Nghiên cứu tái sinh cây Bò Khai (Erythropalum scandens) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)

Nghiên cứu tái sinh cây Bò Khai (Erythropalum scandens) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Bò Khai (Erythropalum scandens) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Bò Khai (Erythropalum scandens) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Bò Khai (Erythropalum scandens) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Bò Khai (Erythropalum scandens) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Bò Khai (Erythropalum scandens) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Bò Khai (Erythropalum scandens) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Khóa luận tốt nghiệp)

CÂY BÒ KHAI (ERYTHROPALUM SCANDENS)

u khoa h c c a b n thân tôi Các s li u và k t qu nghiên c u tra trên th a hoàn toàn trung th trên các tài li u N u có gì sai tôi xin ch u hoàn toàn trách nhi m!

Thái Nguyên, ngày tháng

XÁC NH N C A GIÁO VIÊN CH M PH N BI N

Giáo viên ch m ph n bi n xác nh n sinh viên

a ch a sai xót sau khi H ng ch m yêu c u!

(Ký, ghi rõ h tên)

L I C

Th c t p t t nghi p là ho ng giáo d c thù nh m góp ph n hình thành, phát tri n ph m ch c ngh nghi p c n thi t c a sinh viên theo m c tiêu

vào th c t công vi c giúp sinh viên nh n bi m m m y u c a mình

và c n trang b thêm nh ng ki n th c, k ng nhu c u công vi c

c s nh t chí c a B

nghiên c u tái sinh cây Bò Khai (Erythropalum scandens) b

nuôi c y mô t bào.

Tôi

-tôi

tôi trong s

tôi

u c g th c hi tài m t cách hoàn ch nh nh t Song

u làm quen v i công tác nghiên c u khoa h c, ti p c n v i th c t

n ch v ki n th c và kinh nghi m nên không th tránh kh i nh ng h n ch

và thi u sót nh nh mà b c Tôi r c s góp ý c a quý th y cô giáo và các b khóa lu n c hoàn ch

Thái Nguyên, ngày tháng

Sinh viên

2,4 D : 2,4 Diclorophenoxy acetic acid

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole butyric acid

BAP : Bezylamino purine

Kinetin : 6-Furfurylaminopurine

LSD : Least Singnificant Difference Test

MS : Murashige & Skoog (1962)

V/v : Th tích/th tích

Hình 4.1 ng c a th i gian kh trùng b ng dung d ch

n kh u Bò khai 26 Hình 4.2 nh h ng c a th i gian kh trùng viên kh trùng Johnson

n hi u qu kh trùng m u Bò khai .27 Hình 4.3 nh h ng c a th i gian kh trùng b ng HgCl2(0,1%)

n hi u qu kh trùng m u Bò khai .29 Hình 4.4 nh h ng c n kh i 32 Hình 4.5 nh h ng c n kh i Bò khai 35 Hình 4.6 nh h ng c a s k t h p gi n hi u qu

tái sinh ch i Bò khai 38 Hình 4.7 nh h ng c a s k t h p gi n hi u qu

tái sinh ch i Bò khai 41

PH N 1 M U 1

1 t v 1

1.2 M tài 2

1.3 Yêu c u c tài 2

c ti n c tài 2

c .2

c ti n .3

PH N 2 T NG QUAN TÀI LI U 4

2.1 Gi i thi u chung v cây Bò khai 4

m c a cây Bò khai 4

2.1.2 Ngu n g c và phân b 4

2.1.3 Phân lo i 5

2.1.4 Giá tr c a cây Bò khai 5

2.2 Tình hình nghiên c u cây Bò khai 7

2.3 Khái ni khoa h c c a nuôi c y mô t bào th c v t 10

2.3.1 Khái ni m 10

khoa h c c a nuôi c y mô t bào th c v t 10

2.4 M t s y u t n nuôi c y mô t bào th c v t 11

2.4.1 V t li u nuôi c y 11

u ki n nuôi c y 11

2.4.3.Vô trùng m u c y: 12

2.4.3 Thành ph ng nuôi c y 12

2.4.4 Môi ng v t lý 17

PH N 3 V T LI U, N U 19

3.1 V t li u, hóa ch t và thi t b nghiên c u 19

3.1.1 V t li u 19

3.1.2 Hóa ch t 19

3.1.3 Thi t b 19

m và th i gian nghiên c u 19

3.2.2 Th i gian nghiên c u 19

3.3 N i dung nghiên c u 19

u 19

3.4.1 N i dung 1: Nghiên c u ng c a m t s ch t kh trùng n kh ng vô trùng m u Bò khai 20

3.4.1 Nghiên c u ng c a th i gian kh trùng b ng dung d ch H 2 O 2 n kh u 20

3.4.2 Nghiên c u ng c a th i gian kh trùng viên kh trùng n hi u qu kh trùng m u c y 21

3.4.3 Nghiên c u ng c a th i gian kh 2(0,1%) .21

3.5 N i dung 2: Nghiên c u c a m t s ch ng n kh i Bò khai .22

3.5.1.Nghiên c u ng c n kh i .22

3.5.2.Nghiên c u ng c n kh i 22

3.5.3.Nghiên c u ng c a s k t h p gi a (kinetin ho c BAP) và n hi u qu tái sinh ch i 23

3.5.4.Nghiên c u nh h ng c a s k t h p gi a (kinetin ho c BAP) n hi u qu tái sinh ch i .23

3.6 X lý s li u 24

PH N 4 D KI N K T QU NGHIÊN C U 25

4.1 K t qu ng c a m t s ch t kh n kh vô trùng m u Bò khai 25

4.2 K t qu ng c a m t s ch n kh tái sinh ch i Bò Khai K t qu nghiên c c thu th p sau 60 ngày 30

PH N 5 K T LU N VÀ KI N NGH 42

5.1 K t lu n 42

5.2 Ki n ngh 42

PH N 1

1 t v

scandens ( , 2003) [13] Bò khai là lo i cây dây leo dài t 5-10m

Vi t Nam, Bò khai có h u h t các t nh vùng núi phía B c, nhi u nh t là

B c K n và c coi là m t trong nh ng lo c s n c a

T t L i trong 100g c a lá cây Bò khai có ch c;

2,6 mg carotene và 60 mg VitaminC Nhi u nghiên c ra tác d ng

c lí c a cây Bò khai dùng ch a viêm th ng ti t li u,

nguyên li u th c v t hoàn toàn s ch các vi sinh v ng dinh

ng nhân t u ki n vô trùng Nuôi c y mô gi c tính

tr ng t t c a b m , h s nhân gi ng nhanh trong th i gian ng n, cho ra các

cá th ng nh t v m t di truy n, có th nhân gi ng cây tr ng quy mô công nghi p (k c ng khó nhân b

ng), ch ng k ho ch s n xu t, t c cây s ch b nh ch t

ng t t, các cây sau nhân in vitro c tr hóa nên nâng cao

Châu, 1996) [3]

n hành nghiên c tài: nghiên c u tái

mô t bào nh m góp ph n hoàn thi n quy trình nhân nhanh cây Bò khai.

Quá trình nghiên c u s c m t s t góp ph n xây d ng

và hoàn thi n tái sinh gi ng Bò khai b t in vitro T

K t qu nghiên c u góp ph n phát tri n vi c nghiên c t nhân

gi ng in vitro c li u nói chung

c ti n.

T các k t qu nghiên c u b sung ngu n tài li u tham kh o ph c vcho các nghiên c u, gi ng d t tái sinh gi ng Bò khai có ch t

Góp ph n b o t n và nhân gi ng Bò khai, t o ra m t s ng cây gi ng

l u có ch ng cao cung c p cho s n xu t và th ng tiêu dùng

PH N 2

T NG QUAN TÀI LI U

2.1 Gi i thi u chung v cây Bò khai

m c a cây Bò khai

Bò khai là lo i cây có dây leo b ng tua cu n m c nách lá, dài

15-ng ch hai Thân dài t i 15m, màu xám và15-ng hay và15-ng nh t, già có màu tr ng m ng kính thân trung bình 2-3cm,

l n nh t 5-6cm Cành m m, trên v có nhi u v t bì kh ng màu nâu Lá

m c so le, hình tr ng r u nh n, dài 9-16cm, r ng 6-11cm, mép

m i di n v i cánh hoa Qu m ng hình trái xoan, dài 1,0-1,5cm, mang m t s o u, khi chín

có 1 h t hình tr ng bên trong Ra hoa tháng 4-6, mùa qu7-9, chín qu vào tháng 10 Qu có th t n t i trên n mùa

sau Cây d nhân gi ng b ng hom (Ph n, 2005) [7], (Nguy n

Ti n Bân, 1998) [1]

2.1.2 Ngu n g c và phân b

Cây Bò khai có ngu n g c nhi i châu Á, ph bi n Nam Trung

bi n các t nh phía b p các t nh mi n trung và Tây Nguyên, duyên h i nam Trung B T p trung nhi u nh t c bao g m

Nguyên, B c Giang Cây s ng cao t 100-1500m, m c hoang ven r ng

th sinh, r c h i, ch y u t p trung vùng (Tr n C

và cs, 2000) [4] (Nguy

2.1.3 Phân lo i

Bò khai tên khoa h c:Erythropalum scandens Blume

Loài : Escandens

Chi : Erythropalum Bò khai là loài duy nh t còn t n t c công

nh n thu c chi Erythropalum

H : D u Olacaceae,h Olacaceae g m 3- 4 chi và kho ng 40 loài

( , 2003) [13]

Ngoài ra, trong thành ph n hóa h c c a rau Bò khai có h p ch t d ng

m t trong nh ng h p ch t có tác d ng l i ti y có th th y vi i dân s d ng cây Bò khai làm thu c ch a b c ti u vàng và m t s r i

lo n liên quan t i ho t ng c a h gan th n ti t ni c khoa

h c và th c ti n

2.2 Tình hình nghiên c u cây Bò khai

u Phùng, Cây Bò khai có 2 l a qu u rahoa tháng 6, chín tháng 8, k t qu gieo th nghi m h t t l a qu này cho t

t qu nghiên c u c u Phùng, cây Bò khai trong

t nhiên có kh p là do qu c a lo i cây này khi chín có mùi

n m c là 36 ngày Các lo i cành giâm khác nhau (bánh t , trung bình,

t qu khác nhau, lo i cành trung bình và bánh t cho t l

hom Qua k t qu th nghi u cho th y IBA t ra khá hi u qu i v i

vi c kích thích ra r hom giâm cây Bò khai (Nguy n Chí Hi u,2009) [9]

Trung tâm gi ng cây tr ng, v t nuôi - S Nông nghi p & Phát tri n nông thôn t nh B c K n hành kh o nghi m giâm cành rau Bò

c t m t s k t qu kh quan

Theo Tr t cây Bò khai có th l giâm t g c lên h t

ph n bánh t cây m 3 tu i tr lên C t thân thành nhi n hom, m ihom dài 20 -25cm, to trên 3mm, có t 1-3 lóng g m 2-4 m t, c t b h t lá C t

sau 20-25 ngày hom ra r i và n y ch i t phía trên Tiêu chu n cây con xu n ph i cao 20-25 cm, r dài 5-6cm, có 5-6 c p lá trlên, cây ng t t Th i v tr ng là xuân ho c thu Ch n ngày râm mát

ít s d n 2008-2011 do Trung tâm Nghiên c u và phát tri n hthông nông nghi p ph i h p v i Vi n nghiên c u Rau qu Vi t nam và các t

làng vùng sâu Cao B ng, B c K t b o v , gìn gi

nh ng khu r ng có cây Bò khai phân b t nhiên M t s ch n r

c a mình Cây Bò khai có th tr ng b ng h t ho c b ng hom, cách th c mà

i dân ng s d ng nhân gi ng là c t dây Bò khai t r ng giâm tr ng tr c ti p xu t tro n nhà (Ph n, 2005) [7]

2.3.1 Khái ni m

Nuôi c y mô t bào th c v t là quá trình nuôi c y in vitro các nguyên li u

n r , v y c hay m u mô, cánh hoa có kích c phù h p

h t o thành mô hay cây hoàn ch nh ( Th Ng c Oanh, 2004) [17]

t o ra s ng cây l n trong th i gian ng n.Th c hi

thu u ki n t nhiên.T o ra cá th m i gi c tính c a cây ban

khoa h c c a nuôi c y mô t bào th c v t

a t bào th c v t

Gottlieb Haberlandt (1902) nhà th c v t h t n n

u tiên cho nuôi c y mô t bào th c v thuy t v

a t bào trong cu c nghi m v nuôi c y t bào

hoàn ch nh khi g u ki n thu n l i

2.3.2.2 S phân hóa t bào

c u trúc và ch

2.3.2.3 S ph n phân hóa t bào

S ph n phân hóa t c l i v i s phân hóa t bào, Các t t hóa trong các mô ch

chia, trong nh u ki n nh nh chúng có th quay l

các mô phân sinh và có kh t o ra các t bào m i (Hoàng Minh T n và cs, 1994) [20]

2.4.1 V t li u nuôi c y

V t li u nuôi c y là ngu n nguyên li u kh u cho nuôi c y mô t bào

th c v t

V t li u nuôi c y ng khá l n t i k t qu nuôi c y V nguyên

v u có kh t li u nuôi c y Tuy nhiên, th c t tùy t ng lo i tbào và các lo i mô khác nhau mà k t qu phát sinh hình thái khác nhau, v i

kh o ch i r hay mô s o ( n và cs, 2006) [19]

Vì v y vi c ch n m u c y cho phù h p ph vào: Tr ng thái sinh

lý hay tu i c a m u, m u non tr có s ph n ng v u ki n và môi

u ki n nuôi c y

u ki n vô trùng là yêu c u quan tr ng nh t quy n

s thành b i c a vi c nuôi c y Toàn b quá trình nuôi c y in vitro c m b o

u ki n vô trùng tuy i Vô trùng bao g m: Vô trùng phòng nuôi c y, vô trùng d ng c ng, vô trùng m u c y , 1993) [24].

xâm nh p trên b m t mô c y: HgCl2(0,1%), H2O2,(4,0%), Johnson (2,5ppm), c n 700(Johan Rusydi Iskandar,Kotanegara, l995) [25]

ng hóa h c cung c p ch n c n thi t cho s

ng và phân hóa c a mô trong su t quá trình nuôi c y in vitro Thành

ph n c ng hóa h i theo loài cây, b ph n cây, m

- 3- (nitrat) và NH4+ (amoni) riêng

NO3 - 4

+

3 -

dùng là: Canxi nitrat (Ca(NO3)2.4H2O), Kali nitrat (KNO3), Natri Nitrat

cho s ng và phát tri n c a mô N u thi u Fe quá trình phân chia c a

t bào b r i ro n, thi u Bo mô nuôi c y phát tri n mô s o r

hi u su t tái sinh th ng c a các nguyên t ng và các nguyên

t ng ph thu c vào t ng nuôi c y và t ng nuôi

2.4.3.3 Vitamin

Theo Czocowoki (1952) thì mô t bào th c v t khi nuôi c y in vitro v n

Vì v y ph i b sung các vitamin c n thi ng nuôi c góp

ph n t o các enzyme xúc tác các ph n ng sinh hóa trong t bào Các vitamin

c s d (thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Axit panthotenic), B5 (axit nicotinic), B6 (piridoxin) v i n ph bi n là 1mg/l Myo c s d ng vì nó có vai trò quan tr ng trong sinh t ng h p thành t bào th c v t

Các ch t ph gia h

d ch chi t n m men Trong thành ph n c c d a ch a các axit amin, axit

h ng, Myo inositol và các ch t có ho t tính Auxin, các Gluoxit

c a Cytokinin Ngoài ra, khoai tây và chu c s d ng, vì trong thành ph n c a chúng có ch a m t s vitamin và các kích thích t có tác d ng tích c n s ng, phát tri n c a m u c y (Tugba Bayrak Ozbucak

thái r ng có tính axit cao, kh c c a agar

Các ch ng là thành ph n không th thi u trong môi

ng nuôi c y, có vai trò quan tr ng trong quá trình phát sinh hình thái

c s d ng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân

t o), IAA (auxin t nhiên) Ho t tính c a các ch c x p theo th

nhi và d phân h y trong quá trình h p kh n

n ng nuôi c y mô NAA và 2,4D không b bi n tính

nh n s phân chia t bào và hình thành callus (Nguy n Chí Hi u và cs 2009) [9] (Nguy

l i s hình thành ch i Cytokinin c m ng s hình thành ch i bên và c ch

c a cytokinin Ngoài ra, cytokinin còn làm ch m s già hóa (Nguy n Chí

Hi u và cs 2009) [9] (Nguy

ph bi n vì ho t tính m nh: Kinetin (ph i h p cùng auxin v i t l thích h p

cs 2009) [9]

- c tách chi t l u tiên t d ch ti t c a n m

b i các nhà khoa h c Nh t B n vào nh -1938 Gibberellin

c t ng h nh, t n t i trong c h t non và qu

tri n Gibberellin có tác d ng chính trong vi c ho t hóa phân bào c a mô

kéo dài c a t bào,

t c c a ch i nuôi c y GA3 là lo c s d ng nhi u nh t (Nguy

ng bi ng t 12-18h/ngày ( n và cs, 2006) [19]

ánh sáng: Là y u t quan tr n quá trình phát sinh hình thái c a mô nuôi c y, v i nh ánh sáng khác nhau

Lo i ánh sáng: Có th s d ng ánh sáng t nhiên cho nh ng lo i mô

t bào c ánh sáng th kích thích kéo dài ch i, than

so v i ánh sáng tr ng (Hoàng Minh T n và cs, 1994) [20]

Do v y trong các phòng thí nghi m, s d ng ngu ng ánh

t cách trên các bình nuôi c y kho ng 20-25

1997) [23]

mTrong các bình nuôi c m t i luôn 100% nên không c n quan tâm nhi m nuôi c y (Hoàng Minh T n và cs,1994) [20]

- Phòng thí nhi m nuôi c y mô c a B môn Công Ngh T Bào c a

vi n Khoa h c S S ng thu i h c Nông lâm Thái Nguyên

- trí thí nghi m: Các công th c b trí theo ki u

ng u nhiên hoàn toàn v i 3 l n nh c l i, m i l n nh c l i là 20 m u

3.4.1 Nghiên c u ng c a th i gian kh trùng b ng dung d ch

3.4.2 Nghiên c u ng c a th i gian kh trùng viên kh trùng

K t qu : p s li u sau 20 ngày nuôi c y

Ch tiêu theo dõi

Sau khi th m 4 và 5 ta ch n công th c

t t (ký hi u là công th c CT*) trong 2 thí nghi ti n hành các thí nghi m ti p theo

3.5.3 Nghiên c u ng c a s k t h p gi a (kinetin ho c BAP) và

PH N 4

trùng m u Bò khai

Công tác vô trùng làm v t li u nuôi c y mô là m t khâu h t s c quan

tr ng quy nh s thành công c a c quy trình nhân gi ng vô tính i v i

b t k ng th c v t nào vi c l a ch n hóa ch t kh trùng, n và

th i gian kh trùng h t s c quan tr ng ng tr c ti p n hi u qu c a công tác vô trùng Trong nghiên c u này tôi d ng các lo i hóa ch t

H2O2 (4,0%), HgCl2 (0,1%) và viên kh trùng johnson (2,5ppm) khtrùng m u cây Bò khai K t qu nghiên c c thu th p sau 20 ngày và

T ng s

m u ban

u (ch i)

T l

m u

s ch (%)

T l

m u nhi m (%)

T l

m u

ch t do hóa ch t (%)

Hình 4.1 ng c a th i gian kh trùng b ng dung d ch

K t qu b ng 4.1 cho th y

V i giá tr LSD0,5 t 4,55 các công th c thí nghi m có s sai khác có ý

tin c y 95% Công th c 1 không s d ng hóa ch t kh trùng thì

th i gian kh trùng m u Bò khai t 5;10;15;20 phút T l m u s ch công

th c 2,3,4,5 l ng là: 18,33%; 31,67%; 53,33%; 45,00%

Khi nâng th i gian kh trùng m u Bò khai t n 20 phút thì t

b ng H2O2 (4,0 %) 20 phút thì t l m u s t 45,00% t l m u ch t 26,67% gi m t l m u s ch vì t l m u ch Do m u ngâm lâu trong dung d ch kh trùng, dung d ch kh trùng phá v các t bào gây nên hi n

ng ch t t bào d n m u ch t

vi khu n có trên m u Bò khai t l m u s t 18,33% ;31,56%

Công th c t t nh t trong thí nghi m là công th c 4 cho t l m u s ch

ch t không quá cao 18,33%

n hi u qu kh trùng m u c y Công

th c

Th i gian kh trùng (phút)

T ng s

m u ban u(ch i)

T l

m u

s ch (%)

T l

m u nhi m (%)

T l

m u

ch t do hóa ch t

T k t qu b ng 4.1.2 cho th y:

V i giá tr LSD0,5 t 3,22 các công th c thí nghi m có s sai khác có ý

tin c y 95% Công th i ch ng khi không s d ng viên khtrùng Johnson (2,5ppm) t l m u nhi m 100%

Khi kh trùng b ng viên kh trùng Johnson 5 phút cho t l m u

s ch t 10,00%, t l m u ch t 66,67% Do th i gian kh trùng quá ng n

làm ch t n m và vi sinh v t

T l m u s ch công th c 2,3,4,5 l ng là: 10,00%; 23,33%; 31,67%; 35,00% Khi nâng th i gian kh trùng m u Bò khai t 5 phút n 20 phút thì t l m u s n

Công th c t t nh t trong thí nghi m là công th c 5 cho t l m u s ch

t 35,00%, t l m u nhi m 28,33và t l m u ch t 36,67%

Khi kh trùng m u Bò khai b ng viên kh trùng Johnson (2,5ppm) k t

qu cho t l m u s ch th p t l m u nhi m và m u ch t do hóa ch t khá cao Viên kh trùng Johnson (2,5ppm) có ho t tính kh trùng không cao, vì v y

T ng s

m u ban

u (m u)

T l

m u

s ch (%)

T l

m u nhi m (%)

T l

m u

ch t do hóa ch t (%)