Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh greening trên cây có múi

Em được thực tập tại phòng thí nghiệm Khoa CNSH – CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh greening trên cây có múi” để hoàn

LỘC TUẤN HOẠT

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoá học : 2011 – 2015

THÁI NGUYÊN - 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LỘC TUẤN HOẠT

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoá học : 2011 – 2015 Giảng viên : ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH-CNTP –Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN - 2015

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Em được thực tập tại phòng thí nghiệm Khoa CNSH – CNTP Trường Đại

học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát

hiện bệnh greening trên cây có múi” để hoàn thành khóa luận này ngoài sự nỗ lực

của bản thân em còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, cùng các thầy cô giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt 4 năm học

Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, cùng các thầy cô giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt 4 năm học vừa qua để em có thể hoàn thành khóa luận

Đặc biệt, em xin được bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Đình Lãm người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS Lã Văn Hiền đã dành rất nhiều thời gian quý báu trực tiếp hướng dẫn em thực hiện nghiên cứu đề tài

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu giúp em hoàn thành tốt khóa luận này

Do điều kiện và thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những thiếu sót Kính mong thầy cô giáo và các bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2015

Sinh Viên

Lộc Tuấn Hoạt

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Các loài cam, quýt có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất 5

Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các châu lục trên thế giới giai đoạn 2007 - 2009 13

Bảng 2.3: Diện tích, năng suất và sản lượng cam, quýt trên thế giới giai đoạn 2002 – 2009 14

Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt của nước ta giai đoạn 2002 – 2009 15

Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các vùng của nước ta năm 2009 15

Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát hiện tác nhân gây bệnh greening (Hung và cs, 1999b), (Hung và cs, 2004) [28], [29] 27

Bảng 3.2: Các trang thiết bị máy móc dùng trong thí nghiệm 28

Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu tại các địa phương 29

Bảng 3.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32

Bảng 4.1: Kết quả đánh giá mẫu cam sành huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang 34

Bảng 4.2: Kết quả đánh giá mẫu chanh, quýt và cam thu tại Hà Nội, Lạng Sơn, Thái Nguyên 35

Bảng 4.3: Kết quả so sánh sự biểu hiện bệnh qua triệu chứng bện ngoài và giải phẫu mô tế bào thực vật 38

Bảng 4.4: Kết quả giám định bệnh vàng lá greening ở cam, quýt và chanh 43

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Rầy chổng cánh Diaphorina citri 17

Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá greening trên cây có múi 18

Hình 4.1 Mẫu lá cây có múi thu thập để giám định bệnh vàng lá greening 33

Hình 4.2 Hình ảnh giải phẫu mô tế bào mẫu lá cam sành 36

Hình 4.3 Hình ảnh giải phẫu mô tế bào lá quýt ngọt 37

Hình 4.4 Hình ảnh giải phẫu mô tế bào lá có biểu hiện nghi nhiễm 37

Hình 4.5 Kết quả tách chiết DNA tổng số 40

Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR mẫu lá giám định bệnh greening 41

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BVTV : Bảo vệ Thực vật

CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTP : Nước khử ion không chứa Dnase và RNase EDTA : Ethylene diamine tetraacetate

FAO : Food and Agriculture Organization

NN&PTNT : Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic Acid

MỤC LỤC

Trang

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1 1 Đặt vấn đề 1

1.3 Yêu cầu nghiên cứu 2

1.4 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.5 Ý nghĩa của đề tài 3

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.5.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về cây có múi 4

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

2.1.2 Giá trị của cây có múi 5

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây có múi 7

2.1.4 Yêu cầu sinh thái của cây có múi 9

2.1.5 Một số sâu bệnh hại trên cây có múi 10

2.1.6 Tình hình sản xuất cây có múi 12

2.2 Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi 16

2.2.1 Lịch sử của bệnh 16

2.2.2 Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh 16

2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá greening 19

2.3 Cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh vàng lá greening 21

2.3.1 Nguyên lý và ứng dụng của kỹ thuật PCR 21

2.3.2 Các thành phần của phản ứng PCR 22

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của phản ứng PCR 22

2.3.4 Các bước thực hiện phản ứng PCR 22

2.4 Tình hình nghiên cứu về phát hiện bệnh greening trên cây có múi 23

2.4.1 Các nghiên cứu về phát hiện bệnh trên thế giới 23

2.4.2 Các nghiên cứu về phát hiện bệnh ở Việt Nam 25

Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 Vật liệu nghiên cứu 27

3.1.1 Vật liệu thực vật 27

3.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 27

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 28

3.2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

3.3 Nội dung nghiên cứu 29

3.4 Phương pháp nghiên cứu 29

3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu vật liệu 29

3.4.2 Phương pháp xác định sự biểu hiện của bệnh greening 30

3.4.4 Phương pháp sử lý số liệu 32

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả thu thập mẫu vật liệu 33

4.2 Kết quả xác định mức độ biểu hiện của bệnh 34

4.2.1 Kết quả xác định sự biểu hiện của bệnh thông qua các triệu chứng bên ngoài 34

4.2.2 Kết quả xác định sự biểu hiện của bệnh thông qua quan sát hình thái mô tế bào thực vật 36

4.3 Kết quả giám định bệnh vàng lá greening bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 39

4.3.1 Tách chiết DNA tổng số mẫu lá 39

4.3.2 Kết quả nhân đoạn gen 16s rDNA 40

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phần 1

MỞ ĐẦU

1 1 Đặt vấn đề

Cây có múi (cam, chanh,quýt, bưởi ), thuộc họ Rutaceae, là loại cây ăn quả

được trồng phổ biến trên thế giới và Việt Nam Cây có múi là loại cây trồng mang lại giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế cao Trong 100g thịt quả tươi có chứa 6 - 12% đường, vitamin C từ 40 - 90 mg, acid hữu cơ từ 0,4 - 1,2%, các chất khoáng và dầu thơm (Đường Hồng Dật, 2003) [3] Sản phẩm của cây có múi được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như làm thực phẩm sử dụng hàng ngày, làm mứt, nước giải khát Tinh dầu được cất từ vỏ quả, lá, hoa được dùng nhiều trong công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm Vỏ quả có thể dùng làm thuốc, hương liệu (Đường Hồng Dật, 2003) [3] Ngoài ra, việc trồng cây ăn quả có múi còn mang lại nguồn thu nhập lớn cho những người làm vườn Theo ước tính, năng suất trung bình của cây cam, quýt đạt từ 15 – 20 tấn/ha, các sản phẩm của cây có múi như quả cam, quýt được bán trên thị trường với giá dao động khoảng 15.000 – 20.000 đồng/kg mang lại nguồn thu nhập từ 300 – 400 triệu đồng/ha/năm (Đương Hồng Dật, 2003) [3] Vì vậy sản xuất cây ăn quả có múi đang được chú trọng, đầu tư và phát triển mạnh mẽ

Trên thế giới, cây ăn quả có múi được trồng chủ yếu ở nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới Ở Việt Nam cây có múi được trồng ở ba miền Bắc, Trung và Nam Năm 2011, diện tích cây ăn quả có múi ở Việt Nam đạt 124,057 ha, trong đó diện tích trồng cam quýt chiếm tới 70,300 ha, bưởi 45,000 ha

và chanh là 18,000 ha (Bộ NN&PTNT) [1] Song sự đa dạng khí hậu ở các vùng trồng trọt là điều kiện thích hợp cho nhiều loài sâu bệnh phát sinh gây hại trên cây

có múi, là nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng quả (Lê Mai Nhất, 2014) [8] Một số bệnh điển hình ở cây có múi như: Bệnh Tristeza, bệnh vàng lá thối rễ, ghẻ nhám Trong đó bệnh vàng lá gân xanh (bệnh greening) gây hại trên hầu hết các cây ăn quả có múi Bệnh do 2 dòng vi khuẩn Gram âm gây ra

Dòng châu á có tên là Candidatus liberibacter asiaticus, dòng châu phi có tên là

Candidatus liberibacter africanus Các dòng vi khuẩn này sống trong mạch libe của

cây và lây truyền từ cây này sang cây khác thông qua các mắt ghép và môi giới

truyền bệnh là rầy chổng cánh (Diaphorina citri) ở châu Á và rầy cam (Trioza

erytreae) ở châu Phi (Hung.T.H và cs, 2004) [29] Đặc điểm của bệnh greening là

có thời gian ủ bệnh dài, nên khó phát hiện bệnh ở giai đoạn đầu và thường hay nhầm lần với bệnh khác như khi cây bị thiếu kẽm (Zn) (Lê Mai Nhất, 2014) [8] Đến khi bệnh biểu hiện rõ ràng thì cây đã bị bệnh nặng và các biện pháp chữa trị gần như vô nghĩa, rất nhiều biện pháp đã được thực hiện nhưng vẫn không mang lại hiệu quả Vì vậy, việc phát hiện nhanh bệnh vàng lá greening trong giai đoạn đầu là

vô cùng quan trọng đối với việc phòng và điều trị bệnh

Ngày nay việc ứng dụng kỹ thuật Sinh học phân tử hiện đại cho phép chẩn đoán các bệnh trên cây có múi mang lại hiệu quả cao với nhiều ưu điểm như: độ nhạy cao, chính xác và mất ít thời gian Có thể kể đến một số phương pháp như: PCR, real-time PCR, các kỹ thuật lai phân tử (Quyền Đình Thi, 2008) [11] Kết quả thu được từ những nghiên cứu chẩn đoán bằng sinh học phân tử là cơ sở để sớm đưa ra những giải pháp phòng tránh Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu đó, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài : ‘‘Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh

greening trên cây có múi ’’

1.2 Mục đích nghiên cứu

Chẩn đoán được bệnh vàng lá greening trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR

1.3 Yêu cầu nghiên cứu

- Thu thập nguồn vật liệu trên một số đối tượng cây có múi như: Cam, chanh, bưởi, quýt

- Xác định sự biểu hiện của bệnh greening trên mẫu vật liệuthu thập được

- Giám định bệnh vàng lá greening trên cây có múi bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

1.4 Mục tiêu nghiên cứu

- Thu thập được các mẫu vật liệu trên một số đối tượng cây có múi như: Cam, chanh, quýt, bưởi ở các địa phương khác nhau

- Giải phẫu mô học mẫu lá cây có múi nghi nhiễm bệnh và mẫu lá lành bệnh

- Khuếch đại thành công đoạn DNA đích trong bộ gene của vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

1.5 Ý nghĩa của đề tài

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

- Xác định được phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh vàng lá greening trên cây có múi bằng kỹ thuật PCR Từ đó góp phần đưa ra các biện pháp phòng trừ kịp thời và có hiệu quả bệnh vàng lá greening

- Kết quả nghiên cứu cung cấp tài liệu học tập và nghiên cứu cho các sinh viên, nhà khoa học trên đối tượng cây có múi, góp phần duy trì, bảo tồn và phát triển bền vững ngành trồng cây ăn quả có múi ở Việt Nam

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn

- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục cho cho công tác sau này

- Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đại Học

1.5.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

Thông qua việc phát hiện nhanh bệnh greening trên cây có múi sẽ góp phần giúp cho những người sản xuất sớm đưa ra những biện pháp phòng tránh sớm, loại

bỏ những mầm bệnh cho vườn cây Qua đó sẽ giữ vững được năng suất và chất lượng cho sản phẩm, nâng cao giá trị kinh tế và ổn định kinh tế - xã hội

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây có múi

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

2.1.1.1 Nguồn gốc

Cây có múi có lịch sử trồng trọt lâu đời, phân bố rộng, nguồn gốc của cây ăn quả có múi khó có thể xác định một cách chính xác Tuy nhiên nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng cam quýt có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông

Nam châu Á Tanaka (1979) [37] đã cho rằng các giống thuộc chi citrus có xuất xứ

từ chân dãy núi Hymalaya phía đông Ấn Độ trải dài qua miền Nam Trung Quốc, Nhật Bản Hàn Ngạn Trực đời Tống trong “Quýt lục‟‟ đã ghi chép về phân loại và các giống ở Trung Quốc Điều này cũng khẳng định thêm về nguồn gốc của các

giống cam chanh (Citrus sinensis Osbeck) và các giống quýt ở Trung Quốc theo

đường ranh giới gấp khúc Tanaka (Trần Thế Tục, 1998) [10] Nhiều tác giả cho

rằng nguồn gốc quýt kinh (Citrus nobilis Lour) là ở miền Nam Việt Nam Thực tế ở

Việt Nam vùng nào cũng có trồng cam sành với nhiều vật liệu giống với các tên địa phương khác nhau mà không nơi nào trên thế giới có như: Cam sành Bố Hạ, cam sành Hàm Yên, cam sen Yên Bái, cam sen Đình Cả - Bắc Sơn, cam bù Hà Tĩnh (Trần Thế Tục, 1998) [10]

2.1.1.2 Phân loại

Cam quýt thuộc: Giới Plantae

Bộ Rutales

Họ Rutaceae Chi Citrus Được phân chia làm 130 giống (genera) nằm trong các họ phụ khác nhau

(Đào Thanh Vân, 2000) [16]

Hiện nay tồn tại hai hệ thống phân loại cam quýt được nhiều người áp dụng,

theo Tanaka (Nhật Bản) cam quýt gồm 160 – 162 loài (Specias) Tanaka đã quan

sát, ghi chép tỷ mỉ đặc điểm hình thái của các giống đã biến dị này và phân chúng thành một loài mới hoặc giống mới có tên khoa học được bắt đầu bằng tên giống hay tên loài đã phát sinh ra chúng và kết thúc bằng chữ “Horticulturre‟‟ Swingle

đã chia cam quýt ra làm 16 loài (Đường Hồng Dật, 2003) [3] Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn phải sử dụng hệ thống phân loại của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết tới từng giống Theo Tanaka có 10 nhóm quan

trọng nhất trong nhóm True Citrus group, đây là những loài được trồng phổ biến và

có ý nghĩa với con người, có thể được mô tả trong bảng sau (Đường Hồng Dật, 2003) [3]

Bảng 2.1: Các loài cam, quýt có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất

STT Tên loài Tên tiếng anh Tên tiếng việt

(Đường Hồng Dật, 2003) [3]

2.1.2 Giá trị của cây có múi

Sản phẩm của cây có múi là một trong những sản phẩm có giá trị được nhiều người ưa chuộng và được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới

- Giá trị dinh dưỡng: Quả cây có múi có nhiều chất dinh dưỡng nên giá trị sử dụng rất cao Trong 100g thịt quả có chứa 6 - 12% đường, chủ yếu là đường sacaroza Hàm lượng vitamin C trong quả khoảng 40 - 90 mg/100 tươi, 0,4 - 1,2% các acid hữu cơ, trong đó có nhiều loại acid có hoạt tính sinh học cao Trong quả còn có chứa các chất khoáng và dầu thơm (Đường Hồng Dật, 2003) [3]

- Giá trị công nghiệp và dược liệu: Vỏ quả có chứa tinh dầu Tinh dầu được cất từ vỏ, quả, lá, hoa được dùng trong công nghiệp thực phẩm và công nghiệp mỹ

phẩm Ở nhiều nước trên thế giới, người ta đã dùng các loại quả thuộc chi Citrus

làm thuốc chữa bệnh Ở thế kỷ XVI, các thầy thuốc Trung Quốc, Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da Ở Mỹ vào những năm 30 của thế kỷ XX, các thầy thuốc đã dùng các quả cam quýt kết hợp với insulin để chữa trị bệnh đái tháo đường Ở Nga bắt đầu từ thế kỷ XI, các loại quả cây có múi đã được sử dụng để phòng ngừa và chữa trị trong y học dân gian Ở nước ta, nhân dân đã dùng cây ăn quả có múi để phòng và chữa trị một số bệnh từ lâu (Đường Hồng Dật, 2003) [3]

- Giá trị kinh tế: Cây ăn quả có múi là một trong những loại cây lâu năm, nhanh cho thu hoạch Một số loài có thể cho thu hoạch quả ở năm thứ 2 sau khi trồng Ở nước ta, năng xuất trung bình của cam quýt ở thời kỳ 8 tuổi có thể đại tới

16 tấn/ha Cây cam quýt có thể sống và cho thu hoạch quả trong vòng 15 - 30 năm Trong trường hợp đất tốt, được chăm sóc đầy đủ và áp dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh cao, trong các điều kiện khí hậu thích hợp và không bị sâu bệnh gây hại nặng, tuổi thọ của cam quýt có thể kéo dài trên 50 năm (Đường Hồng Dật, 2003)[3]

- Giá trị sinh thái, môi trường: Cây có múi là cây ăn quả lâu năm được trồng trong các vườn cây của gia đình hộ nông dân hoặc trồng trên đồi tại các trang trại Trong quá trình sinh sống, các loại cam, quýt, bưởi tiết ra oxy trong không khí làm không khí trở nên trong lành, dịu mát Trong những chừng mực nhất định các chất bay hơi từ cây cam quýt có tác dụng diệt một số loài vi khuẩn làm cho không khí trở nên sạch hơn, môi trường sống của con người tốt hơn Cam quýt trồng trên các đồi đất, bên cạnh việc cho quả còn có tác dụng phủ xanh đất, giữ nước ngăn cản dòng chảy mạnh trên mặt đất sau các trận mưa lớn, do đó có ý nghĩa lớn trong việc làm giảm quá trình xói mòn, rửa trôi đất Ở vùng trung du và miền núi, cam quýt được trồng trong các vườn rừng, vườn đồi trong các hệ thống VAC và VACR là phương thức canh tác được áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều ưu điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững (Đường Hồng Dật, 2003) [3]

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây có múi

Cây có múi là cây ăn quả thân gỗ lâu năm, tán rộng, lá xanh quanh năm, cây trưởng thành có thân, tán lớn, hạt đơn phôi…

- Rễ: Nhìn chung cây có múi có bộ rễ ăn nông, trên biểu bì của rễ non có nấm cộng sinh Nấm có tác dụng tốt cho rễ như vai trò của lông hút với các cây trồng khác.Sự phân bố rễ của cây ăn quả có múi phụ thuộc vào đặc tính của giống, mực nước ngầm và chế độ canh tác, chăm bón nhưng nhìn chung rễ cam quýt ăn nông từ 0 - 30cm (Vũ Công Hậu, 1996) [5]

- Thân cành: Trong một năm cây ăn quả có múi có nhiều đợt cành

+ Cành xuân nảy mầm vào tháng 2, 3, 4

+ Cành hè nảy mầm vào tháng 6, 7, 8

+ Cành thu nảy mầm vào tháng 9, 10

+ Cành đông nảy mầm vào tháng 11, 12

Tuỳ từng giống, cây, điều kiện khí hậu và chăm sóc mà lượng cành và thời gian ra các đợt cành này có sự thay đổi, cành non có thể quang hợp được, trong các đợt cành thì cành xuân thường ra đều, tập trung vào cành ngắn, còn cành hè thường khoẻ, lá to, dài nhưng rải rác hơn, cành thu kém hơn cành hè và cành đông thì yếu Cành cây ăn quả có múi có ba loại: cành mẹ, cành dinh dưỡng và cành quả (Vũ Công Hậu, 1996) [5]

+ Cành mẹ: Sinh ra cành quả nó có thể là cành xuân, cành hè hoặc cành năm trước Qua theo dõi cho thấy tuỳ từng giống thường cành thu hoặc cành hè làm cành

mẹ thì số cành quả nhiều và tỷ lệ đậu quả cũng cao

+ Cành dinh dưỡng: Cành không ra hoa, quả, chỉ có lá xanh có nhiệm vụ chính là quang hợp, giữa cành mẹ và cành dinh dưỡng không có giới hạn rõ, năm nay là cành dinh duỡng, sang năm sau có thể là cành mẹ

+ Cành quả: Tuỳ giống cây ăn quả có múi mà cành quả có độ dài từ 3 –

25 cm, thông thường từ 3 - 9 cm Cành quả có lá thường đậu quả tốt hơn cành quả không có lá

- Lá: Là một chỉ tiêu để phân loại giữa các giống, tuổi thọ của lá thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu và điều kiện dinh dưỡng của cây Ở Việt Nam tuổi thọ trung bình của lá là 15-24 tháng, ở vùng Á nhiệt đới có thể dài hơn Tuỳ theo giống và tuỳ theo mùa, lá có thể giống nhau về hình dạng, độ lớn, màu sắc, mật độ khí khổng, mật độ túi tinh dầu Lá có quan hệ chặt chẽ với sản lượng, nhất là với trọng lượng quả (Đỗ Năng Vịnh, 2008) [17]

- Hoa: Hoa có công thức K5C5A(20-40)G(8-15) Hoa thường ra đồng thời với cành non và thường ra rộ Một cây cam có thể nở tới 60.000 hoa nhưng chỉ cần 1% đậu quả là có thể đạt sản lượng 100kg/cây Vì vậy hoa, quả non thường rụng nhiều, có giống yêu cầu thụ phấn cũng đậu quả như cam Navel Hoa cây có múi thuộc loại hoa đơn hay chùm, mọc từ nách lá, thường là hoa lưỡng tính Hầu hết các loại cây có múi đều tự thụ, tuy nhiên cũng có thể có loài thụ phấn chéo như một số loài quýt Sự thụ phấn chéo sẽ làm tăng năng suất nhưng trái sẽ có nhiều hạt (Đỗ Năng Vịnh, 2008) [17]

- Quả: Khi còn xanh chứa nhiều acid đến khi chín thì lượng acid giảm, hàm lượng đường và chất tan tăng lên Cấu tạo quả gồm hai phần vỏ quả và vỏ thịt (Vũ Công Hậu, 1996) [5]

+ Vỏ quả: Gồm vỏ ngoài và vỏ giữa

+ Thịt quả: Bộ phận chính của thịt quả là tép, mầu sắc của thịt quả phụ thuộc vào sắc tố vàng da đỏ Trong dịch nước quả còn có các hạt dầu thơm quyết định hương vị của quả

Quả có hai đợt rụng sinh lý:

+ Đợt 1: Sau khi ra hoa được khoảng 1 tháng (tháng 3-4) quả còn nhỏ khi rụng mang theo cả cuống

+ Đợt 2: Khi quả đạt đường kính 3 - 4cm (cuối tháng 4) quả rụng không mang theo cuống

- Hạt: Tuỳ theo giống mà có sự khác nhau về kích thước, số lượng màu sắc

và phôi hạt Các loại quả thuộc cây có múi phần lớn là hạt đa phôi, riêng cây bưởi là hạt đơn phôi (Vũ Công Hậu, 1996) [5]

2.1.4 Yêu cầu sinh thái của cây có múi

- Nhiệt độ: Phần lớn cây có múi sinh trưởng thích hợp nhất ở nhiệt độ 25 –

27oC, cam sinh trưởng ở nhiệt độ 23 – 29oC Một số loài có thể chịu được nhiệt độ

-5oC trong thời gian ngắn Những giống thích ứng với điều kiện nhiệt độ thấp thường

có phẩm vị ngon, hấp dẫn, mẫu mã đẹp Ở nhiệt độ 40oC với thời gian kéo dài nhiều ngày, cây ngừng sinh trưởng, lá rụng, cành bị khô héo.Tuy nhiên, có những loài chỉ

bị hại khi nhiệt độ lên tới 50 – 57oC (Đường Hồng Dật, 2003) [3]

- Ánh sáng: Cây có múi thích hợp với ánh sáng có cường độ 10.000 – 15.000 lux (tương ứng thời gian chiếu sáng 16 – 17h/ngày), cây có múi ưu ánh sáng tán xạ, không ưu ánh sáng trực xạ Các giống cây có múi khác nhau có yêu cầu khác nhau

về ánh sáng: Cam cần ánh sáng nhiều hơn quýt, quýt cần nhiều ánh sáng hơn chanh (Nguyễn Thị Minh Phương, 2007) [9]

- Nước: Ẩm độ không khí là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây có múi, khi ẩm độ không khí cao làm cây ít thoát hơi nước, ít tiêu hoa năng lượng cho quá trình hút nước Nếu độ ẩm quá cao sẽ tạo điều kiện cho bệnh hại phát triển Ẩm độ không khí phù hợp nhất vào khoảng 70 – 75% (Phạm Thị Chữ, 1996) [2]

Nước rất cần cho cây có múi đặc biệt là vào các giai đoạn ra chồi, ra hoa và quả đang đậu vào cuối tháng 2 đầu tháng 3 và giai đoạn phình quả đến khi quả chuẩn bị chín Lượng mưa thích hợp cho trồng cam quýt là từ 1000 – 2400 mm/năm, thích hợp nhất là 1200 mm (Phạm Thị Chữ, 1996) [2]

- Đất: Các yếu tố đất đai quan trọng khi lựa chọn đất trồng cây có múi đó là tầng sâu đất, đất dễ thoát nước, mực nước ngầm sâu hoặc ổn định Mực nước ngầm phải tối thiểu sâu 1,5m dưới mặt đất Độ pH thích hợp với sinh trưởng của cam quýt

từ 5,5 – 5,6 Đất quá chua sẽ có nhiều dinh dưỡng bị rửa trôi, và cũng có thể gây ngộ độc một số nguyên tố như đồng (Cu) Đất quá kiềm làm cây thiếu hụt một số

nguyên tố nên có biểu hiện thiếu kẽm (Zn), sắt (Fe) Nhìn chung, đất phù hợp với trồng cây có múi là đất phù sa, phù sa cổ, đất bồi tụ, đất đỏ bazan, đất mùn đá vôi (Phạm Thị Chữ, 1996) [2]

- Dinh dưỡng: Để phát triển tốt cây có múi cần cung cấp đầy đủ và cân đối các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng N, P, K cũng như các nguyên tố khoáng vi lượng Cu, Mg, B

2.1.5 Một số sâu bệnh hại trên cây có múi

2.1.5.1 Một số bệnh hại chính

Ở cây có múi, người ta đã thống kê được khoảng 20 bệnh hại do virus và các sinh vật tương tự virus và hàng chục bệnh khác do nấm, vi khuẩn gây ra (Preslay.D, 1993) [34]

Bệnh cây có múi chia làm hai loại: Bệnh truyền nhiễm do vi trùng gây ra và bệnh không truyền nhiễm do các yếu tố vô sinh gây nên Tác nhân gây bệnh truyền nhiễm bao gồm vi khuẩn, nấm,virus và các thể tương tự virus, tuyến trùng Bệnh không truyền nhiễm do các điều kiện môi trường tự nhiên như hạn hán, mặn, úng, nguồn dinh dưỡng hoặc chế độ canh tác, sử dụng hóa chất không đúng cách gây nên Trong đó, virus và các tác nhân gây bệnh tương tự virus, vi khuẩn, nấm là nguyên nhân chủ yêu gây hại cho cây có múi Chúng có khả năng gây bệnh nặng nề

và khó chữa trị

- Bệnh Tristeza: Bệnh do virus gây ra, làm thiệt hại nghiêm trọng tới việc sản

xuất cam quýt trên thế giới Tác nhân gây bệnh là do virus Closterovirus, chủ yếu

gây hại trên mạch dẫn phloem nhưng người ta còn quan sát được sự hiện diện của chúng ở lớp vỏ của chồi non Chỉ riêng bệnh Tristeza đã phá hủy hơn 50 triệu cây

và tiếp tục đe dọa hơn 200 triệu cây khác trên toàn thế giới Bệnh gây lụi dần, lõm thân và vàng cây con (Đường Hồng Dật, 2003) [3] Nhân giống vô tính bằng mắt ghép nhiễm bệnh là nguyên nhân chính lan truyền bệnh, ngoài ra bệnh còn lây lan qua một vài loài rệp (Vũ Công Hậu, 1996) [5]

- Bệnh vàng lá greening: Bệnh vàng lá greening là bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất đến sản xuất cây có múi ở khu vực châu Á và châu Phi, đặc biệt

là ở Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan và bệnh đã được phát hiện trên tất cả các vùng và hầu hết các giống cam, quýt, bưởi ở nước ta Bệnh do một loài vi khuẩn kí sinh và sinh sản trong trong mạch dẫn gây ra hiện tượng vàng chồi với vector truyền

bệnh là rầy chổng cánh Châu Á Diaphorina citri Ngoài ra, nhân giống bằng mắt

ghép nhiễm bệnh cũng là con đường chủ yếu dẫn đến lan truyền bệnh vàng lá greening trên cây có múi (Nguyễn Thị Minh Phương, 2007) [9]

- Bệnh loét: Bệnh do một số chủng vi khuẩn gram âm Xanthomonas

campestris citri (Hasse) Dye gây ra Ở nước ta, bệnh loét rất phổ biến và gây hại ở

cam quýt, đặc biệt là bưởi Bệnh gay ra các vết loét trên lá, cành, quả lúc đầu vết loét hình tròn sau đó lan rộng Tác nhân truyền bệnh chính là do gió hoặc mưa, bệnh thường được truyền trong khoảng cách gần Phương thức truyền bệnh đi xa chủ yếu

do vận chuyển giống, mắt ghép, gốc ghép nhiễm bệnh từ vùng này sang vùng khác

- Bệnh nấm Phytophthora: Do các chủng nấm thuộc hai nhóm Phytophthora

parasitica Dast và Phytophthora citrophthora gây nên Bệnh gây hại nghiêm trọng

ở các vùng ẩm thấp, mưa nhiều, bệnh gây hại do gây thối gốc, thối rễ, chảy gôm (Đường Hồng Dật, 2003) [3]

- Bệnh đốm nâu: Bệnh do nấm Alternaria gây ra, là bệnh nghiêm trọng cả ở

cây và quả Lá bị bệnh chuyển dần sang màu đen, xoăn lại và rụng Chồi non bị đen

và tàn lụi, trên quả xuất hiện những đốm nâu Bệnh do nấm tồn tại trên cành già bị nhiễm bệnh do bào tử nấm phát tán nhờ vào gió và nước lây nhiễm vào lá non và quả (Đường Hồng Dật, 2003) [3]

- Bệnh mốc xanh: Bệnh gây hại trên quả, do nấm Penicillium italicim và nấm

P.digitalium gây ra Bệnh là vấn đề nghiêm trọng sau thu hoạch, trong quá trình bảo

quản và vận chuyển Trên quả xuất hiện những vết bệnh mọng, mềm và những vết bệnh phát triển nhanh thậm trí gây thối tới toàn bộ quả Bào tử nấm thường lơ lửng trong không khí và xâm nhiễm qua vết thương ở vỏ quả (Vũ Công Hậu, 1996) [5]

- Ngoài ra, một số bệnh khác như: Bệnh sẹo, bệnh than, bệnh đốm đen, muội, thối cuống cũng là những bệnh hại nghiêm trọng trên ăn quả cây có múi (Hà Minh Trung, 2006) [12]

2.1.5.2 Một số côn trùng gây hại trên cây có múi

Ngoài các bệnh hại chính, cây ăn quả có múi còn bị ảnh hưởng và tàn phá bởi một số loài côn trùng dưới đây:

- Sâu vẽ bùa: Phát triển quanh năm và gây hại trên tất cả các loài cây có múi Sâu hại lá non, đọt non ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây, làm mất khả năng quang hợp của lá

- Sâu nhớt: Sâu nhớt gây hại lá và quả non trong mùa xuân từ tháng 2 đến tháng 3

- Rầy chổng cánh: Rầy chổng cánh chích hút nhựa từ các cành lộc non, lá non của cây Là vector truyền bệnh vàng lá greening trên cây có múi

- Nhện đỏ, nhện trắng: Nhện gây hại chủ yếu trên lá và quả làm cho lá có màu xám bạc, mất khả năng quang hợp

- Bọ xít xanh: Thường gây hại trên quả, dùng vòi chích hút vào quả làm quả nổi u có điểm nâu, tép khô và quả rụng

- Ruồi vàng: Ruồi đẻ trứng vào vỏ quả, vào lớp cùi Sâu non nở ra chui vào tép hại quả Quả bị thối và rụng

- Nhóm sâu đục gốc, thân, cành: Gồm sâu đục gốc, sâu đục thân, sâu đục cành Trong đó, sâu đục cành gây hại nhiều nhất, đục vào cành tăm sau đó chui xuống cành cấp 2, 3 (Preslay.D, 1993) [34]

2.1.6 Tình hình sản xuất cây có múi

2.1.6.1 Tình hình sản xuất trên thế giới

Hiện nay, cây có múi là một trong những loại cây ăn quả chủ lực và được trồng tại nhiều nước và vùng lãnh thổ trên thế giới Theo thồng kê của FAO năm

2009 thì năm 2005 tình hình xuất nhập khẩu cam, quýt trên thế giới như sau : Nhập khẩu 37,13 nghìn tấn có giá trị 31.272,38 nghìn USD, xuất khẩu 63,71 nghìn tấn có giá trị 38.112,3 nghìn USD Như vậy, có thể thấy sản phẩm cam quýt có giá trị thương mại rất lớn trong nền kinh tế thế giới

Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các châu lục trên thế giới

(Nguồn : FASTAT/FAO Statistics – năm 2011) [25]

Năm 2007 diện tích cam, quýt của toàn thế giới là 8.753.484 ha, năng suất trung bình đạt 132.006 tạ/ha, sản lượng đạt 115.551.552 tấn Đến năm 2009 diện tích tăng lên 8.886.939 ha và sản lượng cao hơn đạt 122.368.732 tấn vì năng suất tăng lên đạt 137.695 tạ/ha

Châu Á có diện tích trồng cam quýt lớn nhất thế giới, kế tiếp tới châu Mỹ, châu Phi và châu Âu Châu đại dương là châu lục có diện tích trồng cam quýt nhỏ nhất (30.195 ha)

Bảng 2.3: Diện tích, năng suất và sản lƣợng cam, quýt trên thế giới giai đoạn 2002 – 2009 Năm Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lƣợng (tấn)

(Nguồn : FASTAT/FAO Statistics – năm 2011)[25]

Từ năm 2002 – 2009 diện tích trồng cam, quýt trên thế giới tăng thêm được 1.246.663 ha Sản lượng cam, quýt trên thế giới từ năm 2002 – 2009 có tăng lên nhưng

còn khá chậm, từ 107.490.468 tấn (năm 2002) lên 122.368.732 tấn (năm 2009)

2.1.6.2 Tình hình sản xuất ở Việt Nam

Ở nước ta, cam quýt có lịch sử trồng trọt lâu đời, cho đến nay đã chọn ra được nhiều giống có năng suất và chất lượng cao đem trồng ở hầu hết các vũng trên

Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt của nước ta giai đoạn 2002 – 2009

2009 (87,500 ha) Năng suất trung bình năm 2002 thấp nhất trong các năm chỉ đạt 87,85 tạ/ha và đạt năng suất đạt cao nhất năm 2009 (117,3 tạ/ha).Tổng sản lượng cam, quýt đạt cao nhất vào năm 2009 đạt 683,300 tấn do diện tích cho thu hoạch tăng lên

Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các vùng của nước ta năm 2009

Diện tích thu hoạch (nghìn ha)

Năng suất trung bình (tạ/ha)

Tổng sản lượng (Nghìn tấn)

Diện tích trồng cam, quýt cho thu hoạch và tổng sản lượng giữa các vùng ở nước ta không đồng đều Vùng có diện tích cây cam, quýt cho thu hoạch lớn nhất là Đồng bằng Sông Cửu Long (46,700 ha), thấp nhất là vùng Nam Trung Bộ với chỉ

800 ha diện tích cây trồng cho thu hoạch Tổng sản lượng cam, quýt năm 2009 đạt 683,300 tấn, riêng vùng Đồng bằng Sông Cửu Long chiếm 433,900 tấn trong tổng sản lượng cam, quýt do diện tích cho thu hoạch lớn, chiếm sản lượng lớn nhất trong

8 vùng của cả nước Vùng Nam Trung Bộ có diện tích trồng cây cam, quýt cho thu hoạch thấp nên có sản lượng thấp nhất cả nước chỉ đạt 2,200 tấn Năng suất cam, quýt trung bình của cả nước năm 2009 đạt 117,3 tạ/ha

2.2 Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi

2.2.1 Lịch sử của bệnh

Bệnh vàng lá greening là dịch hại nguy hiểm nhất trên cây có múi, bệnh do

vi khuẩn Liberibacter asiaticus gây nên Bệnh làm giảm năng suất, chất lượng, tuổi

thọ của cây và rất khó phòng trừ Bệnh được mô tả lần đầu tiên ở Trung Quốc năm

1929 với tên là Huanglongbing (Trung tâm làm vườn và trồng trọt, 2003) [15] Năm

1937 triệu chứng bệnh được phát hiện ở Nam Phi.Từ đó bệnh được báo cáo ở nhiều nơi với các tên gọi khác nhau như Likubin ở Đài Loan, Leaf mottling ở Philippine, Vein Phloem deneretion ở Indonesia TạiViệt Nam bệnh vàng lá greening được ghi nhận từ những năm 1960, từ đó đến nay đã sảy ra hai đợt cao điểm của bệnh vàng lá greening (Hà Minh Trung, 2006) [12]

+ Đợt thứ nhất vào các năm 1970 tại hầu hết các nông trường cam phía Bắc + Đợt thứ hai từ đầu thập kỷ 1990 tại các vùng trồng cam quýt quan trọng trong cả nước: Hà Giang, Tuyên Quang, Nghệ An, Đồng Tháp, Vĩnh Long Người sản xuất đa phần chưa hiểu biết những kỹ thuật trồng và thâm canh cây có múi, do

đó tạo ra những vườn cây kém chất lượng

2.2.2 Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh

2.2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh vàng lá greening do hai dòng vi khuẩn Liberibacter gây ra, dòng châu

Á có tên là Liberibecter asiaticum và dòng châu Phi có tên là Liberibacter

châu Phi là dòng ưu nhiệt, chịu được nhiệt từ 22 – 24oC (Hung.T.H và cs, 1999b) [28]

Bệnh greening lan truyền theo hai cách:

+ Do chiết ghép và nhân giống từ các cây bị bệnh

+ Lây truyền qua môi giới là rầy chổng cách Diaphorina citri ở châu Á và rầy Trioza erytrea ở châu Phi Rầy chổng cánh Diaphorina citri Là loại rầy có kích

thước dài 3,2 – 3,5 mm, toàn thân màu xám tro, hơi phớt xanh Mắt kép nhỏ, râu đầu có 9 đốt hai đốt cuối màu đen Đỉnh đầu có hai mảnh nhọn nhô ra phía trước như lưỡi kéo Cánh màu trong đục, có nhiều đốm nâu nhỏ

Rầy non và rầy trưởng thành chích hút dịch trên cây, lá non, lá bánh tẻ Thời gian phát triển của trứng từ 4 – 12 ngày, rầy non từ 10 – 35 ngày, rầy trưởng thành

vũ hóa sau 6 – 7 ngày thì đẻ trứng Rầy trưởng thành sống được từ 50 – 60 ngày Ở điều kiện miền Bắc nước ta rầy chổng cánh phát sinh 9 – 10 lứa trong một năm (Đường Hồng Dật, 2003) [3]

Hình 2.1 Rầy chổng cánh Diaphorina citri

A – Rầy trưởng thành; B – Trứng và rầy non

(Nguồn: Brlansky.R.H và Rogers.M.E, 2007) [24]

2.2.2.2 Triệu chứng của bệnh vàng lá greening

Bệnh rất phổ biến ở các vùng trồng cây có múi Cây bị bệnh thường lùn nhỏ, tán lá không đều, lá nhỏ, Lá bị biến vàng loang lổ hoặc phiến lá vàng, gân lá xanh Bệnh xuất hiện ban đầu trên các lá sau đó lan ra cành, cuối cùng toàn cây bị vàng lá (Đường Hồng Dật, 2003) [3]

Khi cây bị nhiễm bệnh vàng lá greening vi khuẩn không gây hại mạch gỗ nhưng gây các vết chết hoại trong mạch libe, sự vận chuyển đường đến các bộ phận của cây bị cản trở Lá nhỏ, tuổi thọ của lá bị rút ngắn, sự phân chia tế bào luôn xảy

ra khiến gân lá bị sưng Vi khuẩn cũng hiện diện nhiều ở cuống quả và làm quả bị lệch tâm, quả nhỏ, khối lượng quả giảm và hàm lượng đường trong quả thấp dẫn đến chất lượng của quả giảm (Aubert.B, 1987) [19] Rễ cây bị bệnh làm nghẽn mạch dẫn, rễ bị hoại tử nhiều, rễ tơ không hút được dinh dưỡng để nuôi cây Cây nhiễm bệnh bị rụng quả cùng với sự phát triển của bệnh, cây sẽ chết sau 2 – 5 năm tùy theo mức độ nhiễm (Aubert.B, 1988) [18]

Đỗ Đình Đức, (1991) đã chia triệu chứng bệnh làm bốn dạng:

- Dạng thứ nhất xuất hiện trên một vài lá, một vài cành hay một phần của tán cây, những cành khác vẫn xanh tốt bình thường, gân chính và gân phụ của lá xanh đậm, thịt lá giữa các gân vàng hay xanh lốm đốm, kích thước lá phát triển bình thường

- Dạng thứ hai bệnh biểu hiện trên toàn cây, gân và thịt lá vàng, lá uốn cong hình thìa, nhỏ và dày, cây lùn xơ xác, thân cây nơi tiếp hợp phình to, phần gỗ có nhiều gai nhỏ hay lỗ nhỏ, hoa nở sớm, dị hình, kéo dài, rễ tơ bị thối

- Dạng thứ ba bệnh chỉ biểu hiện trên giống cam Sông Con ghép trên gốc bưởi và đặc biệt là gốc cam Voi Quảng Bình

- Dạng triệu chứng thứ tư bệnh biểu hiện trên lộc xuân của giống cam Sông Con và Washington Navel, dọc theo gân chính thịt lá màu xanh thẫm hơn, rìa vết bệnh màu vàng nhạt (Đỗ Đình Đức, 1991) [4]

Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá greening trên cây có múi

(Nguồn: Brlansky.R.H và Rogers.M.E, 2007) [24]

2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá greening

Bệnh có thể được phát hiện và chẩn đoán dựa trên các dạng triệu chứng trên đồng ruộng, tuy nhiên các dạng triệu chứng này sẽ thay đổi theo từng đối tượng và giai đoạn khác nhau và có thể nhầm lẫn với một số bệnh thiếu dưỡng chất như thiếu Zn…Mặt khác sự biểu hiện của triệu chứng bệnh còn phụ thuộc vào số lượng vi khuẩn trong cây, khi số lượng vi khuẩn trong cây thấp thì cây vẫn không biểu hiện triệu chứng nên không thể phát hiện được (Lê Mai Nhất, 2014) [8]

Xác định tác nhân bằng kính hiển vi điện tử: Dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát được vi khuẩn có lông cứng, kích thước 350 – 550 × 600 – 1500 nm, vách

tế bào có hai lớp, độ dày từ 20 – 25 nm Hình dạng của vi khuẩn thường có hình gậy, thon dài và được thay đổi từ lúc tế bào non đến lúc thành thục (Huang.A.L, 1987) [30] Bằng phương pháp cắt lát siêu mỏng và soi dưới kính hiển vi điện tử, Jeong-Soon Kim và cs, (2009) đã nghiên cứu sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh greening và cho thấy phần mạch dẫn (phloem) tích tụ tinh bột dẫn đến thoái hóa mạch dẫn, lục lạp trong lá bị ảnh hưởng nghiêm trọng Dẫn đến lá bị bệnh thường không có khả năng quang hợp, hấp thu và vận chuyển dinh dưỡng theo mạch dẫn (Jeong-Soon Kim và cs, 2009) [33] Phương pháp này cũng được Lê Mai Nhất, (2014) sử dụng để giám định các tác nhân gây bệnh vàng lá greening tại một số địa phương phía Bắc Việt Nam và cho kết quả tương tự (Lê Mai Nhất, 2014) [8]

Cho đến năm 1992, kính hiển vi điện tử đã được sử dụng rộng rãi để xác định tác nhân gây bệnh Tuy nhiên, sử dụng kính hiển vi điện tử không thể phân biệt được các dòng vi khuẩn châu Á và châu Phi (Lê Mai Nhất, 2014) [8]

Xác định tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử là phương pháp đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu, trong đó PCR là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất trong công tác chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Hung và cs,

1999 [27] đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán bệnh vàng lá greening, sản phẩm thu được có kích thước 226 bp Phương pháp PCR cũng được sử dụng để phát

hiện Liberibacter asiaticum trong cơ thể rầy chổng cánh Diaphorina citri (Hung và

cs, 1999a) [27] Bằng kỹ thuật này năm 2004 người ta đã phát hiện được dòng vi

khuẩn châu Mỹ là Liberibacter americanum đã có mặt tại 46 điểm của bang Sao

Paulo - Brasil, và chỉ một năm sau đã lên tới 79 điểm Kết quả này cho thấy sự lan

truyền nhanh chóng của vi khuẩn gây bệnh thông qua rầy chổng cánh Diaphorina

Citri Kỹ thuật lai DNA là phương pháp cho độ chính xác cao với vi khuẩn Liberibacter asiticum đặc biệt là trong côn trùng môi giới (Hung và cs, 1999a) [27]

Việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR cho kết quả với độ chính xác cao, tuy nhiên phương pháp đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và chi phí tốn kém Vì vậy

mà ngày nay các nhà khoa học đã phát triển bộ Kit Iodine để chẩn đoán nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc Iodine có thể phản ứng với tinh bột trong lá cây

bị nhiễm bệnh và tạo màu nhạt hoặc đen

Su.H.J (2008) đã sử dụng phương pháp cây chỉ thị kết hợp với Công nghệ Sinh học để xác định các chủng gây bệnh hại trên cây có múi ở Đài Loan (Su.H.J, 2008) [35] Từ các mẫu bệnh được thu thập, vi khuẩn được làm sạch và sử dụng để lây nhiễm vào các giống cây có múi khác nhau được dùng để làm cây chỉ thị như quýt Ponkan, cam Liucheng, bưởi Wentan và chanh Eureka Cho đến nay đã xác định được bốn chủng vi khuẩn gậy bệnh khác nhau:

Chủng I: gây bệnh trên cam ngọt và quýt

Chủng II: có độ độc cao nên đã gây bệnh ở cả bốn giống cam, chanh, quýt, bưởi

Chủng III: chỉ gây hại ở mức trung bình nên chỉ biểu hiện ở cam ngọt, quýt

và biểu hiện nhẹ trên bưởi

Chủng IV: gây bệnh trên cam ngọt và quýt nhưng triệu chứng ẩn và phải sử dụng đến phương pháp PCR để phát hiện bệnh, tuy nhiên chủng này ít gặp trên đồng ruộng (Su.H.J, 2008) [35]

2.2.4 Một số biện pháp phòng tránh

Tạo giống cây sạch bệnh bằng vi ghép đỉnh sinh trưởng hoặc tạo cây giống

sạch bệnh bẳng phương pháp nuối cấy tế bào in vitro

Phun thuốc trừ sâu diệt rầy chổng cách khi cây ra đọt non từ 1 – 2 cm hoặc bất kỳ thời điểm nào phát hiện thấy rầy chổng cánh Một số thuốc có khả năng phòng trừ rầy hiệu quả là Bassa 50EC, Applaud 10 WP hoặc dầu D.C Tron Plus

Chặt bỏ các cây bị nhiễm bệnh và hủy bỏ hoàn toàn các vườn cây bị nặng Trồng cây chắn gió để ngăn chặn sự di chuyển của rầy chổng cánh và chăm sóc vườn thường xuyên

Chỉ nhân giống bằng các mắt ghép của cây mẹ sạch bệnh, tạo các nhà lưới bảo quản vườn cây mẹ và vườn ươm hoặc tạo vườn ở các khu cách ly (Đinh Hải Lâm, 2001) [7]

2.3 Cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh vàng lá greening

Phương pháp PCR đã được ứng dụng để chẩn đoán tác nhân gây bệnh vàng

lá greeing đó là các vi khuẩn dòng châu Á Liberibacter asiticum Cặp mồi được

thiết kế bắt cặp với một vùng nucleic acid đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh Acid nucleic từ mẫu bệnh (mẫu lá) được tách chiết và được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Kết quả khuếch đại sẽ được đánh giá bằng điện di trên gel agarose Sự có mặt của tác nhân gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm được đánh giá bằng sự có mặt hoặc không có mặt của sản phẩm PCR tương ứng

2.3.1 Nguyên lý và ứng dụng của kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp trong ống nghiệm để tổng hợp các trình tự DNA đặc hiệu bằng enzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotid lai với các sợi đối nhau ở vùng biên của DNA đích quan tâm Một chuỗi các chu kỳ lặp lại bao gồm biến tính khuôn, bắt cặp mồi và kéo dài các mồi đã bắt cặp nhờ enzym DNA polymerase, cho kết quả tích tụ lũy thừa một sản phẩm đặc hiệu Phương pháp này do Kary Mullis tìm ra năm 1984, được nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Di truyền Người ở Cetus ứng dụng ban đầu để khuếch đại DNA β-globulin và chẩn đoán trước sinh bệnh thiếu máu tế bào lưỡi liềm (Quyền Đình Thi, 2008) [11]

Kể từ khi ra đời, kỹ thuật PCR đã làm nên một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử, khoa học hình sự và khoa học chẩn đoán bệnh di truyền ở con người Đặc biệt là ứng dụng trong phân tích DNA Kỹ thuật PCR có thể ứng dụng trong phát hiện các nucleid acid đặc hiệu trong quá trình tái tổ hợp, chuyển gene, tạo đột biến mất gene, quá trình nhiễm virus, vi khuẩn và các bệnh di truyền Ngoài ra các

phương pháp PCR cũng có thể được sử dụng để khuếch đại các đoạn DNA để nhân dòng hay đọc trình tự mà không cần phải tinh sạch nucleic acid Với khả năng thu nhận số liệu ở pha phát triển lũy thừa, sức mạnh của phương pháp PCR này được

mở rộng trong nhiều ứng dụng, nhưng quy về hai ứng dụng chính là định lượng và định tính DNA (Quyền Đình Thi, 2008) [11]

2.3.2 Các thành phần của phản ứng PCR

Trong một hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần sau:

- Đệm PCR thường được pha chế dưới dạng dung dịch gốc10x bao gồm: 100

mM Tris-HCl, pH 8,3; 500 mM KCl; 1,5 mM MgCl2 và pha loãng 1x khi dùng

- 4 loại dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

- Enzyme DNA Taq polymerase

- Primer: Mồi xuôi và mồi ngược

- DNA khuôn, nước cất khử ion

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của phản ứng PCR

Trong phản ứng PCR các yếu tố quyết định tới sự thành công có thể chia thành 4 nhóm chính: Khuôn DNA (độ tinh sạch và nồng độ); Mồi (tính đặc hiệu, cấu trúc và nồng độ); Các thành phần khác (đệm, MgCl2, phụ gia, enzyme DNA

Taq polymerase, dNTP); Các chu trình phản ứng (nhiệt độ và thời gian) Ngoài ra,

việc chuẩn bị mẫu, hỗn hợp phản ứng, thao tác cũng có ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của phản ứng PCR

2.3.4 Các bước thực hiện phản ứng PCR

Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

Để thực hiện phản ứng PCR người ta pha chế một hỗn hợp chung bao gồm:

Nước cất khử ion, đệm PCR, dNTP, Taq DNA polymerase, primer trong một ống to

sau đó chia ra các ống nhỏ PCR và bổ sung DNA khuôn

Bước 2: Chạy phản ứng PCR

Phản ứng PCR được chạy với chu trình:

- 94oC trong 45 giây

- 60oC trong 45 giây