Để phát hiện các đột biến này có thể sử dụng phương pháp khuyếch đại chuỗi dài (long pcr) hoặc Southern blot các phương pháp này tương đối phức tạp và để tiến hành cho kết quả tốt thì cần có một labo và nhân lực chuyên nghiệp

bên cạnh đó, người ta có thể giải mã trực tiếp trình tự adn Đây là một phương pháp lí tưởng tuy nhiên yêu cầu thiết bị máy móc cao cấp và giá thành của phương pháp này rất đắt

Phân tích gián tiếp gen, ở đây được hiểu là đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (restriction fragment length polymorphism - rflps) có thể được dùng

để xác định nhiễm sắc thể (alen) mang gen đột biến rflps là những thay

đổi xảy ra trên trình tự nucleotid của gen mà không ảnh hưởng đến chức năng của gen đó nhưng có thể sử dụng để chẩn đoán Enzym giới hạn cắt chuỗi ADN tại một vị trí đặc hiệu cho từng enzym Nếu có các đa hình tự nhiên xảy

ra, vị trí cắt đặc hiệu sẽ thay đổi do vậy độ dài của đoạn cắt cũng sẽ thay đổi theo giữa các cá thể khác nhau cũng như giữa 2 nhiễm sắc thể x của người phụ nữ được phân tích Đây chính là căn cứ để xác định alen bị đột biến ở người phụ nữ mang gen

có 7 loại đột biến tạo 2 dạng là các đa hình trong gen (intragenic) yếu

tố viii đã được mô tả và sử dụng để xác định người mang gen cũng như chẩn

đoán trước sinh Hemophilia A: Bcli, Hindiii, Xbai, Bgli, Mspi (1), Mspi (2),

và Taqi trong đó Bcli được sử dụng nhiều nhất trên thế giới Hai đa hình

trong gen đa dạng là đoạn lặp 2 nucleotid CA ở intron 13 và 22 cũng được sử dụng có hiệu quả ở nhiều tộc người Bên cạnh đó, có 2 rflps ngoài gen nằm

trên locus hemophilia cũng được sử dụng, đó là Bg1ii/dx và Taqi/st14 tuy

nhiên, do nguy cơ tái tổ hợp trong quá trình giảm nhiễm mà người ta ít sử dụng các mồi ngoài gen sử dụng phương pháp khuyếch đại chuỗi (pcr) người ta có thể phát hiện được các rflps trong vòng 1-2 ngày thay vì 10 -

14 ngày so với kĩ thuật rflp qui ước [48]

người dị hợp tử về marker nào là người có 2 alen khác nhau về marker

đó trên 2 nhiễm sắc thể x của mình, và được gọi là có thông tin tỉ lệ dị hợp

tử của các marker đa hình rflps này rất thay đổi ở các tộc người khác nhau vì vậy để đảm bảo hiệu quả cho việc chẩn đoán, việc chọn lựa sử dụng đa hình nào cần căn cứ vào tỉ lệ dị hợp tử của quần thể người đó bên cạnh đó,

có một số rflps liên kết tương quan với nhau; nói cách khác là có 1 alen của rflps này liên kết với một alen của rflps khác vì vậy khi phối hợp 2 marker này với nhau sẽ ít làm tăng tỉ lệ có thông tin ví dụ ở quần thể người

Caucasia, nếu sử dụng cả 4 rflps Taqi, Xmni, Mspi và Mnli (là các alen

liên kết tương quan) thì chỉ có thể làm tăng tỉ lệ phụ nữ có thông tin là 55%

trong khi nếu sử dụng riêng Taqi thì tỉ lệ này là 45% Tuy nhiên nếu kết hợp

Ddei và HhaI với Taqi thì tỉ lệ có thông tin tăng lên đến 76% [48]

để phân tích rflps xác định người mang gen và chẩn đoán trước sinh cần có mẫu máu của cả người bệnh lẫn một số thành viên khác trong gia

đình, điều này đôi khi gặp khó khăn Hơn nữa, đối với các trường hợp đơn phát thì phương pháp này không thực hiện được

như vậy, để sử dụng phương pháp phân tích gián tiếp gen xác định người mang gen cần lưu ý các điểm sau:

1 người mẹ mang gen phải dị hợp tử với marker đa hình được sử dụng

2 nếu phối hợp các marker đa hình cần biết sự tương quan liên kết giữa chúng

3 khoảng cách giữa marker đa hình và gen cần được biết vì nguy cơ tái

tổ hợp liên quan trực tiếp đến khoảng cách giữa marker và đột biến

4 tỉ lệ có thông tin phụ thuộc vào tỉ lệ dị hợp tử về marker đa hình của từng quần thể và cần xác định tỉ lệ này trước khi tiến hành phân tích adn

- vì con gái nhận 1 alen từ bố và 1 alen từ mẹ vì vậy alen (+) có nguồn gốc từ bố, alen (-) có nguồn gốc từ mẹ

kết luận: con gái là người mang gen bệnh

Mẹ mang gen bệnh Bố bình thường

1.3 Bất thường di truyền và lơ xê mi

1.3.1 Cơ chế sinh lơ xê mi

Các nghiên cứu về sinh tế bào máu cho thấy quá trình tạo máu là quá trình vừa sinh sản tế bào vừa biệt hoá và trưởng thành để từ một tế bào gốc ban đầu hình thành nên các tế bào hoạt động chức năng khác nhau Quá trình này trải qua nhiều giai đoạn, đầu tiên là tế bào gốc vạn năng sinh sản và biệt hoá thành tế bào gốc định hướng tủy hay lympho, rồi từ đó tiếp tục biệt hoá thành tế bào đầu dòng Từ tế bào đầu dòng quá trình sinh sản kèm trưởng thành để tạo nên nhiều tế bào hoạt động chức năng

Quá trình sinh sản, biệt hoá và trưởng thành này thực chất là quá trình hoạt động của các gen Có một số gen chỉ đạo việc nhân lên của tế bào, có những gen khác lại là khuôn mẫu để tổng hợp nên các protein đặc trưng cho

sự biệt hoá, trưởng thành của tế bào Khi hoạt động của các gen này bị rối loạn làm tế bào không biệt hoá hay trưởng thành được nhưng hiện tượng phân bào vẫn xảy ra dẫn đến hậu quả là tích tụ nhiều tế bào non chưa trưởng thành

và thiếu các tế bào trưởng thành hoạt động chức năng đó là lơ xê mi

Nếu quá trình biệt hoá, trưởng thành bị ức chế hoàn toàn là bệnh lơ xê

mi cấp Trường hợp các tế bào tạo máu dòng bạch cầu phân chia quá mạnh vẫn biệt hoá trưởng thành được là bệnh lơ xê mi kinh

1.3.2 Hệ thống gen trong tế bào liên quan đến ung thư

Từ đầu thế kỷ XX, Boveri đã giả thiết là trong tế bào có 2 hệ thống gen hoạt động bình thường Đó là hệ thống gen kích thích phân chia tế bào và hệ thống gen kìm chế phân chia tế bào để duy trì sự sinh trưởng bình thường Khi một trong hai hệ thống này bị bất thường (hoạt hoá quá mức gen kích thích gây phân bào hoặc mất chức năng gen ức chế phân bào) đều có thể dẫn đến ung thư Sau này nhiều bằng chứng đã cho thấy giả thiết này chính xác [13],

Bên cạnh đó còn có hệ thống các gen sửa chữa ADN : Tế bào phân chia liên tục để đảm bảo và duy trì sự sống Mỗi lần phân chia tế bào có khoảng 6 tỉ cặp bazơ được tổng hợp, nên sai sót rất lớn Song cơ thể có hệ

thống sửa chữa những sai sót đó Hoạt động này giảm hoặc mất do di truyền hay mắc phải sẽ làm các sai sót không được sửa chữa trong đó có các sai sót gây hoạt hóa gen ung thư hay bất hoạt gen ức chế ung thư và kết cục là ung thư [13], [30], [45], [52]

1.3.2.1 Gen ung thư (oncogene):

Với các phương pháp nghiên cứu hiện đại, người ta thấy trong tế bào

có những gen bình thường không hoạt động hay có các chức năng nhất định, vì một lý do nào đó những gen này trở nên hoạt động hay bị thay đổi cấu trúc làm thay đổi chức năng và hậu quả là tế bào tăng sinh quá nhanh gây ra ung thư, đó là các oncogene (gen gây ung thư)

Nghiên cứu thực nghiệm virus gây bệnh ở động vật, người ta thấy bộ gen của virus không gắn một cách ngẫu nhiên vào ADN tế bào vật chủ mà gắn có chọn lựa Nghiên cứu những điểm gắn này người ta biết các gen gây ung thư trong tế bào

Các gen gây ung thư của virus gọi là oncogene virus (V-ONC), các gen

tế bào có thể gây ra quá trình tăng sinh ác tính gọi là oncogene tế bào (C-ONC)

1.3.2.2 Cơ chế sinh bệnh và phân loại oncogene :

Nhiều tác giả (Hirai, Lichtman, Hoffbrand, Naeim, Palumbo) đều cho rằng các C-ONC phân bố rộng trong bộ NST và bình thường mã hoá những protein tham gia biệt hoá, điều hoà tăng sinh, hay protein cấu tạo vị trí tiếp nhận yếu kích thích trên màng tế bào Khi những gen này hoặc là thay đổi, mã hoá các protein có hoạt tính mạnh hơn, hoặc thể hiện ở những giai đoạn không phù hợp cho sự phát triển của tế bào sẽ gây bệnh ác tính [24], [25], [35], [43], [45]

Theo Hampson, quá trình sinh máu được điều hoà bằng các chất kích thích tăng sinh, những chất này tác động lên vị trí tiếp nhận trên màng tế bào

và qua đó truyền qua màng, hoạt hóa các protein trong bào tương Một dây chuyền phản ứng xảy ra từ màng tế bào, qua bào tương, vào nhân tế bào và

cuối cùng tác động lên yếu tố phiên mã, phát động tổng hợp protein, sinh sản

tế bào [20], (hình 2)

Nh− vậy quá trình hoạt động của gen, quá trình tiếp nhận và truyền các thông tin từ yếu tố kích thích xảy ra qua nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn do một loại protein đảm nhận Mà protein lại là sản phẩm của gen, điều đó cho thấy các oncogene tác động thông qua sản phẩm Hoffbrand đã phân loại các oncogene theo cách thức tác động của các protein sản phẩm nh− sau [25]:

Hình 1.2 : Sự truyền tin từ vị trí tiếp nhận

STAT : Signal

GAP : GTP - ase activating protein : Protein hoạt hoá phân giải GTP

MAP : Mitogen activated proteinase : enzym hoạt hoá gây phân bào

PKC : Protein Kinase C

- Sản phẩm của oncogene là yếu tố kích thích tăng sinh bên ngoài

Điển hình của loại này là gen C-SIS, gen này mã hoá chuỗi β của yếu tố kích thích phân chia tiểu cầu P - DGF (Platelet - Derived Growth Factory) vì một

lý do nào đó gen hoạt động quá mức làm mẫu tiểu cầu tiết quá mức yếu tố này gây hiện t−ợng kích thích phân bào các tế bào có nguồn gốc tổ chức liên kết, nhất là nguyên bào xơ [25]

- Sản phẩm oncogene là các protein có hoạt tính Tyrosine kinase trên

màng tế bào : Gồm các vị trí tiếp nhận yếu tố kích thích tăng trưởng (Growth Factor Receptor)

Ví dụ điển hình là oncogene FMS mã hoá protein cấu tạo vị trí tiếp nhận của yếu tố kích thích tạo cụm tế bào mono (M-CSF Monocyte Colony - Stimulating Factor) Một ví dụ nữa là oncogene KIT mã hoá protein cấu tạo

vị trí tiếp nhận yếu tố kích thích tạo tế bào gốc (SCF : Stem cell factor) Một

số oncogene khác liên quan tới enzym tyrosine kinase trên màng tế bào như SRC, FES và YES [25]

Bình thường khi tiếp xúc chất kích thích, vị trí tiếp nhận sẽ truyền tin theo mức độ kích thích Khi bị tổn thương do thay đổi cấu trúc, các vị trí tiếp nhận này sẽ truyền tin quá mạnh dù mức độ kích thích rất ít cho nên tế bào tăng sinh rất mạnh

- Sản phẩm oncogene là các chất truyền thông tin trong tế bào

Các oncogene này là các gen chỉ đạo tổng hợp protein điều hoà quá trình truyền thông tin thứ hai trong tế bào đáp ứng lại hiện tượng tiếp xúc với chất kích thích của vị trí tiếp nhận gồm :

+ Các oncogene N-RAS, H-RAS, K-RAS mã hoá protein RAS Khi protein này gắn với GTP (Guanosine Triphophate) trong bào tương thì giải phóng GDP (Guanosine Diphosphate) và có hoạt tính kích thích tế bào phân chia Một protein khác có tên GAP (GTPase Activating Protein) lại có đặc tính kích thích RAS gắn với GTP và như vậy GAP truyền thông tin cho RAS bằng cách kích hoạt protein này và qua đó hoạt hoá hệ thống phân chia tế bào [25]

Một protein thứ hai là NFI - sản phẩm của gen tổn thương trong bệnh neurofibromatose cũng có hoạt tính kích thích RAS gắn GTP

+ Các serin và theonine kinase Các protein này phosphoryl hoá các gốc serine, theonine và cũng tham gia vận chuyển thông tin từ màng tế bào vào nhân Có thể kể đến các oncogene có sản phẩm hoạt động kiểu này như MOS, PIM [25]

- Các oncogene nhân tham gia biệt hoá sao chép Các oneogene này

chỉ đạo tổng hợp protein, những protein đó ở trong nhân tế bào và tác động lên quá trình hoạt động của các gen khác Loại này gồm ba nhóm nhỏ:

+ Yếu tố phiên mã Ví dụ các gen JUN, FOS, MYC

Các gen này mã hoá protein gắn vào vị trí khởi động và điều khiển quá trình phiên mã của các gen khác Ví dụ gen JUN và FOS mã hoá các protein cấu tạo yếu tố phiên mã có vai trò quan trọng trong điều hoà hoạt động các gen chỉ đạo quá trình tăng sinh tế bào Vì một lý do nào đó JUN thể hiện quá mức, làm tăng mức khởi động các gen này và tế bào phân chia quá mức [25], gây ra hậu quả là tăng sinh tế bào

+ Một số protein là yếu tố kết hợp với hormon cũng có chức năng như yếu tố điều khiển phiên mã, các protein này ở trong nhân và tương tác với hormon để điều hoà quá trình phiên mã của ADN Protein tiếp nhận của acid retionic cũng thuộc nhóm này Theo Naeim thì những oncogene hoạt động theo cơ chế này thường tham gia biệt hoá tổ chức và phát triển cơ quan [43]

+ Gen ABL và lơ xê mi hạt kinh : bình thường gen ABL nằm trên NST

số 9 và chỉ đạo tổng hợp protein có hoạt tính tyrosine kinase và khu trú trong nhân tế bào, chức năng chưa rõ nhưng có liên quan đến tăng sinh, biệt hóa tế bào Khi gen này bị chuyển tới nối với một đoạn gen BCR (Breakpoint Cluster Region) ở nhiễm sắc thể 22 tạo ra một gen mới, protein sản phẩm của gen mới này lại ở trong bào tương, có hoạt tính kinase mạnh và hậu quả là tế bào tăng sinh có biệt hoá

Palumbo, Cacciola, Guglielmo cũng chia thành 4 nhóm như trên [45] Tuy nhiên Kaplan lại phân tích giai đoạn truyền tin theo các cơ chế khác nhau và như vậy có 6 hoạt động của oncogene [27] Có thể mô hình theo sơ

đồ sau : (hình 1.3)

Ngoài các loại trên, theo Hoffbrand, một số oncogene gây ung thư khác là những gen bình thường tham gia vào quá trình phát triển và chương trình chết của tế bào (programed cell death) Rối loạn việc thể hiện gen này

có thể làm tế bào dừng lại ở một giai đoạn phát triển và tích tụ lại gây ra bệnh

ác tính Bất thường gen MLL trong chuyển đoạn nhiễm sắc thể (4;11) tạo ra hiện tượng tế bào tồn tại lâu, gây lơ xê mi cấp thể tăng cao số lượng tế bào [25], [28], [40], [41], [65]

Hình 1.3: Các cơ chế tác động của sản phẩm oncogene (theo Kaplan)

1 Yếu tố tăng sinh

2 Vị trí tiếp nhận yếu tố tăng sinh

3 Các protein màng liên quan GTP

4 Các enzyme tyrosine kinase ở màng

5 Các enzyme protein kinase ở bào tương

6 Các protein hoạt hoá nhân

1.3.2.3 Gen ức chế u (Tumor suppressor gene)

Người ta đã chứng minh trong tế bào bình thường có những gen có tác dụng kìm hãm sinh trưởng, kiểm soát giúp tế bào duy trì tốc độ phát triển bình thường, chống lại hiện tượng tăng sinh quá mức, đó là gen ức chế u

Khi những gen này bị bất hoạt hay bị mất thì không kiểm soát được sự phân chia tế bào, đó là một nguyên nhân gây nên bệnh tăng sinh ác tính

Có nhiều bằng chứng cho thấy một trong những nguyên nhân dẫn đến quá trình phát triển ác tính của tế bào là mất vật liệu di truyền (mất đoạn NST) Bệnh được nói đến nhiều nhất là u liên bào võng mạc (retinoblastoma) Nhiều nghiên cứu cho thấy bệnh có tính di truyền trong khoảng 40% các trường hợp [24],[43] Dudin phân tích các cụm nhiễm sắc thể kỳ giữa của tế bào u ở những bệnh nhân mắc bệnh này thấy nhiều tế bào mất đoạn cánh dài NST 13 (13q-) [16]

Theo Naeim thì các gen này hoạt động theo cơ chế điều khiển ngược Người ta thấy gen muốn hoạt động phải có yếu tố phiên mã Yếu tố phiên mã của gen điều hoà quá trình phân chia tế bào võng mạc là E2F Gen Rb (Retinoblastoma gene) khu trú ở 13q14 và mã hoá một protein, protein này gắn vào yếu tố phiên mã E2F làm E2F chuyển từ trạng thái hoạt động phiên mã sang dạng bị ức chế (hình1 4)

Trong trường hợp có nhiều yếu tố E2F, tế bào phân chia mạnh sẽ kích hoạt gen Rb tạo ra nhiều sản phẩm để hạn chế hoạt động của E2F do đó tế bào không luân chyển vào giai đoạn S - giai đoạn tổng hợp protein và acid nhân nên không phân chia được, đó là sự điều hoà bình thường Vì lý do nào

đó gen Rb này không thể hiện được, nên không ức chế phiên mã do đó tế bào phân chia mạnh và bị ung thư (hình 4b) Naeim cũng thấy bất thường gen Rb trong tế bào ung thư ở 10-30% trường hợp lơ xê mi cấp, nhất là lơ xê mi cấp dòng tế bào mono [43]

Hình 1.4 : Hoạt động của gen Rb và cơ chế sinh ung th−

Hirai và Hoffbrand cũng cho rằng các protein sản phẩm của các gen này nằm ở trong nhân tế bào và có vai trò điều hoà phiên mã, kiểm soát quá trình chuyển từ G1 sang S, và qua S đến G2 trong chu kỳ phân bào [24], [25]

Bất thường gen này ở dạng đồng hợp tử sẽ mắc bệnh, còn bất thường ở dạng dị hợp tử sẽ được bù trừ do alen bình thường trên NST tương đồng nhưng gen bất thường sẽ di truyền cho thế hệ sau Tuy nhiên cơ thể dị hợp tử cũng sẽ bị bệnh nếu gen bình thường còn lại ở tế bào gốc sinh máu xảy ra đột biến

Theo Naeim, hiện nay người ta biết nhiều gen ức chế u [43] Gen p53 khu trú ở 17p13 (băng 3 vùng 1 trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 17) là một trong những gen được biết nhiều nhất, có vai trò trong sinh bệnh ác tính ở người Người ta phát hiện thấy có bất thường gen này trong 50% trường hợp các ung thư khác ở người Naeim cho rằng bình thường gen p53 mã hoá protein ức chế chuyển dạng tế bào, làm tế bào dừng lại ở G1 Mất gen này hoặc gen này bị ức chế sẽ không có sản phẩm protein để kiểm soát quá trình phân chia và tế bào sẽ tăng sinh liên tiếp

Hiện nay người ta đã phát hiện khoảng 230 đột biến của gen p53 và chúng là nguyên nhân của các bệnh ác tính khác nhau (MDS, CML, CLL, AML, ALL, u lympho) Trong đó một số đột biến liên quan đến tiến triển của bệnh như chuyển từ CML thành AML, ALL; chuyển từ MDS thành AML [35], [43]

1.3.3 Hoạt hoá các oncogene ở bệnh máu ác tính

Như trên đã nói, các oncogene và gen ức chế u vốn là những gen có sẵn trong tế bào và có chức năng nhất định ở các giai đoạn nhất định của sự hình thành, phát triển tế bào máu của cơ thể Hoạt động của các gen này bị rối loạn có thể do :

- Hoạt hoá oncogene không đúng thời điểm, hay gen này bị thay đổi hoặc bất hoạt gen ức chế u, sẽ làm rối loạn sự cân bằng trong quá trình tăng sinh và biệt hoá tế bào máu [6], [7], [9], [36] Một bất thường của gen có thể

chưa gây bệnh ác tính ngay mà một quá trình tiến triển liên tục các bất thường sẽ dần dần tạo nên tế bào ác tính [43]

Các gen bị rối loạn có thể do cấu tạo lại hay thay đổi vị trí do chuyển

đoạn NST, thay đổi do đột biến điểm, thừa đoạn Các gen này cũng có thể bị mất do mất đoạn NST hay do các nguyên nhân khác

1.3.3.1 Chuyển đoạn và cấu trúc lại NST

Cơ chế này đã được nghiên cứu rất nhiều và thể hiện rõ nhất trong bệnh lơ xê mi và u lympho [25], [43]

Ngày nay người ta thấy có hàng trăm chuyển đoạn NST và mỗi loại chuyển đoạn tạo ra một sự sắp xếp mới mà hậu quả là chuyển phần khởi

động của gen này tới toàn bộ hoặc một phần gen khác, làm gen đó được phiên mã, hay chuyển một phần gen cấu trúc của gen này nối với gen khác tạo một gen lai mới và protein sản phẩm của nó có hoạt tính gây tăng sinh tế bào Sau đây là một số chuyển đoạn NST thường gặp trong bệnh máu ác tính:

Chuyển đoạn (4;11) (q21;q23) và các chuyển đoạn khác liên quan tới 11q23: Bình thường gen MLL (Mixed Lineage Leukemia) khu trú ở 11q23, (băng 3, vùng 2, cánh dài, NST 11) sản phẩm của nó có phần gắn lên ADN

và có vai trò quan trọng cho hoạt động phiên mã các gen liên quan đến quá trình biệt hoá Trong chuyển đoạn (4; 11) gen này bị chuyển tới gắn với gen AF4 ở NST 4 [7], [17], [18], [28], [40], [43], [66]

Mark Chalk thấy chuyển đoạn này làm mất tính bình thường của gen MLL và protein sản phẩm của nó không gắn lên ADN được cho nên tế bào không phân chia và biệt hoá được [40] Theo nhiều tác giả, tế bào chuyển từ giai đoạn này sang giai đoạn khác trong chu kỳ cần đến những protein đặc thù [28], [34].ở đây thiếu những protein đó, tế bào không nhân lên nhưng lại tích tụ lại ở giai đoạn G và S

Kersey và Wang dùng kỹ thuật nuôi cấy và theo dõi tế bào có t(4;11) (q21;q23) thì thấy cơ chế tích tụ nhiều tế bào ác tính ở đây không phải là do tăng sinh mà là do tế bào tồn tại lâu, không chết [28] Như vậy đây là ví dụ

điển hình của bất thường gen dẫn đến rối loạn “chương trình chết của tế bào”

Ngoài chuyển đoạn (4;11) còn nhiều chuyển đoạn khác cũng liên quan tới gen MLL như t(6;11), t(10;11), t(11;17), [41], [66] Đến nay người ta biết

đến trên 30 chuyển đoạn NST trong các bệnh ung thư liên quan tới vị trí NST

ở băng 11q23 [32]

- Chuyển đoạn t(8;21) (q22; q22) là chuyển đoạn rất thường gặp trong lơ xê mi tủy cấp thể M2 (theo FAB) Hậu quả chuyển đoạn này là chuyển oncogene AML1 (Acute Myeloid Leukemia) trên NST 21 đến gắn với gen ETO (Eight Twenty One) trên NST số 8 Gen AML1 bình thường mã hoá protein có vai trò trong hoạt hoá phiên mã làm tế bào phân chia và biệt hoá Khi bị chuyển đoạn, thì protein sản phẩm của gen lai AML1/ETO không những không có chức năng của protein sản phẩm gen AML1 mà còn ức chế protein AML1 bình thường do đó tế bào bị ung thư hoá [7] Và như vậy với cơ chế này chỉ cần dị hợp tử AML1/ETO là có thể bị bệnh

Theo Appelbaum, người ta đã thực nghiệm ghép gen AML1/ETO cho chuột thì chuột thể hiện bị bệnh như đồng hợp tử không có gen AML1 [7] mặc dù ngoài gen ghép, chuột còn gen AML1 bình thường

Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, Downing và Head phân tích ADN của 26 bệnh nhân người Anh có t(8;21) (q22; q22) [12] Cùng thời gian này Kozu và Miyoshi cũng dùng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) để nghiên cứu điểm nối các gen trong chuyển đoạn (8; 21) ở 6 bệnh nhân người Nhật Bản bị lơ xê mi [31]

Các tác giả đều thấy ở tất cả tế bào mang chuyển đoạn (8; 21) đều có gen lai AML1/ETO Như vậy điểm nối gen trong loại tổn thương NST này là

đặc hiệu

- Chuyển đoạn (9;22) và tạo gen lai (ABL/BCR: đây là bất thường

được nghiên cứu nhiều nhất

Năm 1982, Heisterkamp, năm 1984, Groffen, và sau đó nhiều tác giả khác sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu cho thấy hậu quả của t(9;

22) (q34; q11) chuyển đoạn nhiễm sắc thể đặc hiệu trong bệnh lơ xê mi hạt kinh) là mang oncogene ABL ở NST 9 đến nối với đoạn giữa của gen BCR trên NST 22 tạo nên gen lai ABL/BCR (hình 1 5)

Hình 1.5: Mô hình tạo các gen lai ABL/BCR do chuyển đoạn NST t(9;22)

(q34;q11) (theo Hoffbrand)

1 Điểm gẫy ở exon 2 - 3/BCR tạo protein 210 KD

2 Điểm gẫy ở intron 1/BCR tạo protein 190 KD

Người ta thấy có hai điểm gãy trên gen BCR ở NST 22 để nối với gen ABL Thông thường điểm gãy ở giữa exon 2 và exon 3 của gen BCR gọi là

điểm M (Major) và gen lai ABL/M-BCR mã hoá một protein có trọng lượng phân tử 210 KD và có hoạt tính kinase mạnh hơn sản phẩm của gen ABL bình thường, do đó tế bào tăng sinh có biệt hoá quá mức và sinh bệnh lơ xê

mi hạt kinh (Chronic Myeloid Leukemia = CML) [20], [25], [33]

Trong một số trường hợp khác, điểm gãy trên gen BCR là ở intron 1 gọi là điểm m (minor) làm gen ABL nối với gen BCR ở vị trí m, gen lai ABL/m-BCR mã hoá 1 protein có trọng lượng phân tử 190KD Protein này có hoạt tính tăng sinh mạnh nhưng không biệt hoá và gây ra bệnh lơ xê mi lympho cấp (Acute Lymphoblastic Leukemia = ALL) [25]

- Chuyển đoạn (8; 14) (q24;q32) và oncogene MYC

Như đã trình bày ở trên, thay đổi oncogene MYC có thể gây bệnh lơ xê

mi lympho ở gà [60], ở người, gen này nằm trên NST 8 và có thể chuyển đến NST 14 do chuyển đoạn (8;14) ở vị trí mới gen MYC không được điều hoà hoạt động do đó hoạt động ở những giai đoạn trong chu kỳ phân bào mà bình thường nó không hoạt động và hậu quả là tế bào phân chia không bình thường [9], [17]

- Chuyền đoạn (15; 17) (q22;q11) và gen lai PML/RARα Đây là chuyển đoạn đặc hiệu trong lơ xê mi tủy cấp, thể M3 (phân loại FAB) Chuyển đoạn này mang gen RARα (Retinoic Acid Receptor α) trên NST 17

đến gắn với gen PML (Promyelocytic Leukemia) trên NST 15 [7], [25], [62]

Bình thường protein sản phẩm của gen RARα có chức năng hoạt hoá quá trình phiên mã (hoạt hoá để ADN dãn xoắn và tổng hợp mARN) của các gen có vai trò giúp tế bào trưởng thành Cấu trúc của protein này có phần gắn vào ADN và một phần tương tác với dẫn chất của acid retinoic Trong trường hợp chuyển đoạn (15;17) gen lai RARα/PML mã hoá protein mới, protein mới này không những không hoạt hoá phiên mã mà còn ức chế chức năng của PML bình thường do đó tế bào không tổng hợp được protein, không chín (trưởng thành) được Trong trường hợp này quá trình trưởng thành tế bào dừng lại ở giai đoạn tiền tủy bào

Theo Appelbaum thì để hoạt động ức chế phiên mã, protein RARα/PML phải gắn với một phức chất khác gồm chất đồng ức chế nhân :

NCoR (Nuclear Co-repressor) và enzym histone deacetylase (HD) [7]

Hình 1.6 : Protein RARα/PML ức chế phiên m∙ và vai trò giải ức chế của

ATRA (theo Appelbaum)

Hiện tượng gắn hai phức chất này sẽ bị ly giải với sự có mặt của dẫn chất acid retionic và khi ly giải thì protein RARα/PML không còn tác dụng Lợi dụng đặc tính này người ta dùng ATRA (All Trans Retionic Acid) để

điều trị bệnh [7], [25], [43], [62] (hình 6)

Cơ chế tạo gen lai giữa gen RARα với các gen khác cũng gặp trong một số chuyển đoạn NST 17 với NST khác như t(11;17) và hậu quả cũng là lơ

xê mi tủy cấp, thể M3 [24],[33]

Ngoài các chuyển đoạn cụ thể trên, còn nhiều chuyển đoạn khác gây

ra sự sắp xếp lại vị trí các oncogene ở tế bào gốc sinh máu làm rối loạn hoạt

động bình thường của gen, dần dần dẫn đến bệnh lơ xê mi

1.3.3.2 Đột biến điểm :

Là những bất thường gen do thay đổi các nucleotid trên ADN, minh hoạ rõ nhất là các bất thường oncogene RAS Theo Hoffbrand thì người ta thấy đột biến oncogene RAS ở nhiều bệnh ác tính : AML (20-30%), ALL (15-20%) Rối loạn sinh tủy (20-40%), đa u tủy xương (20%) [7] Các điểm

đột biến có thể ở các bộ ba (condon) thứ 12, 13 hay 61 làm cho hoạt tính phân giải GTP của protein sản phẩm tăng cao [24],[35]

Người ta đã biết rằng : gen RAS làm khuôn mẫu thông tin để tổng hợp protein RAS Protein RAS là chất hoạt động truyền tin trong tế bào

Hoạt động truyền tin kích thích phân bào của RAS là phân giải GTP thành GDP, như vậy trong trường hợp gen RAS bị đột biến, protein RAS sẽ tăng cao hoạt tính làm tế bào phản ứng mạnh với yếu tố kích thích

Theo Hirai và Hoffbrand thì đột biến ở gen RAS liên quan nhiều đến việc truyền tin M-CSF [24], [25]

Nhiều tác giả nghiên cứu thấy đột biến điểm trên gen chỉ đạo tổng hợp protein cấu tạo vị trí tiếp nhận erythropoietin (EPor = erythropoietin receptor)

ở tế bào gốc tạo máu là nguyên nhân gây bệnh đa hồng cầu nguyên phát có tính chất gia đình [18], [56]

Sokol, Luhovy phân tích trình tự bazơ nitơ ở gen Epor của những bệnh nhân đa hồng cầu và thấy đột biến là xen một bazơ nitơ Guanin vào gen cấu trúc Epor làm cho các bộ ba nucleotit từ chỗ xen đoạn về sau bị thay đổi và hậu quả là thay đổi 64 acid amin trong chuỗi polypeptit của protein cấu tạo vị trí tiếp nhận và protein này nhạy cảm quá mức với nồng độ erythropoietin bình thường [56]

Người ta thấy các đột biến rất thường gặp ở gen ức chế u P53 Khi nghiên cứu protein sản phẩm của gen P53, Slinggerland, Minden thấy các đột biến làm thay đổi acid amin ở các vị trí 135, 246 hay 274 và có trường hợp hai đột biến khác nhau trên hai alen khác nhau của một bệnh nhân [54], Sugimoto, Toyoshima nuôi cấy tế bào lơ xê mi của 9 bệnh nhân lơ xê mi tủy

cấp và phân tích gen P53 thì thấy tỷ lệ đột biến rất cao, các đột biến làm mất chức năng của protein sản phẩm là thêm 4 hay 5 bazơ nitơ, hoặc thay thế bazơ nitơ [57]

Đột biến có thể ở phần khởi động của gen làm gen thể hiện ở những tế bào và giai đoạn không phù hợp cũng là nguyên nhân phát sinh bệnh [15]

1.3.3.3 Nhân đoạn gen (Amplification):

Một gen bình thường được nhân lên nhiều bản do nhân đoạn hay do thừa NST Thừa NST số 8 làm thừa oncogene MYC là một ví dụ cho cơ chế này Khi phân tích bất thường NST trong lơ xê mi, nhiều tác giả thấy tỷ lệ bệnh nhân có trisomy 8 (3 NST số 8) trong tế bào ác tính rất cao [17],[33], [35]

1.3.4 Bất hoạt gen ức chế u :

Khác với cơ chế phát sinh bệnh do hoạt hoá oncogene Đối với ung thư

do gen ức chế thì chỉ xảy ra ung thư khi cả 2 alen đều bị bất hoạt (dạng đồng hợp tử) [30] Thông thường những trường hợp dị hợp tử bất hoạt gen ức chế u

di truyền dễ bị mắc bệnh do alen còn lại bị mất hoặc bất hoạt Nhiều cơ chế mất hoặc bất hoạt alen còn lại

Mất gen có thể do mất đoạn NST [17],[24],[25],[34] Năm 1998, Rai

và Kipps phân tích các bất thường di truyền bằng kỹ thuật tế bào di truyền và sinh học phân tử ở những bệnh nhân bị bệnh lơ xê mi lympho kinh tế bào B, thì thấy hầu hết các biến loạn di truyền ở những bệnh nhân này không liên quan đến oncogene mà khoảng 15% có bất hoạt gen P53 (gen ức chế u)

Ngoài ra, khi phân tích bằng kỹ thuật tế bào di truyền các tác giả thấy

có đến 25% bệnh nhân bị mất đoạn nhánh dài NST 13 ở vị trí 13q14, song khi dùng kỹ thuật sinh học phân tử người ta thấy tỷ lệ bệnh nhân mất đoạn gen ở 13q14 còn cao hơn nhiều Như vậy ở 13q14 có gen ức chế u và mất

đoạn 13q14 làm bất hoạt gen đó và từ đó phát sinh bệnh [47]

Theo nhiều nhà nghiên cứu thì gen Rb ở 13q14 có trách nhiệm trong một số u liên bào võng mạc cũng là nguyên nhân gây ra bệnh này

Khi nghiên cứu những bất thường di truyền ở bệnh nhân mắc hội chứng rối loạn sinh tủy Anderson, Giliand cũng cho rằng bất thường NST kiểu mất đoạn gây mất vật liệu di truyền, mất gen ức chế sự phát triển u là cơ chế chủ yếu phát sinh bệnh [6]

Theo Kaplan, một cơ thể dị hợp tử gen bệnh có thể bị bệnh ung thư do các lý do sau : [27]

Nhiễm sắc thể không phân ly - trao đổi chéo soma - mất nhiễm sắc thể,

đột biến điểm hay gen còn lại bị ức chế

1.3.5 Vai trò phát hiện bất thường di truyền trong nghiên cứu bệnh lơ xê mi

Bất thường di truyền do chuyển đoạn NST t(9; 22) trong lơ xê mi hạt kinh là tạo nên gen hỗn hợp (gen lai) ABL/BCR đã được Heisterkamp phát hiện và đã được ứng dụng trong chẩn đoán, theo dõi và điều trị bệnh

Rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy trong bệnh lơ xê mi hạt kinh tỷ lệ có nhiễm sắc thể Ph1 là khoảng 95% Trong số 5% bệnh nhân không có NST Ph1 thì có khoảng 1/2 trường hợp vẫn có bất thường gen dạng ABL/BCR

Đối với lơ xê mi cấp nhiều nghiên cứu cho thấy các bất thường gen đi

đôi với tiên lượng của bệnh Một số bất thường gen có tiên lượng tốt như AML/ETO

Những bất thường này mất đi khi bệnh nhân được điều trị lui bệnh hoàn toàn Tuy nhiên nếu bệnh nhân chỉ lui bệnh về lâm sàng và tế bào học

mà xét nghiệm gen vẫn xác định còn bất thường gen thì thường tái phát nhanh

Năm 2001, Tổ chức Y tế Thế giới đã đưa ra cách phân loại bệnh máu

và tổ chức lympho là trước hết dựa vào các bất thường gen đặc trưng để xếp thành nhóm bệnh gọi là nhóm có bất thường gen hay gặp, cụ thể :

- Những bệnh nhân có gen hỗn hợp AML/ETO (gen lai AML/ETO)

- Những bệnh nhân có gen hỗn hợp PML/RARα

- Bệnh nhân có gen hỗn hợp CBFβ/MYH11

Những bất thường trên tương ứng với các dạng bất thường nhiễm sắc thể trước đây là t(8; 21); t(15; 17), inv(16) Nhưng với kỹ thuật phân tích bất thường gen này người ta có thể nâng cao độ chính xác và đặc hiệu lên nhiều [21]

Như vậy, để tiếp cận với cách phân loại này thì phải tổ chức thực hiện xét nghiệm phát hiện bất thường gen trong các cơ sở điều trị bệnh máu

1.3.5.2 Một số kỹ thuật xác định bất thường gen trong lơ xê mi

Ngày nay nhờ kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi, người

ta có nhiều cách thức hay phương pháp để xác định sự có mặt của gen bất thường

- Kỹ thuật FISH (Fluorescence In situ Hybridization) Đây là kỹ thuật

với nguyên lý đơn giản Người ta dùng các đầu dò (probe) có trình tự các nucleotit tương ứng với trình tự nucleotit của đoạn gen bất thường, lợi dụng sợi đôi ADN dãn xoắn trong điều kiện nhiệt độ hay pH đặc biệt sau đó các sợi đơn tương ứng lại liên kết lại Đánh dấu đầu dò bằng chất phát hiện rồi ủ với tiêu bản nghi có gen bất thường sau khi làm dãn xoắn ADN Nếu có các nucleotid tương đồng thì đầu dò sẽ liên kết và phát hiện được

- Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reation)

Lợi dụng đặc tính của ADN là có thể tự tổng hợp được dựa trên cơ sở một sợi đơn và một đoạn mồi có trình tự nucleotit tương đồng với sợi đơn Người ta tổng hợp nên những đoạn mồi có trình tự nucleotit tương đồng với gen bất thường rồi cho dãn xoắn ADN và thực hiện tổng hợp Trường hợp có bất thường gen và sẽ có sản phẩm ADN