Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)

Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)

em trong su t quá trình nghiên c u, h c t tài.

Cu i cùng em xin chân thành c i thân, b

ng viên, em trong su t quá trình h c t p và nghiên c u

Em xin chân thành c !

Sinh viên th c hi n

Thúy Linh

LSD : Least Singnificant Difference Test

MS : Murashige & Skoog (1962)

NAA : 1- Napthalene acetic acid

M C L C

: 1

1

2

2

3

: 4

2 chung v 4

4

4

urophylla 5

6

6

9

2.3.3 9

11

11

11

12

13

14

urophylla 14 14

19

20

20

21

2.5 21

2.5.1 21

2.5.2 22

: 25

25

25

25

25

25

25

25

26

31

3.6 31

: 32

32

39

44 44

: 47

47

5.2 47

48

48

50

nhiên và có ngu n g c t châu Úc, chúng có th i m t ph

nh ng vùng cao (2000m so v i m t bi n) hay vùng khô c n (sa m c ho c

mi n Nam, B c Hi n nay b c tr ng ph bi n nhi

mi n núi c a Vi t Nam ( và cs, 2002) [5] Gi ng b

r ng, d tr ng trên nhi u lo a hình khác nhau, có kh u gió bão có

b ng thân th p, t a cành t nhiên t t, không l i

v t s o trên thân cây nên thu hút nhi i tr t s gi ng b ch

, 2003) [6]

gia khác c ta, b c tr ng sau 7- cho thu

ho ch g làm nguyên li u ch bi n b t gi B

khai thác làm g gia d ng, g xây d ng [14] Hi n nay,

c s n xu t cây gi ng b ng h t hay b ng công ngh

nhân gi , cây gi ng s n xu t ra không hoàn toàn s ch b nh, s n

n cây gi t c a cây sau này (Nguy n

1.4 c và th c ti n c tài

+ Giúp sinh viên c ng c và h th ng các l i ki n th c

+ Giúp sinh viên rèn luy n và h c t p kh u khoa h c

và phân tích s li u, cách trình bày m t bài báo khoa h c

PH N 2

T NG QUAN TÀI LI U 2.1 Gi i thi u chung v cây B

Phân h (subfamilia): Myrtoideae

Chi (genus): Eucalyptus

Loài (species) : Eucalyptus urophylla

(Hoàng Th S n, 2009) [13]

Cây g l n, cao 2- ng kính có th t i 100 cm Thân th ng, vlong m ng nh ,màu nâu vàng Tán hình tháp, phân cành th p Cành và lá non

t t t ho c trung bình cây phát tri n r t nhanh Tuy nhên do là loài cây

2.1.2.1 Thân

Thân cây cao to, th ng nhanh, có th c r t

l n, t a cành t nhiên t t V ng t n t i hai d ng v trên m t thân,

d ng v s n sùi, r , các cây non có v màu nâu khi già chuy n sang xám (Hoàng Th S n và cs, 2009) [13]

2.1.2.2 Lá

Có hai lo i lá: Trên cây non hay cành non: Lá m i, g

có cu ng, phi n lá hình tr ng ho c gi ng hình trái tim, s c l c, m ng, gi ng

- 15 cm, r ng 4 - 8 cm Trên cành cây già lá m c riêng bi t,

so le, hình li m, cu ng ng n, cong, phi n lá h p dài 16 - 25 cm, r ng 2 - 5 cm, cành già tròn, không c nh (Hoàng Th S n và cs, 2009) [13]

2.2 Giá tr kinh t cây cây b urophylla

B n ph m c a quá trình nghiên c u khoa h c ch n

ngu n gen, có kh ng, phát tri n t u ki n bình

t s cây g m lai, g m t, sao, d

d tiêu th i hi u qu kinh t nhanh Ngoài ra chúng còn có m t s

m khác: M t s ch bi n g s d ng g B c trang trí

g dùng ngoài tr i r t b n và t t, m t s i cành th ng, dài, không b m i m c dùng trong xây d ng, ngành công nghi p s n xu t gi , 2002) [5]

2.3 Khái quát v nuôi c y mô t bào th c v t

các t bào h p thành Các t u mang các thông tin di truy n có

trong t ng sau khi th tinh, và là nh c l p, t

xây d ng l i toàn b (Nguy c Thành, 2000) [18]

n th hai c a nuôi c y mô và t bào

th c v t khi White thành công trong vi c duy trì mô r cây cà chua trong môi

s phát sinh phôi và t o mô s o cây h cà (Dodd J H., Roberts L W, 1999)

cùng v c d a, 2,4- o mô s o thông qua phân chia t

bào nhi ng th c v t khó nuôi c y (Nguy n Kim Thanh, 2005) [19].

sung ch ph m ADN chi t t tinh d ch cá b vào

ng nuôi c y mô thân cây thu c lá Ông nh n th y ch ph m này có

c (Datura inoxia) Vi c t i thành công nhi u loài

th c v t thông qua nuôi c y bao ph n và h t ph góp r t l n cho các ngiên c u di truy n và lai t o gi ng và cs, 2008) [22]

c a k thu t nuôi c y protoplast, khi hai tác gi i Nh t B n là Nagata và

ong vi c làm cho protoplast thu c lá tái t c

ng s o thành công protoplast

c a cà chua v i protoplast c a khoai tây, m ra m t tri n v ng m i trong lai

xa th c v t và cs, 2008) [22]

2.3.2 Khái

Nuôi c y mô t bào th c v t (plan tissue culture) là k thu t mô,

b ph n ho c t bào c a th c v t vào trong m t h th ng vô trùng có th ki m

nuôi c y mô liên t c có th s n xu t hàng tri u cây con a, nuôi c y

t trong nh ng bi n pháp làm s ch b nh M c dù nuôi c y mô

h i k thu t ph c t p, giá thành cao, song v c nhi ng,

c bi t là ph i h p giâm hom, t o thành công ngh mô - c s

d ng khá ph bi n trong lâm nghi p , 2002)[5]

2.3.3

2.3.3.1.

hành nuôi c y các t bào th c v ch ng minh t

Haberlandt cho r ng m i t bào c a b t k sinh v u có

kh phát tri n thành m hoàn ch nh Ông nh n th y,

m i t bào c u phát sinh t h p bào thông qua quá trình

ch a toàn b thông tin di truy n c n thi t c a m t hoàn ch nh Khi g p

u ki n thu n l i nh nh, nh ng t s phát tri n thành m t hoàn ch nh

c nghi m tái sinh cây con t t bào lá, ch c tính toàn a tbào o ra công ngh sinh h c ng d ng trong nhân gi ng vô tính, t o gi ng cây tr ng và dòng ch ng ch u ( và cs, 2008) [22]

bào mô

:

thi t, u ki n thích h p, chúng có th tr v d ng t bào phôi sinh và phân chia m nh m Q i là ph n phân hóa t c l i v i s phân hóa t bào

Phân hóa t bào

T bào phôi sinh T bào dãn T bào chuyên hóa

Ph n phân hóa t bào

n phân hóa t bào

V b n ch t thì s phân hóa và ph n phân hóa là m t quá trình ho t

th , có m t s c ho t hóa (mà v c nay b c ch cho ta tính

tr ng m i, còn m t s gen khác l i b ho u này x y ra theo m c mã hóa trong c u trúc c a phân t ADN c a

c hài hòa M t khác, khi t bào n m trong m t kh i mô c

ng b c ch b i các t bào xung quanh Khi tách riêng t ng t bào

ho c gi c c a kh i mô s t u ki n cho s ho t hóa các gen

c a t bào (Nguy c Thành, 2000), [18]

2.4 n trong nuôi c y mô t bào th c v t

2.4

M c n này là t o ngu n m u s ph c v cho các

chúng thích ng v ng m ng th i gi m b t kh m

b nh c a m u nuôi c y và ch ng trong công tác nhân gi u

ki n c n thi t có th ng các bi n pháp tr hóa v t li u nhân gi ng ho c

th ph n nhân t o cho nh ng loài khó th ph u ki n t nhiên

n , th i gian kh trùng thích h p Theo nguyên t c thì l y b t k b

các ph n non (ch i nh, ch i bên) c a cây thì cho t l nuôi c y thành công

i l y mô các b ph ng thành khác (Bhat K M and H,

c s ch, r i ngâm trong dung d ch kh trùng n và th i gian thích

h làm s ch ngu n b nh Trong quá trình kh trùng m u ph m b o không làm n s c s ng c a m u c y Ti y m u vào môi

ng thích h p cho t ng lo i cây n này kéo dài 4 - 6 tu n ng

Ng c Hùng, 2009) [4]

Ngoài ra, khi l a ch n mô nuôi c y c n chú ý tu i sinh lý c a mô càng

b o các yêu c u: Mô nuôi c y có t l s ng cao, ít nhi m b nh, mô t n t i và

ng t t K t qu c n này ph thu c vào vi c l a ch n b

ph n nuôi c y, nên khi l y m u c m b o các nguyên t c nêu trên (

Th Mai và cs, 2010) [10]

2.4

s nhân gi ng cao Vì v y, có th

n then ch t c a toàn b quá trình nhân gi ng H s nhân nhanh giai

n này bi ng t 5 - 50 l n tùy thu c vào t ng nuôi

c y và u ki n ngo i c nh thích h p (Ngô Xuân Bình, 2010) [2]

nhân nhanh nh m kích thích t ho c c u trúc khác mà t

hoàn ch nh có th phát sinh Nh ng kh à:

+ Phát tri n ch i nách

+ T o phôi vô tính

+ T ng m i

cytokinin) là c c k quan tr s ng cây con t n

m b o s c s ng và b n ch t di truy n c a cây Theo nguyên t c chung thì

ng có nhi u Cytokinin s kích thích vi c t o ch i cho cây

n này bao g m quá trình kéo dài ch t c thích

h p và t o r , t c là quá trình t o cây hoàn ch nh ng lúc này không

c n b sung cytokinin mà có th ch b sung auxin N auxin t

nh d a trên t l t o r , s ng r và chi u dài r

Giai n ra r n t o cây hoàn ch thân, r và lá Giai

n này các ch t kích thích t o ch a ch c lo i b , thay

t kích thích ra r , do v y các ch c b

ng nuôi c y mô t o n này không c n sinh

ng v chi u cao mà ch c n t o r cho ch i nên nga ng,

ng t n cây t trong bình ra tr ng ngoài khay giá

th , yêu c u giá th ph m b c và s ch t cây trong nhà kính ho c nhà hu n luy n thêm m t th i gian n a

n quan tr ng bao g m công vi c hu n luy n cây in vitro thích nghi v u ki n khí h i: Nhi

chuy n t tr ng thái d ng sang tr ng thái t ng hoàn toàn Quá trình

sinh lý, gi i ph u, c a b Th i gian t i thi u cho s thích nghi là 2-3 tu n Trong th i gian này cây ph c b o v c nh ng y u

t b t l

+ M c nhanh làm cho cây b héo khô

+ Nhi m vi khu n và n m làm cho cây b héo khô

+ Cháy lá do n ng (Nguy c Thành, 2000) [18]

2.5 Các nhân t ng t i quá trình nhân gi ng b urophylla 2.5

Trong nuôi c y mô t ng nuôi c u ki n bên ngoài

c xem là v quy nh s thành b i c a quá trình nuôi c y Môi

t ng nuôi c c coi là ph m cung c p các ch ng c n thi t cho s ng và phân hóa mô trong su t quá trình nuôi c i

ng và m y mà s d ng các lo ng khác nhau

ng, ngu n cacbon, các acid amin và các ch

b sung thêm m t s ch t ph gia khác : Than ho c d tùy

t ng loài, gi ng, ngu n g c m ph n trên t mà

v l a ch n môi tr ng thích h ng, phát tri n t i u trong

t n c a h mô trong nuôi c y mô r t quan tr ng S ng, n ng

ng các lo i hóa ch t ph chính xác cao và phù h p cho

ng nuôi c y mô bao g m các thành ph

Dinh d c chia ra làm 2 lo i: Các nguyên t dinh

ng và nguyên t ng Trong t nhiên cây

tr ng mu ng và phát tri n m nh thì c n ph i l y t t các nguyên t sau (Nguy n Quang Th ch, 2009) [20]:

ng là chính Theo nguyên t c thành ph ng nuôi c y s c xây d ng trên thành ph n các nguyên t ng có m t trong mô Môi

ng nhân t o s d ng ph bi n nh c s d ng trong nuôi c y

mô, t bào th c v

c thi t l p d a trên nguyên t c này (Nguy n Quang Th ch, 2009) [20]

Mu i khoáng là thành ph n không th thi ng c y tbào th c v t, làm v t li u cho s t ng h p các ch t h

Các ion c a mu i khoáng hòa tan giúp nh áp su t th m th u c a

c d a ch a các h p ch t quan tr ng trong nuôi

c - inositol, các h p ch t có ch a ho t tính Auxin, các Gluxit

c a Cytokinin Vì v c d c s d kích thích phân hóa, nhân

c s d ng v i n 5 - 20% th ng, kích thích

800C thì ng c chuy n sang tr ng thái l ng còn 400C thì tr v

tr ng thái gel Kh c c a th ch khá cao: 6- c

Th ch d cho các ion v n chuy n d dàng (Nguy nHoàng L c, 2006) [7]

e) pH

pH c ng là m t y u t quan tr ng S nh c a pH môi

ng là y u t i ch t trong t bào pH c môi t ng

u ch nh gi a 5,5- c khi h p kh trùng pH < 5,5 làm agar khó chuy n sang tr ng thái gel còn pH > 6 agar có th r t c ng và

cs, 2008)[22]

Trong ng nuôi c y mô t bào th c v t, thành ph n ph gia quan

tr ng nh t quy nh k t qu nuôi c y là các ch u ti ng Chúng là các y u t u khi n s phát sinh hình thái, tái sinh cây hoàn ch nh c a mô

Các ch u ti ng là nh ng ch t có tác d ng kích thích sinh

ng và phát tri n c a th c v ng trong quá

ng và phát tri n c a th c v Phân chia, bi t hóa tngoài ra còn n quá trình bi t hóa mô và nhi u quá trình khác Các Phytohormon có th chia thành 5 nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberillin,

Ethylen và Abscisic acid Chúng là y u t quan tr ng nh ng quy n s thành công c a k t qu nuôi c y mô.

* Auxin

c chia thành 2 lo i: Auxin t nhiên và auxin t ng h p auxin t c tìm th y th c v t là indole - 3 - acetic acid (IAA) và auxin t ng h p là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxy acetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid (NAA) Ho t tính c a các ch u

d ng nuôi c ng sinh lý c a auxin là kích thích sinh

ng c a mô, ho t hóa s hình thành r hay hình thành callus N

c s d ng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin

ph bi n nh t vì có ho t Zeatin là m t lo i cytokinin có ho t tính m nh Trong nhi ng h i ta còn s d ng

nghiên c u Than ho ng ánh sáng, do môi

ng tr nên s m khi có nó vì th có s kích thích s hình thành và sinh

ng c a r Than ho t tính còn là m t trong nh ng ch t ch ng oxy hóa

Th i gian chi u sáng có vai trò quan tr ng trong quá trình phát tri n c a mô nuôi c y V các loài cây, th i gian chi u sáng thích h p là 8 - 12 gi /ngày

ánh sáng thích h p cho nuôi c y nhìn chung t 1000- 7000 lux

- ánh sáng: Là y u t quan tr n quá trình phát sinh hình thái c a mô nuôi c y v i nh ánh sáng khác nhau

- Lo i ánh sáng: Có th s d ng ánh sáng t nhiên cho nh ng lo i mô

t bào c ánh sáng th kích thích kéo dài ch i, thân

so v i ánh sáng tr ng

- Chính vì v y mà phòng thí nghi ng s d ng ngu ng ánh sáng c nh quang t trên các bình nuôi c y kho ng 20 - 25 cm

s cho ánh sáng tiêu chu n 2000 - 3000 lux

+ Nhi : Là nhân t có ng rõ r n s phân chia t bào và

i ch t c a mô nuôi c ng th i nó có n

( , 2008) [22]

2.4.3

Th c t cho th y các lo i t bào và các lo i mô khác nhau có m

nuôi c y thành công khác nhau M t nguyên t c trong nuôi c y mô t bào là

Nuôi c y in vitro là nuôi c u ki n vô trùng.N u không

m b u ki n vô trùng m u nuôi c ng ho c thao tác nuôi

kh trùng thích h p s mang l i hi u qu vô trùng m u t t, t l s ng cao

ng hay s d ng m t s hoá ch n 70o, Ca(OCl)2,

ng s : T ch i ng n và ch i nách

t o và nhân ch i trên môi ng MS/2, có b sung BA (0,2 mg/l) và IBA (0,16 mg/l) T ch i t o r ng MS/2, có b

nh m l n khi áp d ng vào th c ti T nhân

gi ng ch m, h s nhân th p do th i gian nuôi c y ch i dài, c m ch

m Lai thu n ngh ch và t bào ch t có nh

ng r t l lai, vì th có vai trò quan tr ng trong ch n gi ng cây

r ng (Gamborg O L, G C Phillips,1997) [26]

Darus H Ahmas thu c vi n nghiên c u lâm nghi

c y mô t bào cây B E pellita b ng MS có b sung 3%

n nhân ch i Nh ng ch i có

ng t t nh t cho t o r là IBA 1000 ppm v i t l ra r là 40% (O L Gamborg, G C Phillips, 1997) [26]

B E camaldulensis) thành công b ng nuôi c y ch i in vitro Môi

ng nuôi c c s d ng là WPM + 3% Sucrose + 0,5 % agar + 1

BAP + 2 trong quá trình nuôi c y duy trì 250C (± 40C), giai

n kh trùng m t o v t li u tác gi d ng mu i hypoclorite 4% và kh trùng trong th i gian 20 phút (sharma, J.K., 1994) [28]

2.5.2

50 loài b c kh o nghi m c ta t c

di n tích r ng v i khá nhi u xu t x cho ch n loài và xu t x sinh

ng nhanh ph c v tr ng r i trà

c ta nuôi c c áp d ng r ng rãi trong công tác nhân

gi ng m t s gi ng b p n i, các dòng vô tính b và keo

t cao Cùng v i k t qu v c i thi n gi ng Trung tâm nghiên

c u gi ng cây r u thành công k thu t nuôi c y mô t bào cho Keo lai, B ch t s cây r ng khác , 2003)[6]

Mai và cs (2000 hiên c u nuôi c y mô thành công cho

gi ng b 29C3 K t qu cho th y th i k m u b nhi m ít nh t và có

t l b t ch i cao nh t t tháng 5 - ng MS + 0,5mg BAP/l cho s

ch i trung bình trong c m ch i cao nh t (16,6 ch i/c ng ra rthích h ng MS + 1,0mg IBA/l cho t l 83,3% ( Mai và

cs, 2000) [9]

u nuôi c y mô thành công cho gi ng

b 29C3.K t qu cho th y th i gian x lý kh trùng t 6-8 phút cho

k t qu cao t l nhi m gi m h n ch còn 20-24%, t l b t ch t 38-60%

ng MS* b xung BAP n 0.5mg/l thích h p nh t cho B ch

ch i/c t trung bình 17 ch i/ c c bi t có th t i 30 ch i/ c m

ng ra r thích h ng MS* b sung IBA n1.5mg/l t l ra r t 97.3% ( 2002) [13]

thích h p cho B

t t ng B + 45% tr u hun + 10% phân chu ng hoai m c cho t l cây

cs,2000) [9]

Mai (2010 ng nuôi c y mô cho cây B ch

t kh trùng thích h p là ch t kháng sinh v i n4,5mg/l trong th i gian 25 phút, t l b t ch t 17,5% và PN3D là m u b t

ch t 17,5% HgCl2 n 0,5% trong kho ng th i gian là 12 phút Môi

ng là MS* + 0,5mg BAP /l + 0,3mg NAA /l + các ph gia khác (

Th Mai, 2010) [10]

Nga, thu c vi n nghiên c u cây nguyên li u gi y Phù Ninh

ng thích h p nhân nhanh là MS + 0,5mg BAP /l + 0,25 mg NAA /l

d n d ng MS, có b sung BAP (0,5 - 1 mg/l) và IBA

(0,1 - 0,5 mg/l), nhân nhanh c m ch ng MS, có b sung BA (1

- 2 mg/l), Kinetin (0,5 mg/l) và IBA (0,1-0,5mg/l) cho s ch i cao nh t 18

c m/ch i,t o r trên môi ng MS/2, có b sung ABT (0,5 -3mg/l), IBA (0,01 -0,05mg/l) và GA3(0,05 mg/l) và cs, 2002) [5]

Nguy n Ng c Tân và cs, 1997 ng nuôi c y mô cho

agar + 0,5 mg BAP /l + 0,25 mg NAA ng t o r (1/4 MS + 1,5 %

ng + 5g/l agar + 1mg IBA /l) (Nguy n Ng c Tân và cs, 1997) [16]

Nguy n Ng c Tân và Tr n H Quang thu c Vi n Khoa h c Lâm nghi p Vi t Nam nghiên c u nhân gi ng cây lai gi a b u và b ch

ng b y mô K t qu nghiên c u cho th y: vi c nhân ch i b t k t qu t ng MS có b sung 0,3-0,5

mg BAP /l và 0,2 mg Kinetin /l cho s ch i 16.9 ch i/c m ng ra rthích h p là 1/2 MS + 1 mg IBA /l (t l ra r t 80% sau 12 ngày) (Nguy n

Ng c Tân và cs, 1997) [15]