Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh greening trên cây có múi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LỘC TUẤN HOẠT Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 – 2015 THÁI NGUYÊN - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LỘC TUẤN HOẠT Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K43 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 – 2015 Giảng viên : ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH-CNTP –Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên THÁI NGUYÊN - 2015 i LỜI CẢM ƠN Được đồng ý khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Em thực tập phòng thí nghiệm Khoa CNSH – CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát bệnh greening có múi” để hoàn thành khóa luận nỗ lực thân em nhận nhiều giúp đỡ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, thầy cô giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, thầy cô giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học vừa qua để em hoàn thành khóa luận Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Đình Lãm người tận tình hướng dẫn em suốt trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS Lã Văn Hiền dành nhiều thời gian quý báu trực tiếp hướng dẫn em thực nghiên cứu đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè quan tâm, ủng hộ động viên em suốt trình học tập nghiên cứu giúp em hoàn thành tốt khóa luận Do điều kiện thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi thiếu sót Kính mong thầy cô giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 30 tháng năm 2015 Sinh Viên Lộc Tuấn Hoạt ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các loài cam, quýt có ý nghĩa thực tiễn sản xuất Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cam, quýt châu lục giới giai đoạn 2007 2009 13 Bảng 2.3: Diện tích, suất sản lượng cam, quýt giới giai đoạn 2002 – 2009 14 Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt nước ta giai đoạn 2002 – 2009 15 Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam, quýt vùng nước ta năm 2009 15 Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát tác nhân gây bệnh greening (Hung cs, 1999b), (Hung cs, 2004) [28], [29] .27 Bảng 3.2: Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm .28 Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu địa phương .29 Bảng 3.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 32 Bảng 4.1: Kết đánh giá mẫu cam sành huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang .34 Bảng 4.2: Kết đánh giá mẫu chanh, quýt cam thu Hà Nội, Lạng Sơn, Thái Nguyên .35 Bảng 4.3: Kết so sánh biểu bệnh qua triệu chứng bện giải phẫu mô tế bào thực vật 38 Bảng 4.4: Kết giám định bệnh vàng greening cam, quýt chanh .43 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Rầy chổng cánh Diaphorina citri 17 Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng greening có múi .18 Hình 4.1 Mẫu có múi thu thập để giám định bệnh vàng greening 33 Hình 4.2 Hình ảnh giải phẫu mô tế bào mẫu cam sành .36 Hình 4.3 Hình ảnh giải phẫu mô tế bào quýt .37 Hình 4.4 Hình ảnh giải phẫu mô tế bào có biểu nghi nhiễm 37 Hình 4.5 Kết tách chiết DNA tổng số .40 Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR mẫu giám định bệnh greening 41 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BVTV : Bảo vệ Thực vật Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐC : Đối chứng dNTP : Nước khử ion không chứa Dnase RNase EDTA : Ethylene diamine tetraacetate FAO : Food and Agriculture Organization NN&PTNT : Nông nghiệp Phát triển Nông thôn PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 1.3 Yêu cầu nghiên cứu 1.4 Mục tiêu nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan có múi .4 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Giá trị có múi .5 2.1.3 Đặc điểm thực vật học có múi .7 2.1.4 Yêu cầu sinh thái có múi 2.1.5 Một số sâu bệnh hại có múi .10 2.1.6 Tình hình sản xuất có múi 12 2.2 Bệnh vàng Greening có múi .16 2.2.1 Lịch sử bệnh .16 2.2.2 Nguyên nhân triệu chứng bệnh 16 2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng greening 19 2.3 Cơ sở khoa học việc ứng dụng kỹ thuật PCR phát bệnh vàng greening .21 2.3.1 Nguyên lý ứng dụng kỹ thuật PCR 21 2.3.2 Các thành phần phản ứng PCR 22 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ đặc hiệu phản ứng PCR 22 2.3.4 Các bước thực phản ứng PCR 22 2.4 Tình hình nghiên cứu phát bệnh greening có múi 23 2.4.1 Các nghiên cứu phát bệnh giới 23 vi 2.4.2 Các nghiên cứu phát bệnh Việt Nam 25 Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Vật liệu nghiên cứu 27 3.1.1 Vật liệu thực vật 27 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 27 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 28 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 28 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 3.3 Nội dung nghiên cứu 29 3.4 Phương pháp nghiên cứu 29 3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu vật liệu 29 3.4.2 Phương pháp xác định biểu bệnh greening 30 3.4.4 Phương pháp sử lý số liệu .32 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết thu thập mẫu vật liệu 33 4.2 Kết xác định mức độ biểu bệnh .34 4.2.1 Kết xác định biểu bệnh thông qua triệu chứng bên 34 4.2.2 Kết xác định biểu bệnh thông qua quan sát hình thái mô tế bào thực vật 36 4.3 Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 39 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số mẫu 39 4.3.2 Kết nhân đoạn gen 16s rDNA 40 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phần MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Cây có múi (cam, chanh,quýt, bưởi ), thuộc họ Rutaceae, loại ăn trồng phổ biến giới Việt Nam Cây có múi loại trồng mang lại giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế cao Trong 100g thịt tươi có chứa - 12% đường, vitamin C từ 40 - 90 mg, acid hữu từ 0,4 - 1,2%, chất khoáng dầu thơm (Đường Hồng Dật, 2003) [3] Sản phẩm có múi sử dụng với nhiều mục đích khác làm thực phẩm sử dụng hàng ngày, làm mứt, nước giải khát Tinh dầu cất từ vỏ quả, lá, hoa dùng nhiều công nghệ thực phẩm mỹ phẩm Vỏ dùng làm thuốc, hương liệu (Đường Hồng Dật, 2003) [3] Ngoài ra, việc trồng ăn có múi mang lại nguồn thu nhập lớn cho người làm vườn Theo ước tính, suất trung bình cam, quýt đạt từ 15 – 20 tấn/ha, sản phẩm có múi cam, quýt bán thị trường với giá dao động khoảng 15.000 – 20.000 đồng/kg mang lại nguồn thu nhập từ 300 – 400 triệu đồng/ha/năm (Đương Hồng Dật, 2003) [3] Vì sản xuất ăn có múi trọng, đầu tư phát triển mạnh mẽ Trên giới, ăn có múi trồng chủ yếu nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới, nhiệt đới ôn đới Ở Việt Nam có múi trồng ba miền Bắc, Trung Nam Năm 2011, diện tích ăn có múi Việt Nam đạt 124,057 ha, diện tích trồng cam quýt chiếm tới 70,300 ha, bưởi 45,000 chanh 18,000 (Bộ NN&PTNT) [1] Song đa dạng khí hậu vùng trồng trọt điều kiện thích hợp cho nhiều loài sâu bệnh phát sinh gây hại có múi, nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp đến suất chất lượng (Lê Mai Nhất, 2014) [8] Một số bệnh điển hình có múi như: Bệnh Tristeza, bệnh vàng thối rễ, ghẻ nhám Trong bệnh vàng gân xanh (bệnh greening) gây hại hầu hết ăn có múi Bệnh dòng vi khuẩn Gram âm gây Dòng châu có tên Candidatus liberibacter asiaticus, dòng châu phi có tên Candidatus liberibacter africanus Các dòng vi khuẩn sống mạch libe lây truyền từ sang khác thông qua mắt ghép môi giới truyền bệnh rầy chổng cánh (Diaphorina citri) châu Á rầy cam (Trioza erytreae) châu Phi (Hung.T.H cs, 2004) [29] Đặc điểm bệnh greening có thời gian ủ bệnh dài, nên khó phát bệnh giai đoạn đầu thường hay nhầm lần với bệnh khác bị thiếu kẽm (Zn) (Lê Mai Nhất, 2014) [8] Đến bệnh biểu rõ ràng bị bệnh nặng biện pháp chữa trị gần vô nghĩa, nhiều biện pháp thực không mang lại hiệu Vì vậy, việc phát nhanh bệnh vàng greening giai đoạn đầu vô quan trọng việc phòng điều trị bệnh Ngày việc ứng dụng kỹ thuật Sinh học phân tử đại cho phép chẩn đoán bệnh có múi mang lại hiệu cao với nhiều ưu điểm như: độ nhạy cao, xác thời gian Có thể kể đến số phương pháp như: PCR, real-time PCR, kỹ thuật lai phân tử (Quyền Đình Thi, 2008) [11] Kết thu từ nghiên cứu chẩn đoán sinh học phân tử sở để sớm đưa giải pháp phòng tránh Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu đó, tiến hành thực đề tài : ‘‘Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát bệnh greening có múi ’’ 1.2 Mục đích nghiên cứu Chẩn đoán bệnh vàng greening có múi kỹ thuật PCR 1.3 Yêu cầu nghiên cứu - Thu thập nguồn vật liệu số đối tượng có múi như: Cam, chanh, bưởi, quýt - Xác định biểu bệnh greening mẫu vật liệuthu thập - Giám định bệnh vàng greening có múi phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 1.4 Mục tiêu nghiên cứu - Thu thập mẫu vật liệu số đối tượng có múi như: Cam, chanh, quýt, bưởi địa phương khác - Giải phẫu mô học mẫu có múi nghi nhiễm bệnh mẫu lành bệnh 38 Bảng 4.3: Kết so sánh biểu bệnh qua triệu chứng bện giải phẫu mô tế bào thực vật Giống Cam Sành Cam Sành Quýt Ngọt Chanh Thanh Yên Chanh giấy Cam Vinh Mẫu số 1ĐC 10 11 12 10 11ĐC 5 Triệu chứng Biểu mô tế bào Không có biểu Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng lốm đốm Lá vàng, gân xanh Lá vàng cục Lá vàng cục Lá vàng lốm đốm Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng lốm đốm Lá vàng cục Lá vàng lốm đốm Lá vàng lốm đốm Lá vàng cục Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng lốm đốm Lá vàng gân xanh Lá vàng gân xanh Lá vàng gân xanh Lá vàng gân xanh Không có biểu Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, phiến hẹp Lá nhỏ, phiến hẹp Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng cục Lá nhỏ, phiến vàng, hẹp Lá vàng, gân xanh Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng lốm đốm Không có biểu Xuất đám tế bào màu đen Tế bào biến dạng hình thái Tế bào biến dạng hình thái Xuất đám tế bào màu đen Không có biểu Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng Tế bào biến dạng Xuất đám tế bào màu đen Không có biểu Tế bào biến dạng Tế bào biến dạng Xuất đám tế bào màu đen Tế bào biến dạng Tế bào chồng chéo lên Xuất đám tế bào màu đen Không có biểu Tế bào biến dạng hình thái Tế bào biến dạng hình thái Xuất đám tế bào màu đen Không có biểu Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng, có lỗ trống Tế bào biến dạng, có lỗ trống Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng màu sắc Tế bào biến dạng hình thái Tế bào biến dạng, có lỗ trống Không có biểu Tế bào biến dạng, có lỗ trống Xuất đám tế bào màu đen Tế bào biến dạng, có lỗ trống Tế bào biến dạng hình thái Kết (*) + + + + + + + + + + + + + + + + + + (*) + + + + + + + + + + + Chú thích: (+), Có triệu chứng, biểu mô tế bào;(-), có triệu chứng, không biểu mô tế bào; (*), Đối chứng 39 Các thí nghiệm cho thấy biểu mô tế bào bao gồm biểu như: Tế bào biến dạng hình thái, màu sắc, xuất đám tế bào màu đen, lỗ trống hay tế bào nằm chồng chéo lên nhau, phần lớn biến dạng tế bào Khi tiến hành giải phẫu 33 mẫu vật liệu có biểu triệu chứng bệnh bên có 29 mẫu cho thấy biểu bệnh mô tế bào (+), mẫu biểu bệnh mô tế bào (-), điều cho thấy biểu bệnh bên biểu bệnh mô tế bào đồng nhất, điển hình mẫu Cam sành (mẫu 6, 12), quýt (mẫu 6), cam vinh (mẫu 3) có biểu triệu chứng bên không cho thấy biểu mô tế bào Mặt khác mẫu có triệu chứng bệnh bên giống cho kết giải phẫu không giống ngược lại, nhìn bảng ta thấy mẫu Cam sành số có biểu bên vàng, gân xanh kết giải phẫu xuất đám tế bào màu đen mẫu số tế bào biến dạng hình thái mẫu số 3, mẫu số cho kết giải phẫu giống với mẫu số có triệu chứng bên vàng lốm đốm, biểu mẫu lại có khác tương tự Từ kết lần cho thấy việc đánh giá biểu bệnh thông qua triệu chứng bên giải phẫu mô tế bào thực vật đồng độ tin cậy cao công tác giám định bệnh vàng greening, cần tiến hành biện pháp để giám định bệnh vàng greening cho kết xác Kết giải phẫu nghiên cứu chưa xác định vị trí cụ thể vi khuẩn, giám định xác bệnh, sở để tiến hành giám định bệnh vàng greening khẳng định rõ chẩn đoán sinh học phân tử 4.3 Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số mẫu Các mẫu vật liệu thu thập địa phương chuyển tới phòng thí nghiệm để tiến hành tách chiết DNA tổng số phục vụ cho công việc giám định Phương pháp tách chiết DNA tổng số tiến hành dựa phương pháp CTAB Saghai maroof, 1984 (Jame.C, 2008) [32] Có vài cải tiến để 40 phù hợp với điều kiện nghiên cứu cụ thể Kết tách chiết DNA tổng số trình bày hình 4.3 Hình 4.5 Kết tách chiết DNA tổng số A, Cam Sành (Hà Giang); B, Chanh Thanh Yên (Viện Bảo vệ Thực vật – Hà Nội); C, Quýt Ngọt (huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn); D, Chanh Giấy Cam Vinh ( xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) A, C D: Các đường chạy gel tương ứng với số mẫu thu Hà Giang, Lạng Sơn Thái Nguyên; B: Đường chạy 1,2 tương ứng với mẫu số Đường chạy 3,4; 5,6; 7,8; 9,10 tương ứng với số mẫu 2,3,4,5 thu Viện Bảo vệ Thực vật – Hà Nội DNA tổng số tất mẫu tách chiết nhìn chung loại hoàn toàn RNA Nồng độ DNA tổng số thu được kiểm tra đo quang phổ bước sóng 260 280 nm Kết rằng, DNA tổng số đạt chất lượng nồng độ cao để thực cho thí nghiệm 4.3.2 Kết nhân đoạn gen 16s rDNA Phản ứng PCR giám định bệnh greening tiến hành với mồi đặc hiệu Cặp mồi sử dụng thiết kế dựa nghiên cứu Hung cs (2004) [29] với kích thước sản phẩm PCR 226 bp 41 Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR mẫu giám định bệnh greening A Cam sành (huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang) 2/12 mẫu dương tính; B Quýt (huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn) 8/11 mẫu dương tính; C Chanh Thanh Yên (Viện Bảo Vệ Thực Vật, Hà Nội) 5/5 mẫu dương tính; D Chanh Giấy cam vinh (xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên) 1/2 mẫu chanh giấy 5/5 mẫu cam vinh dương tính Trong tất trường hợp A, B, C, D giếng (1) : Mẫu đối chứng âm tính (2): Mẫu đối chứng dương tính M : Thang chuẩn DNA 100 bp Hình 4.6.A, 4.6.B, 4.6.C 4.6.D Bảng 4.4 cho thấy việc giám định bệnh thực cam Sành, quýt Ngọt, chanh Giấy chanh Thanh Yên địa phương lấy mẫu xuất kết kết dương tính với bệnh greening Cụ thể, hình 4.6.A với 12 mẫu cam Sành giám định có hai mẫu đường chạy xuất băng có vị trí trùng với băng đường chạy số (đối chứng dương – mẫu DNA nhiễm bệnh từ Viện Bảo vệ Thực vật – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) với kích thước khoảng 226 bp, điều chứng tỏ hai mẫu đường đường chạy số có biểu dương tính với bệnh greening Tương tự với hình 4.6.B, 4.6.C 4.6.D thu số mẫu có biểu dương tính cao 8/11 mẫu, 5/5 42 mẫu 6/7 mẫu Đối với hình 4.6.C có 5/5 (100%) mẫu chanh Thanh Yên hình 4.6.D có 5/5 (100%) mẫu cam Vinh (đường chạy số đến 9) xuất băng có kích thước 226 bp, bên cạnh mẫu chanh Giấy ½ mẫu bị nhiễm bệnh greening (đường chạy 4) Như tổng số 33 mẫu cho có biểu nghi nhiễm bệnh thông qua việc xác định biểu bệnh triệu chứng bên 29 mẫu giải phẫu mô tế bào thực vật (có biểu mô tế bào) có 21 mẫu dương tính lại 14 mẫu không nhiễm bệnh (âm tính) Điều chứng tỏ phương pháp xác định bệnh mắt thường giải phẫu mô tế bào thực vật có mức độ sai số cao Kỹ thuật PCR ứng dụng để giám định bệnh vàng greening đáp ứng yêu cầu sản xuất thời điểm tương lai gần Đây kỹ thuật cho phép trả lời nhanh kết sản xuất công tác kiểm dịch hàng hóa cửa bệnh greening giống sản phẩm tươi nhập vào Việt Nam Với kỹ thuật này, từ nhận mẫu phòng nghiệm công đoạn cuối 4-5 Đây kỹ thuật ngày sử dụng rộng rãi chẩn đoán bệnh vàng greening để kiểm định giống trước xuất vườn xác định lây lan bệnh vườn môi giới truyền bệnh 43 Bảng 4.4: Kết giám định bệnh vàng greening cam, quýt chanh Địa điểm Giống Xã Vĩ Thượng, Quang Bình, Hà Giang Cam Sành Xã Yên Hà, Quang Bình, Hà Giang Cam Sành Xã Đồng Ý, Bắc Sơn, Lạng Sơn Quýt Ngọt Viện Bảo Vệ Thực Vật, Hà Nội Chanh Thanh Yên Xã Quyết Thắng – TP Thái Nguyên Chanh giấy Cam Vinh Mẫu số 10 11 12 10 11 5 Đƣờng chạy 10 11 12 13 14 10 11 12 13 7 Kết Tỷ lệ Triệu chứng nhiễm Không có biểu Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh + Lá vàng lốm đốm + Lá vàng, gân xanh Lá vàng cục 2/12 mẫu, (16,6%) Lá vàng cục Lá vàng lốm đốm Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng lốm đốm Lá vàng cục + Lá vàng lốm đốm + Lá vàng lốm đốm Lá vàng cục Lá vàng, gân xanh + Lá vàng, gân xanh 8/11 mẫu, + Lá vàng lốm đốm (72,7%) + Lá vàng gân xanh + Lá vàng gân xanh + Lá vàng gân xanh + Lá vàng gân xanh Không có biểu + Lá nhỏ, vàng lốm đốm + Lá nhỏ, vàng lốm đốm 5/5 mẫu, + Lá nhỏ, phiến hẹp (100%) + Lá nhỏ, phiến hẹp + Lá nhỏ, vàng lốm đốm Lá nhỏ, vàng cục ½ mẫu, + Lá nhỏ, phiến vàng, hẹp (50%) + Lá vàng, gân xanh + Lá nhỏ, vàng lốm đốm 5/5 + Lá nhỏ, vàng lốm đốm mẫu(100%) + Lá nhỏ, vàng lốm đốm + Lá nhỏ, vàng lốm đốm Chú thích:(+), Cây nhiễm bệnh greening; (-), Cây không nhiễm bệnh greening 44 Các kết nghiên cứu đạt có tương đồng với kết công bố Hung cs (2004) [29] tác giả sử dụng mồi đặc hiệu nhân đoạn 16s rDNA với khích thước 226 bp để giám định bệnh vàng greening cam Đài Loan Ở hình 4.6.A, 4.6.B, 4.6.C 4.6.D xuất băng sản phẩm PCR có kích thước 226 bp dự kiến Điều chứng tỏ mẫu thu thập cam Sành, quýt Ngọt, chanh Thanh Yên, chanh Giấy cam Vinh nghi vấn bị nhiễm bệnh vàng greening Tuy chưa có đánh giá mức độ gây hại bệnh vàng greening có múi giám định, kết thu tiền đề để giám định bệnh greening trình sản xuất giống bệnh 45 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, đề tài đưa kết luận sau: Thu thập mẫu vật liệu đối tượng có múi cam, chanh, quýt địa điểm: Hà Giang, Hà Nội, Lạng Sơn, Thái Nguyên gồm: 13 mẫu cam Sành, 11 mẫu quýt Ngọt, mẫu chanh Thanh Yên, mẫu chanh Giấy, mẫu cam Vinh Đánh giá biểu bệnh greening đối tượng thông qua triệu chứng bên Kết tổng số 36 mẫu vật liệu thu có 33/36 mẫu có biểu bệnh greening, 3/36 mẫu biểu bệnh Đã tiến hành giải phẫu mô thực vật mẫu vật liệu thu thập Kết cho thấy xuất đám sợi có sai khác với mẫu mô khỏe mạnh Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR thu số kết sau: Trong 12 mẫu cam sành Hà Giang giám định, kết PCR cho thấy có 2/12 mẫu có biểu dương tính với bệnh greening (xuất băng có kích thước 226 bp) Tương tự, mẫu quýt Ngọt Bắc Sơn, chanh Thanh Yên Hà Nội, chanh giấy cam Vinh Thái Nguyên có số mẫu dương tính với bệnh greening 8/11 mẫu quýt Bắc Sơn, 5/5 mẫu chanh Thanh Yên, ½ mẫu chanh Giấy 5/5 mẫu cam Vinh 5.2 Kiến nghị Từ kết giám định bệnh greening có múi nghiên cứu đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục thu thập mẫu vật liệu đối tượng có múi địa phương khác 46 Tiếp tục phân tích PCR kỹ thuật sinh học phân tử khác để giám định bệnh vàng greening Tiến hành tinh sản phẩm PCR, đọc trình tự so sánh trình tự nucleotit thu mẫu nhiễm bệnh để định danh sác loài vi khuẩn gây bệnh vàng greening có múi Việt Nam Tiến hành hướng nghiên cứu để phòng trừ bệnh vàng greening phục vụ cho trình sản xuất giống bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng việt Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn (2014), Tổng diện tích ăn phân theo địa phương, Số liệu trồng trọt, http://www.mard.gov.vn Phạm Thị Chữ (1996) “Tuyển chọn, nhân giống bưởi Phúc Trạch suất cao, phẩm chất tốt phục vụ xuất nội tiêu”, Tạp chí Khoa học công nghệ quản lý kinh tế, tháng 6/1996, trang 228-229 Đường Hồng Dật (2003) Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, Nxb Lao động - xã hội Đỗ Đình Đức (1991), “Một số kết nghiên cứu tượng vân vàng cam quýt miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Bảo vệ Thực vật, số 6, Tr 10-13 Vũ Công Hậu (1996), Trồng ăn Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Trần Công Khánh (1981), Thực hành hình thái giải phẫu thực vật, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội Đinh Hải Lâm (2001) “Nghiên cứu tạo vật liệu bệnh bảo quản nguồn gene có múi in vitro số giống cam quýt địa phương nhập nội”, Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam Lê Mai Nhất (2014), “Nghiên cứu bệnh vàng greening hại ăn có múi số tỉnh phía bắc Việt Nam đề xuất biện pháp phòng chống”, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Nguyễn Thị Minh Phương (2007) Cây ăn đặc sản kỹ thuật trồng, Nxb nông nghiệp Hà Nội 10 Trần Thế Tục, Cao Anh Long, Hoàng Ngọc Thuận, Hoàng Thế Lư (1998), Giáo trình ăn quả, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 11 Quyền Đình Thi, Nông Văn Hai (2008) Công nghệ Sinh học tập 2: Những ký thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ 12 Hà Minh Trung CS (2006), “ Hoàn thiện công ghệ sản xuất có múi đặc sản (cam, quýt, bưởi) bệnh greening bệnh virus khác tỉnh phía bắc‟‟, Kỷ yếu hội nghị tổng kết khoa học công nghệ nông nghiệp 2001-2005, tr.190, Nxb Nông nghiệp 13 Hà Minh Trung, Ngô vĩnh viễn, Đỗ Thành Lâm (1995), “ Kết giám định kế hoạch phòng chống bệnh vàng cam quýt Đồng sông Cửu Long ” Tạp chí Nông nghiệp CNTP số 3, 1995, tr.95-97 14 Hà Minh Trung, Ngô Vĩnh Viễn, Vũ Đình Phú, Mai Thị Liên, Lê Mai Nhất, Nguyễn Bích Ngọc (2003), Bệnh greening nguyên nhân gây suy thoái vườn có múi giải pháp khắc phục, Kỷ yếu hội thảo khoa học quốc gia Bảo vệ Thực vật, Nxb Nông nghiệp, tr.1-12 15 Trung tâm làm vườn trồng trọt, Viện Bảo vệ Thực vật (2003), Hướng dẫn sử dụng dầu khoáng phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại ăn có múi Việt Nam, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 16 Đào Thanh Vân, Trần Như Ý, Nguyễn Thế Huấn (2000) Giáo trình ăn quả, Đại học Nông lâm Thái Nguyên 17 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi-Công nghệ sinh học chọn tạo giống Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội II Tiếng anh 18 Aubert.B, Garnier.M, Cassin.J.C, Bertin.Y (1988), Citrus greening disease survey in East and West African countries South of Sahara, Proceeding of 10th conference of IOCV, IOCV, Riverside 1988, 231 – 237 19 Aubert, B (ed) (1987), Regional Workshop on citrus greening Huanglongbin disease, Review and Abstract FAO-UNDP, China.Dec.6-12/1987 20 Bové.J.M, P Bonnet, M.Garnier and B Aubert (1980), Pennicilin and tetraciline treatment of greening disease affected citrus plants in the glasshouse and the bacterial nature of the procaryote associated with greening In proc th conf IOCV, IOCV, Riverside.tr.91-102 21 Bové.J.M, Garnier.M, Ahlawat.Y.S, Chakraborty.N.K, Varma.A (1993), Detection of the Asian strains of the greening BLO by DNA-DNA hybridisation in Indian orchard trees and Malaysian Diaphorina citri psyllids, Proceedings of 12th Conference IOCV, IOCV, Riverside 1993, 258-263 22 Bové.J.M, Garnier.M (1984), Citrus greening and psylla vectors of the disease in the Arabian peninsula In Proc.9th Conf IOCV, IOCV, Riverside Tr 109-114 23 Bové.J.M Nguyen Minh Chau, Ha Minh Trung, Bourdeaut.J and Garier.M (1996), “Huanglongbing (greening) in Viet Nam Detection of Liberobacter asiaticum by DNA-Hybridization with probe in 2.6 and PCR Ampification of 16S Ribosomal DNA”, Thirteenth IOCV Conference, 1996-Procaryotes and blight, 258-266 24 Brlansky.R.H and Rogers.M.E (2007), “ Citrus Huanglongbing: Understanding the Vector-Pothogen Interaction for Disease Mangament”, Citrus Research and Education Center, University of Florida-IFAS 25 FAOSTAT (2015), Agricultural data, available from: http://faostat3.fao.org 26 Garnier.M, Daniel.N and Bové.J.M (1984), An etiology of citrus greening diseases Ananals of Microbiology, tr.169-179 27 Hung.T.H, H.L Wu and H.J.Su (1999a), “Detection of fastidious bacteria causing citrus greening disease by nonradioactive DNA probes”, Ann Phytopathol Soc.Jpn.65:14-146 28 Hung.T.H, Wu.H.L and Su.H.J (1999b), “Development of a rapid method for the diagnosis of citrus greening disease usingthe polymerase chain reaction”, Journal of Phytopathology.147: 599-604 29 Hung.T.H, Hung.S.C, Chen.S.N, Hsu.M.H and Su.H.J (2004), “Detection by PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus of huanglongbin in vector psyllids: application to the study of vector-pathogen relationships”, Plant pathology.53:96-102 30 Huang.A.L (1987), Electronmicroscospical Studies on the Morpholohy and Population Dynamic of Fastidious Bacteria Causing Citrus Likubin, In H.J.Su (Advisor), ph.D Thesis NTU 148pp 31 Jagoueix.S, Bové.J.M, Garnier.M (1997), “Comparison of the 16S/23S Ribosomal Intergenic Regions of “ Candidatus Liberobacter asiaticum” and “Candidatus Liberobacter africanum”, the two species associated with citrus huanglongbing (greening) disease”, International Journal of Systematic Bacteriology.47:224-227 32 James C (2008) “Global status of commercialized biotech/ GM Crop‟‟, ISAAA Brief No, 37, International Service for the Acquisition of Agri- Biotech application, Ithaca, NY, USA 33 Kim.J.S, Sagaram.U.S, Burns.J.K, Li.J.L, and Wang.N (2008), “Response of SweetOrange (Citrus sinensis) to „Candidatus Liberibacter asiaticus‟ Infection: Microscopy and Microarray Analyses”, Phytopathology, 99:50-57 34 Presley.D (1993), “Diseases of fruit crops‟‟, Dept of primary Industries, Queensdland 35 Su.H.J (2008), Production and Cultivation of virus-free citrus sapling for citrus Rehabilitation in Taiwan, Asia-pacific Consortium on Agricultural Biotechnology, New Delhi and Asia-pacific Association of Agricultural Research Institutions, Bangkok.P51 36 Su.H.J, Ting-Hseng Hung and Mei Chen Tsai (1993), Detection of the fastidious bacteria causing The Asia citrus greening by DNA probes, In Proc 12th Conf.IOCV, Riverside(Abs), 466 37 Tanaka (1979), Edible plant collection, Tokyo, Japan 38 Tatineni.S, Sagaram.U.S, Gowda.S, Robertson.C.J, Dawson.W.O, Iwanami.T, Wang.N (2008), “In planta Distribution of „Candidatus Liberibacter asiaticus‟ as Revealed by Polymerase Chaine Reaction (PCR) and Real-Time PCR”, Phytophatology, 85:592-598 39 Ngo Vinh Vien, Nguyen Thi Bich Ngoc (2009), Cultivation and health management of pathogen free citrus seeding in Northern Viet Nam, International Training Workshop on health management of pathogen-free citrus Orchard, SOFRI, Tien Giang – Viet Nam, 16-20th November, 2009 40 Weiburg.W.G, Barns.S.M, Pelletier.D.A, Lane.D.J (1991), “16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study”, Journal of Bacteriology 173: 697-703 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ THU THẬP MẪU VẬT LIỆU VÀ GIÁM ĐỊNH BỆNH VÀNG LÁ GREENING A B C D Hình ảnh vƣờn thu mẫu A: Vườn cam Sành (huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang); B: Vườn quýt Ngọt (huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn); C: Cây cam Sành (tỉnh Hà Giang); D: Cây quýt Ngọt (huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn) [...]... đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện trên thế giới cũng như ở Việt Nam nhằm xác định các tác nhân gây bệnh greening và đưa ra các biện pháp quản lý dịch hại 2.4.1 Các nghiên cứu về phát hiện bệnh trên thế giới Cho đến nay, bệnh greening đã lan rộng trên 50 quốc gia trên thế giới và đe dọa nghiêm trọng đến nguồn gen cây có múi ở các nước châu Á Lin (1956) đã chứng minh bệnh có thể truyền... gây bệnh vàng lá greening bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 1.5 Ý nghĩa của đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học - Xác định được phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh vàng lá greening trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR Từ đó góp phần đưa ra các biện pháp phòng trừ kịp thời và có hiệu quả bệnh vàng lá greening - Kết quả nghiên cứu cung cấp tài liệu học tập và nghiên cứu cho các sinh viên, nhà khoa học trên. .. cũng là những bệnh hại nghiêm trọng trên ăn quả cây có múi (Hà Minh Trung, 2006) [12] 2.1.5.2 Một số côn trùng gây hại trên cây có múi Ngoài các bệnh hại chính, cây ăn quả có múi còn bị ảnh hưởng và tàn phá bởi một số loài côn trùng dưới đây: - Sâu vẽ bùa: Phát triển quanh năm và gây hại trên tất cả các loài cây có múi Sâu hại lá non, đọt non ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây, làm mất khả... vết bệnh màu vàng nhạt (Đỗ Đình Đức, 1991) [4] A B Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá greening trên cây có múi (Nguồn: Brlansky.R.H và Rogers.M.E, 2007) [24] 19 2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá greening Bệnh có thể được phát hiện và chẩn đoán dựa trên các dạng triệu chứng trên đồng ruộng, tuy nhiên các dạng triệu chứng này sẽ thay đổi theo từng đối tượng và giai đoạn khác nhau và có thể... tác được áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều ưu điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững (Đường Hồng Dật, 2003) [3] 7 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây có múi Cây có múi là cây ăn quả thân gỗ lâu năm, tán rộng, lá xanh quanh năm, cây trưởng thành có thân, tán lớn, hạt đơn phôi… - Rễ: Nhìn chung cây có múi có bộ rễ ăn nông, trên biểu bì của rễ non có nấm cộng... tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc Iodine có thể phản ứng với tinh bột trong lá cây bị nhiễm bệnh và tạo màu nhạt hoặc đen Su.H.J (2008) đã sử dụng phương pháp cây chỉ thị kết hợp với Công nghệ Sinh học để xác định các chủng gây bệnh hại trên cây có múi ở Đài Loan (Su.H.J, 2008) [35] Từ các mẫu bệnh được thu thập, vi khuẩn được làm sạch và sử dụng để lây nhiễm vào các giống cây có múi khác nhau... sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh vàng lá greening Phương pháp PCR đã được ứng dụng để chẩn đoán tác nhân gây bệnh vàng lá greeing đó là các vi khuẩn dòng châu Á Liberibacter asiticum Cặp mồi được thiết kế bắt cặp với một vùng nucleic acid đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh Acid nucleic từ mẫu bệnh (mẫu lá) được tách chiết và được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Kết quả khuếch... 3: Kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose và được soi dưới ánh sáng UV của máy soi gel Sản phẩm PCR đặc hiệu là xuất hiện một băng duy nhất có kích thước như mong muốn trong ống mẫu và không có trong mẫu đối chứng âm (mẫu không bổ sung DNA khuôn) (Quyền Đình Thi, 2008) [11] 2.4 Tình hình nghiên cứu về phát hiện bệnh greening trên cây có múi Kể từ khi được mô... cả nước Vùng Nam Trung Bộ có diện tích trồng cây cam, quýt cho thu hoạch thấp nên có sản lượng thấp nhất cả nước chỉ đạt 2,200 tấn Năng suất cam, quýt trung bình của cả nước năm 2009 đạt 117,3 tạ/ha 2.2 Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi 2.2.1 Lịch sử của bệnh Bệnh vàng lá greening là dịch hại nguy hiểm nhất trên cây có múi, bệnh do vi khuẩn Liberibacter asiaticus gây nên Bệnh làm giảm năng suất,... nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Di truyền Người ở Cetus ứng dụng ban đầu để khuếch đại DNA β-globulin và chẩn đoán trước sinh bệnh thiếu máu tế bào lưỡi liềm (Quyền Đình Thi, 2008) [11] Kể từ khi ra đời, kỹ thuật PCR đã làm nên một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử, khoa học hình sự và khoa học chẩn đoán bệnh di truyền ở con người Đặc biệt là ứng dụng trong phân tích DNA Kỹ thuật PCR có thể ứng dụng