Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh Greening trên cây có múi (Khóa luận tốt nghiệp)

: Chính quy Chuyên ngành Khoa : CNSH - CNTP : 2011 2015 THÁI NGUYÊN - 2015 K : Chính quy Chuyên ngành Khoa : K43 - CNSH : CNSH - CNTP : 2011 2015 : ThS Khoa CNSH-CNTP THÁI NGUYÊN - 2015 i a khoa CNSH - CNTP, T c m Khoa CNSH CNTP : greening có múi m khoa CNSH - u hoa CNSH - CNTP, i ThS n ! Thái Nguyên, ngày 30 Sinh Viên ii Trang 2009 13 2009 14 2009 15 15 (Hung cs, 1999b), (Hung cs, 2004) [28], [29] .27 28 .29 : .32 B ng 4.1: K t qu u cam sành huy n Quang Bình, t nh Hà Giang .34 B ng 4.2: K t qu u chanh, quýt cam thu t i Hà N i, L Nguyên .35 B ng 4.3: K t qu so sánh s bi u hi n b nh qua tri u ch ng b n ngồi gi i ph u mơ t bào th c v t 38 B ng 4.4: K t qu nh b nh vàng greening cam, quýt chanh 43 iii Trang 17 .18 Hình 4.1 M u có múi thu th nh b nh vàng greening 33 Hình 4.2 Hình nh gi i ph u mô t bào m u cam sành .36 Hình 4.3 Hình nh gi i ph u mô t bào quýt ng t .37 Hình 4.4 Hình nh gi i ph u mơ t bào có bi u hi n nghi nhi m 37 Hình 4.5 K t qu tách chi t DNA t ng s .40 Hình 4.6 n di s n ph m PCR m nh b nh greening 41 iv BVTV Cs CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP a Dnase RNase EDTA : Ethylene diamine tetraacetate FAO : Food and Agriculture Organization NN&PTNT PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid v Trang : 1 .2 n .3 : .4 .4 .4 .5 .7 .10 12 .16 16 16 .19 greening 21 R 21 22 22 22 23 23 vi 25 27 : 27 27 27 28 28 28 29 29 29 30 3.4 32 Ph n 4: K T QU VÀ TH O LU N 33 4.1 K t qu thu th p m u v t li u 33 4.2 K t qu 4.2.1 K t qu nh m bi u hi n c a b nh .34 nh s bi u hi n c a b nh thơng qua tri u ch ng bên ngồi 34 4.2.2 K t qu nh s bi u hi n c a b nh thơng qua quan sát hình thái mơ t bào th c v t .36 4.3 K t qu nh b nh vàng greening b ng k thu t PCR v i c p m c hi u 39 4.3.1 Tách chi t DNA t ng s m u 39 4.3.2 K t qu n gen 16s rDNA 40 Ph n 5: K T LU N VÀ KI N NGH 45 5.1 K t lu n 45 5.2 Ki n ngh 45 1 Rutaceae - 12% - - 20 n 124, [3] Vì 300 chanh 18,000 2014) [8 v Dòng châu có tên Candidatus liberibacter asiaticus, dòng châu phi có tên Candidatus liberibacter africanus Diaphorina citri erytreae) hi (Hung.T.H cs, 2004) [29 Trioza reening ] Ngày v : PCR, real-time PCR , 2008) [11 1.2 có múi - - - - : Cam, chanh, 38 B ng 4.3: K t qu so sánh s bi u hi n b nh qua tri u ch ng b n gi i ph u mô t bào th c v t Gi ng Cam Sành Cam Sành Quýt Ng t Chanh Thanh Yên Chanh gi y Cam Vinh M u s 10 11 12 10 11 5 Tri u ch ng Bi u hi n mơ t bào Khơng có bi u hi n Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng l m Lá vàng, gân xanh Lá vàng c c b Lá vàng c c b Lá vàng l m Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng l m Lá vàng c c b Lá vàng l m Lá vàng l m Lá vàng c c b Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng l m Lá vàng gân xanh Lá vàng gân xanh Lá vàng gân xanh Lá vàng gân xanh Khơng có bi u hi n Lá nh , vàng l m Lá nh , vàng l m Lá nh , phi n h p Lá nh , phi n h p Lá nh , vàng l m Lá nh , vàng c c b Lá nh , phi n vàng, h p Lá vàng, gân xanh Lá nh , vàng l m Lá nh , vàng l m Lá nh , vàng l m Lá nh , vàng l m Khơng có bi u hi n Xu t hi T bào bi n d ng v hình thái T bào bi n d ng v hình thái Xu t hi Khơng có bi u hi n T bào bi n d ng v màu s c T bào bi n d ng v màu s c T bào bi n d ng T bào bi n d ng Xu t hi Khơng có bi u hi n T bào bi n d ng T bào bi n d ng Xu t hi T bào bi n d ng T bào ch ng chéo lên Xu t hi Không có bi u hi n T bào bi n d ng v hình thái T bào bi n d ng v hình thái Xu t hi Khơng có bi u hi n T bào bi n d ng v màu s c T bào bi n d ng, có l tr ng T bào bi n d ng, có l tr ng T bào bi n d ng v màu s c T bào bi n d ng v màu s c T bào bi n d ng v hình thái T bào bi n d ng, có l tr ng Khơng có bi u hi n T bào bi n d ng, có l tr ng Xu t hi T bào bi n d ng, có l tr ng T bào bi n d ng v hình thái K t qu (*) + + + + + + + + + + + + + + + + + + (*) + + + + + + + + + + + Chú thích: (+), Có tri u ch ng, bi u hi n mơ t bào;(-), có tri u ch ng, không bi u hi n mơ t bào i ch ng 39 Các thí nghi m cho th y s bi u hi n mô t bào bao g m bi u hi bào bi n d ng v hình thái, màu s c, xu t hi bào tr ng hay t bào n m ch n l n s bi n d ng c a t bào Khi ti n hành gi i ph u 33 m u v t li u có bi u hi n tri u ch ng b nh bên ngồi có 29 m u cho th y s bi u hi n b nh mô t bào (+), m u khơng có bi u hi n b nh mô t bào (-), b nh u cho th y s bi u hi n bên s bi u hi n b nh mô t bào khơng có s ng nh n hình m u Cam sành (m u 6, 12), quýt ng t (m u 6), cam vinh (m u 3) có bi u hi n tri u ch y s bi u hi n mô t bào M t khác m u có tri u ch ng b nh bên ngồi gi qu gi i ph u khơng gi sành s c l i, nhìn b ng ta th y u có bi u hi n bên vàng, gâ ph u xu t hi thái t n m u Cam t qu gi i m u s t bào bi n d ng v hình m u s 3, m u s cho k t qu gi i ph u gi ng v i m u s ch ng bên vàng l u m, s bi u hi n m u l T nh ng k t qu m t l n n a cho th y vi bi u hi n b nh thơng qua tri u ch ng bên ngồi gi i ph u mô t bào th c v t khơng có s ng nh tin c y cao greening, v y c n ti n hành nh ng bi n pháp nh b nh vàng nh b nh vàng greening cho k t qu K t qu gi i ph u c a nghiên c khu n, c v trí c th c a vi nh xác b nh, b c kh 4.3 K t qu ti nh rõ b ng ch nh c phân t nh b nh vàng greening b ng k thu t PCR v i c p m i c hi u 4.3.1 Tách chi t DNA t ng s m u Các m u v t li u thu th p t nghi c chuy n t i phòng thí ti n hành tách chi t DNA t ng s ph c v cho công vi t DNA t ng s c ti n hành d CTAB c a Saghai maroof, 1984 (Jame.C, 2008) [32] Có m t vài c i ti n nh 40 phù h p v trình bày u ki n nghiên c u c th K t qu tách chi t DNA t ng s c hình 4.3 Hình 4.5 K t qu tách chi t DNA t ng s A, Cam Sành (Hà Giang); B, Chanh Thanh Yên (Vi n B o v Th c v t Hà N i); C, Quýt Ng t (huy n B c S , t nh L D, Chanh Gi y Cam Vinh ( xã Quy t Th ng, TP Thái Nguyên, t nh Thái Nguyên) A, C D: Các ng ch y b Nguyên; B ng v i s m u thu t i Hà Giang, L ng ch ng v i m u s ng ch y 3,4; 5,6; 7,8; ng v i s m u 2,3,4,5 thu t i Vi n B o v Th c v t Hà N i DNA t ng s c a t t c m u tách chi hoàn toàn RNA N ph c DNA t ng s c ki m tra b c sóng 260 280 nm K t qu ch r ng, DNA t ng s n t ch ng th c hi n cho thí nghi m ti p theo 4.3.2 K t qu Ph n C pm is d n gen 16s rDNA nh b c ti n hành v i m c hi u c thi t k d a nghiên c u c a Hung cs (2004) [29] v i c s n ph m PCR 226 bp 41 Hình 4.6 n di s n ph m PCR m nh b nh greening A Cam sành (huy n Quang Bình, t nh Hà Giang) 2/12 m Quýt ng t (huy n B nh L 8/11 m ; B ; C Chanh Thanh Yên (Vi n B o V Th c V t, Hà N i) 5/5 m ; D Chanh Gi y cam vinh (xã Quy t Th ng, TP Thái Nguyên) 1/2 m u chanh gi y 5/5 m u Trong t t c i ch ng âm tính (2): M ng h p A, B, C, D gi ng (1) : M u i ch M : Thang chu n DNA 100 bp Hình 4.6.A, 4.6.B, 4.6.C 4.6.D B ng 4.4 cho th y vi nh b nh c th c hi n cam Sành, quýt Ng t, chanh Gi y chanh Thanh Yên ym u u xu t hi n k t qu k hình 4.6.A v i 12 m hi n m i b nh greening C th , nh có hai m u trí trùng v ng ch y s DNA nhi m b nh t Vi n B o v Th c v t Nam) v s có bi u hi 4.6 c kho ng 226 bp ng ch y xu t i ch m u Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t h ng t hai m u i b nh greening c s m u có bi u hi ng ch y v i hình 4.6.B, 4.6.C t 8/11 m u, 5/5 42 m u 6/7 m i v i hình 4.6.C có 5/5 (100%) m u chanh Thanh n hình 4.6.D có 5/5 (100%) m ng ch y s n 9) xu t hi c 226 bp, bên c nh m u chanh Gi y ½ m u b nhi m b nh greening ng ch y 4) y t ng s 33 m u thông qua vi c c cho có bi u hi n nghi nhi m b nh nh s bi u hi n c a b nh b ng tri u ch ng bên ngồi 29 m u gi i ph u mơ t bào th c v t (có bi u hi n mơ t bào) ch có 21 m u i 14 m u không nhi m b nh b nh b ng m ng gi i ph u mơ t bào th c v t có m s cao K thu t PCR ng d nh ng yêu c u s n xu t ng t nh b th n m hi n t n cho phép tr l i nhanh k t qu s n xu c a kh sai c thu t m d ch hàng hóa i v i b nh greening gi ng s n ph p vào Vi t Nam V i k thu t này, t nh n m u t i phòng nghi n cu i ch m t 4-5 gi ch thu t ngày ki nh s lây lan c a b nh gi c s d ng r ng rãi c xu n môi gi i truy n b nh 43 B ng 4.4: K t qu m ng, Quang Bình, Hà Giang Xã Yên Hà, Quang Bình, Hà Giang ng Ý, B c ng Vi n B o V Th c V t, Hà N i Xã Quy t Th ng TP Thái Nguyên Gi ng Cam Sành Cam Sành Quýt Ng t Chanh Thanh Yên Chanh gi y Cam Vinh nh b nh vàng greening M u s 10 11 12 10 11 5 ng ch y 10 11 12 13 14 10 11 12 13 7 cam, quýt chanh K t T l Tri u ch ng qu nhi m Khơng có bi u hi n Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh + Lá vàng l m + Lá vàng, gân xanh Lá vàng c c b 2/12 m u, (16,6%) Lá vàng c c b Lá vàng l m Lá vàng, gân xanh Lá vàng, gân xanh Lá vàng l m Lá vàng c c b + Lá vàng l m + Lá vàng l m Lá vàng c c b Lá vàng, gân xanh + Lá vàng, gân xanh 8/11 m u, + Lá vàng l m (72,7%) + Lá vàng gân xanh + Lá vàng gân xanh + Lá vàng gân xanh + Lá vàng gân xanh Khơng có bi u hi n + Lá nh , vàng l m + Lá nh , vàng l m 5/5 m u, + Lá nh , phi n h p (100%) + Lá nh , phi n h p + Lá nh , vàng l m Lá nh , vàng c c b ½ m u, + Lá nh , phi n vàng, h p (50%) + Lá vàng, gân xanh + Lá nh , vàng l m 5/5 + Lá nh , vàng l m m u(100%) + Lá nh , vàng l m + Lá nh , vàng l m Chú thích:(+), Cây nhi m b nh greening; (-), Cây không nhi m b nh greening 44 Các k t qu c a nghiên c c có s c a Hung cs (2004) [29] tác gi s d ng m v Loan c ng v i k t qu công b c hi u n 16s rDNA nh b nh vàng greening cam hình 4.6.A, 4.6.B, 4.6.C 4.6 ki u xu t hi n ph m PCR có u ch ng t m u thu th p cam Sành, quýt Ng t, chanh Thanh Yên, chanh Gi y cam Vinh nghi v nhi m b b ng m t qu gây h i c a c s ti n nh b nh greening c a trình s n xu t gi ng s ch b nh 45 Ph n K T LU N VÀ KI N NGH 5.1 K t lu n T nh ng k t qu nghiên c Thu th ng k t lu n sau: c m u v t li chanh, quýt t ng có múi cam, m: Hà Giang, Hà N i, L g m: 13 m u cam Sành, 11 m u quýt Ng t, m u chanh Thanh Yên, m u chanh Gi y, m u cam Vinh c s bi u hi n c a b ng thông qua tri u ch ng bên K t qu t ng s 36 m u v t li c có 33/36 m u có bi u hi n c a b nh greening, 3/36 m u bi u hi n c a b nh n hành gi i ph u mô th c v t m u v t li u thu th qu cho th y s xu t hi n c K t qu s k t qu i có s sai khác v i m u mô kh e m nh nh b nh vàng greening b ng k thu sau: Trong 12 m cm t nh, k t qu PCR cho th y có 2/12 m u có bi u hi i b nh greening (xu t hi , m u quýt Ng t N i, chanh gi y cam Vinh greening l c K t B Hà Thái Nguyên có s m t 8/11 m u quýt ng t B i b nh u chanh Thanh Yên, ½ m u chanh Gi y 5/5 m u cam Vinh 5.2 Ki n ngh T nh ng k t qu m t s ki n ngh nh b nh greening có múi nghiên c sau: Ti p t c thu th p m u v t li ng có múi t a 46 Ti p t c phân tích PCR k thu t sinh h c phân t giám nh b nh vàng greening Ti n hành tinh s ch s n ph m PCR c c a nh ng m u nhi m b gây b nh vàng greening có múi Ti c trình t so sánh trình t nh danh sác lồi vi khu n Vi t Nam ng nghiên c u m phòng tr b nh vàng greening ph c v cho trình s n xu t gi ng s ch b nh I T (2014), http://www.mard.gov.vn , , tháng 6/1996, trang 228-229 , Nxb Lao - -13 , Nam , Nxb Giáo 008) 2001-2005 , tr.95-97 tr.1-12 , - II T 18 Aubert.B, Garnier.M, Cassin.J.C, Bertin.Y (1988), Citrus greening disease survey in East and West African countries South of Sahara, Proceeding of 10th conference of IOCV, IOCV, Riverside 1988, 231 237 19 Aubert, B (ed) (1987), Regional Workshop on citrus greening Huanglongbin disease, Review and Abstract FAO-UNDP, China.Dec.6-12/1987 20 Bové.J.M, P Bonnet, M.Garnier and B Aubert (1980), Pennicilin and tetraciline treatment of greening disease affected citrus plants in the glasshouse and the bacterial nature of the procaryote associated with greening In proc th conf IOCV, IOCV, Riverside.tr.91-102 21 Bové.J.M, Garnier.M, Ahlawat.Y.S, Chakraborty.N.K, Varma.A (1993), Detection of the Asian strains of the greening BLO by DNA-DNA hybridisation in Indian orchard trees and Malaysian Diaphorina citri psyllids, Proceedings of 12th Conference IOCV, IOCV, Riverside 1993, 258-263 22 Bové.J.M, Garnier.M (1984), Citrus greening and psylla vectors of the disease in the Arabian peninsula In Proc.9th Conf IOCV, IOCV, Riverside Tr 109-114 23 Bové.J.M Nguyen Minh Chau, Ha Minh Trung, Bourdeaut.J and Garier.M asiaticum by DNA-Hybridization with probe in 2.6 and PCR Ampification of 16S Ribosomal DN Thirteenth IOCV Conference, 1996-Procaryotes and blight, 258-266 24 Brlansky.R.H and Rogers Citrus Research the Vectorand Education Center, University of Florida-IFAS 25 FAOSTAT (2015), Agricultural data, available from: http://faostat3.fao.org 26 Garnier.M, Daniel.N and Bové.J.M (1984), An etiology of citrus greening diseases Ananals of Microbiology, tr.169-179 27 Hung.T.H, H.L Wu and H.J.Su (1999a) Ann Phytopathol Soc.Jpn.65:14-146 28 Hung.T.H, Wu.H.L and Su.H.J the diagnosis of citrus greening disease usi Journal of Phytopathology.147: 599-604 29 Hung.T.H, Hung.S.C, Chen.S.N, Hsu.M.H and Su.H.J PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus of huanglongbin in vector psyllids: application to the study of vector-pathogen Plant pathology.53:96-102 30 Huang.A.L (1987), Electronmicroscospical Studies on the Morpholohy and Population Dynamic of Fastidious Bacteria Causing Citrus Likubin, In H.J.Su (Advisor), ph.D Thesis NTU 148pp huanglongbing (gre International Journal of Systematic Bacteriology.47:224-227 32 Brief No, 37, International Service for the Acquisition of Agri- Biotech application, Ithaca, NY, USA Phytopathology, 99:50-57 Dept of primary Industries, Queensdland 35 Su.H.J (2008), Production and Cultivation of virus-free citrus sapling for citrus Rehabilitation in Taiwan, Asia-pacific Consortium on Agricultural Biotechnology, New Delhi and Asia-pacific Association of Agricultural Research Institutions, Bangkok.P51 36 Su.H.J, Ting-Hseng Hung and Mei Chen Tsai (1993), Detection of the fastidious bacteria causing The Asia citrus greening by DNA probes, In Proc 12th Conf.IOCV, Riverside(Abs), 466 37 Tanaka (1979), Edible plant collection, Tokyo, Japan 38 Tatineni.S, Sagaram.U.S, Gowda.S, Robertson.C.J, Dawson.W.O, Iwanami.T, Real-Time Phytophatology, 85:592-598 39 Ngo Vinh Vien, Nguyen Thi Bich Ngoc (2009), Cultivation and health management of pathogen free citrus seeding in Northern Viet Nam, International Training Workshop on health management of pathogen-free citrus Orchard, SOFRI, Tien Giang Viet Nam, 16-20th November, 2009 Journal of Bacteriology 173: 697-703 PH L C M TS HÌNH NH V THU TH P M U V T LI NH B NH VÀNG LÁ GREENING A B C D Hình n thu m u n cam Sành (huy n Quang Bình, t nh Hà Giang); B A B , t nh L n quýt Ng t (huy n C: Cây cam Sành (t nh Hà Giang); D: Cây quýt Ng t (huy n B c nh L ) ... i có múi ] hà [5] - man - [5] - Nhi 27oC 29oC - 5o o 57oC [3] - Ánh sáng: Cây có múi 15.000 17h/ngày), có múi ây có múi (N ] - 2400 - 5, 10 - Preslay.D, 1993) [34] h gây Closterovirus òn lây... khơng khí xâm Alternaria Penicillium italicim 12 có múi (Hà Minh Trung, 2006) [12] - tháng vàng greening có múi -N -R o x (Preslay.D, 1993) [34] có múi 13 quýt - 2009 2007 2008 2009 1.626.988 1.635.580... Kumquat [3] múi - 90 mg/100 3) [3] 6 Citrus ( [3] - /ha Cây cam q - [3] oxy không khí làm khơng khí 2003) [3] 7 - - ) [5] - cây, ành hè C [5] 25 -9 - - vùng Á khí ] - 5C5A(20-40)G(8-15) i có múi ]