Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro (Khóa luận tốt nghiệp)

Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro (Khóa luận tốt nghiệp)

Thái Nguyên, 2015

L I C

c s nh t trí c a Ban giám hi ng, Ban ch nhi m Khoa Công ngh Sinh h c và Công ngh Th c ph m, Vi n khoa h c s s

(L.) Harms) ch ng cao b ng k thu t i Phòng thí nhi m nuôi c y mô c a B môn Công Ngh T Bào thu c Vi n Khoa h c S S ng thu i h c Nông Lâm Thái Nguyên

ch nhi m khoa và các th y cô B môn Công ngh T bào cùng các th y cô

Do th i gian th c hi tài có h tài không th tránh kh i

nh ng sai sót Em r t mong nh c s n c a th y cô và các

Em xin chân thành c

Sinh viên th c hi n

DANH M C CÁC B NG

Trang

th c v t 19

B ng 2.2 B n lo ng dùng 20

B ng 4.1 K t qu ng c a th i gian kh trùng b ng dung d ch H2O2 (5 n hi u qu vô trùng m u c y 31

B ng 4.2 K t qu ng c a th i gian kh trùng s d ng viên kh trùng n hi u qu kh trùng m u c y 33

B ng 4.3 K t qu ng c a th 2(0,1%) 34

34

B ng 4.4 K t qu ng c n hi u qu tái sinh ch i 36

B ng 4.5 K t qu ng c n hi u qu tái sinh ch i 38

B ng 4.6 K t qu ng c a s k t h p gi n hi u qu tái sinh ch i 40

B ng 4.7 K t qu ng c a s k t h p gi n hi u qu tái sinh ch i 42

DANH M C CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Bi th hi n k t qu ng c a th i gian kh trùng b ng dung d ch H2O2(5 n hi u qu vô trùng m u c y

n hi u qu tái sinh ch i 41

Công th i ch ng, Hình B: Công th c 4 42Hình 4.10 Bi th hi n k t qu ng c a s k t h p gi a BAP và

n hi u qu tái sinh ch i 43Hình 4.11 ng c n hi u qu tái sinh ch

Công th i ch ng, Hình B: Công th c 3 44

BAP : Best Absolute Perfect

IAA : Indole-3- lacetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

M C L C

Trang

PH N 1: 1

1.1 1

1.2 tài 2

1.3 tài 3

1.4 3

1.4.1 3

1.4.2 3

PH N 2: T NG QUAN TÀI LI U 4

2.1 Gi i thi u chung v 4

m th c v t h c c 4

2.1.2 Ngu n g c và phân b 4

2.1.3 Giá tr c 5

2.1.4 Saponin 7

2.2 Tình hình nghiên c c 10

2.3 Khái ni khoa h c c a nuôi c y mô t bào th c v t 10

c l ch s nuôi cây mô t bào th c v t 10

2.3.2 khái ni m v nuôi c y mô t bào th c v t 12

2.3.3 T m quan tr ng c a nuôi c y mô t bào th c v y 13

khoa h c c a nuôi c y mô t bào th c v t 14

2.4 M t s y u t n nuôi c y mô t bào th c v t 16

2.4.1 V t li u nuôi c y 16

u ki n nuôi c y 17

2.4.3 Thành ph ng nuôi c y 17

n chính trong nuôi c y mô t bào th c v t 23

PH N 3: N P NGHIÊN C U 25

3.1.V t li u, hóa ch t và thi t b nghiên c u 25

3.1.1 V t li u nghiên c u 25

3.1.2 Hóa Ch t 25

3.1.3.Thi t b 25

m và th i gian nghiên c u 25

m nghiên c u 25

3.2.2 Th i gian nghiên c u 25

3.3 N i dung nghiên c u 25

u 26

3.4.1 N i dung 1: Nghiên c u ng c a m t s ch t kh u qu vô trùng m 26

3.4.2 N i dung 2: Nghiên c u ng c a m t s ch u ti t sinh n hi u qu tái sinh ch g 28

3.5 X lý s li u 30

PH N 4: K T QU NGHIÊN C U 31

4.1 K t qu ng c a m t s ch t kh n hi u qu vô trùng m u 31

4.1.1 K t qu ng c a th i gian kh trùng b ng dung d ch H2O2 (5%) n hi u qu vô trùng m u 31

4.1.2 K t qu ng c a th i gian kh trùng s d ng viên kh trùng n hi u qu kh trùng m u c y 33

.1.3 K t qu ng c a th 2 (0,1%) 34

4.2 K t qu c a m t s ch n hi u qu tái sinh ch i 36

4.2.1 K t qu ng c n hi u qu tái sinh ch i 36

4.2.2 K t qu ng c n hi u qu tái sinh ch i 38

4.2.3 K t qu ng c a s k t h p gi n hi u qu tái

sinh ch i 40

4.2.4 K t qu ng c a s k t h p gi n hi u qu tái sinh ch i 42

PH N 5: K T LU N VÀ KI N NGH 45

5.1 K t lu n 45

5.2 Ki n ngh 45

O 46

I Tài li u ti ng Vi t 46

II Tài li u ti ng Anh 48

lá nh (Polyscias fruticosa (L.) Harms c dân gian s d ng r ng rãi

, 1999) [6]

(Nguy n Ng c Dung, 1998) [4] Cây

n,(Ph m Th T Liên và cs, 2007) [12]

20 acid amin và các lo i acid amin không thay th

tryptophan, cysteine (Ngô ng Long, 1985) [15] Nhi u nghiên c u cho th y

r c c có ch a nhi u ch t có tác d ng b i b s c kho và ch a

b nh c bi t, trong cây inh a các h p ch

trong nhân sâm ( , 2013) [20]

1964 cho th

s a, làm thu c ch a ki t l , thu t trong d p h i hè

c bi t c s c r

Hi n nay, công tác s n xu t gi ng ph n l inh c tr ng

s nhân gi ng th p, ch ng th p c yêu c u c a th

gi c s n xu t b ng công nghnguôi c y mô t bào cho h s nhân gi ng cao, s ch b u và gi a

c tính tr i t c a gi ng g c Vi c ng d

Nh c nhu c u th c ti n trên chúng tôi ti tài:

(Polyscias fruticosa (L.) Harms) ch t

ng cao b ng k thu t in vitro

1.3 c tài

nh ng c a m t s ch t kh n hi u qu vô trùng m ucây ng k thu t in vitro

hi u qu tái sinh ch i

1.4.

1.4.1

Quá trình nghiên c u s c m t s t góp ph n xây d ng

và hoàn thi n tái sinh gi ng b ng k thu t in vitro T

c ng c a m t s ch u ti n k thu t tái sinh

gi ng cây b ng k thu t in vitro.

K t qu nghiên c u góp ph n phát tri n vi c nghiên c u k thu t nhân

gi ng c li u nói chung và cây nói riêng

1.4.2

T các k t qu nghiên c u b sung ngu n tài li u tham kh o ph c vcho các nghiên c u, gi ng d y và k thu t tái sinh gi ng t

ng cao b ng k thu t in vitro

Góp ph n nhân gi ng cây o ra m t s ng cây gi ng l n,

PH N 2

T NG QUAN TÀI LI U 2.1 Gi i thi u chung v cây

d ng làm thu c ph bi n nh t là Polyscias fruticosa (L.) Harms

có tác d c lý gi ng Nhân sâm (Nguy n Ng c Dung, 1998) [4]

(lysin, methionin, trytophan, cystein) (Ngô ng Long, 1985) [15] Qua phân

thành ph n hóa h c trong lá, th y có saponin, coumarin, tinh d u, phytosterol, tanin, acid h ng kh và h p ch t uronic T r và lá

n aglycon và acid oleano

(Võ Duy Hu n, 1998) [28] Có 5 h p ch t polyacetilen trong r

c phân l , panaxydol và dyol là nh ng ch t có trong Nhân Sâm (Tr n Công Lu n, 1996) [18] và 2 polyacetilen ch y c phân l p t panaxynol, heptadecaien-dyin-duol (Tr n Công lu n và cs, 2000) [19]

heptadecaien-dyin-2.1.3 Giá tr c a cây

2.1.3.1 Giá tr ng

t t c các b ph , và u ch a saponin u

nh t là v r và lá Huy Bích và cs, 2004) [1]

còn ch a 20 acid amin và có các lo i acid amin không thay th

methionin, trytophan, cystein (Ngô ng Long, 1985) [15]

Trong r : Trong r a 5 h p ch t polyacetylen, bao

g m: Panaxydol, panoxydon, heptadeca 1,8 (E) dien 3,10 diol và 3 h p

ch t gi ng trong lá, các h p ch t này có tác d ng kháng khu n m nh và ch ng

Có tác d ng ch ng khu n t t trên vi khu

-b-D a vào c i ta chia Saponin thành 2 nhóm là saponin triterpen (Có 30 ch t c u t o b i 6 nhóm Hemiterpen) và saponon steroid có 27 ch t Trong

h ng ch a saponin triterpen (Tr n Công Lu n, 1996) [18]

Saponin là m t nhóm h p ch t th c p có vai trò quan tr ng trong th c

v t, saponin hi n di n c cây m t lá m m và cây hai lá m m Quá trình t ng

h p saponin trong th c v t ph thu c vào s di truy n, các lo i mô khác nhau,

tu i c a th c v t và các y u t ng xung quanh

2.2 Tình hình nghiên c u cây c

Theo (Nguy n Ng c Dung, 1998) [4] ti tài ng cây

(L.) Harms thô ng t o phôi soma

sung BAP 2,0 mg/l, sau 60 ngày t mô phân sinh t o thành ch i và ch i nách

Theo (Tr n Th Liên và cs, 2005) [13] ti n hành nghiên c u nhân nhanh

ng ngo i sinh, nh ng v t li u này có th phát hi n saponin b ng

s c ký l p m ng hay kh o b t

2.3 Khái ni khoa h c c a nuôi c y mô t bào th c v t

2.3.1 c l ch s nuôi cây mô t bào th c v t

ng thuy t t bào và nêu rõ: M sinh v t ph c t u g m nhi nh , các t bào h p thành Các t bào phân u mang các thông tin di truy n có trong các t ng sau th tinh, và

c Thành, 2000) [22]

m r ng b t kì m t t

n th hai c a nuôi c y mô và t bào

th c v t khi White thành công trong vi c duy trì mô r cây cà chua trong môi

o mô s o thông qua phân chia t bào nhi ng th c v t

t khó nuôi c y (Nguy n Kim Thanh, 2005) [21]

sung ch ph m ADN chi t t tinh d ch cá b vào

ng nuôi c y mô thân cây thu c lá Ông nh n th y ch ph m này có

c (Datura inoxia) Vi c t i thành công nhi u loài

th c v t thông qua nuôi c y bao ph n và h t ph óp r t l n cho các ngiên c u di truy n và lai t o gi và cs, 2009) [27]

c a k thu t nuôi c y protoplast, khi hai tác gi i Nh t B n là Nagata và

g vi c làm cho protoplast thu c lá tái t c

c a cà chua v i protoplast c a khoai tây, m ra m t tri n v ng m i trong lai

xa th c v và cs, 2009) [27]

2.3.2 khái ni m v nuôi c y mô t bào th c v t

Nuôi c y mô t bào th c v t là quá trình nuôi c y in vitro các nguyên

h c nuôi c y trong ng nghi m v u ki ng thích h t o thành mô hay cây hoàn ch nh ( và cs,2009) [27]

th t o ra s ng cây l n trong th i gian ng n; Th c hi

ph thu u ki n t nhiên; T o ra cá th m i gi c tính c a cây

u (Nguy n Ng c Dung, 1998) [4], (Ngô ng Long, 1985) [15]

2.3.3 T m quan tr ng c a nuôi c y mô t bào th c v y

Trong nhi u th p k qua, nuôi c y mô t bào th c v n

m nh m nhi u qu c gia trên th gi i Có th c n thi t trong nhi c nghiên c n và ng d ng c a nghành sinh h c

v t sinh s p nhi u l n t v n có trong t nhiên u này sgóp ph n t o ra hàng lo t các cá th m i gi nguyên các tính tr ng di truy n c a

m và rút ng n th t gi ng m i vào s n xu t v i quy mô

l n (Nguy n Hoàng L c, 2006) [15], và cs, 2008) [27]

Ngoài ra, d a vào k thu t nuôi c y, có th duy trì và b o qu c nhi u gi ng cây tr ng quý hi m, ho c lo i b các m m b nh c a nh ng loài sinh

v ng S d ng k thu t nuôi c y và dung h p t bào tr n có th t o ra

xu t th c v t ngoài t nhiên ra tri n v ng s d ng k thu nuôi

c y sinh kh i l n có kh ng h p nh ng ch t sinh h thu nh n các h p

ch p trên quy mô công nghi (Quách th liên, 2004) [14]

m c a nuôi c y mô t bào th c v u ki n in vitro d s n

xu t các h p ch t th c p:

Các t bào th c v t có th c nuôi c y u ki n nhân t o màkhông ph thu c vào th i ti a lý Không c n thi v n chuy n và b o

qu n m t s ng l n các nguyên li u thô

Có th ki m soát ch ng và hi u qu s n ph m b ng cách lo i b

nh ng tr ng i trong quá trình s n xu t th c v t, ng c a nguyên li u thô, s ng nh t gi a các lô s n xu t và s ng trong quá trình v n chuy n và b o qu n

k cao và có ti p hóa (Lê Tr n Bình, 1997) [3]

M không kém ph n quan tr ng c a nuôi c y mô t bào th c

v t là m ra nh ng m i trong nghiên c u sinh lý và di truy n th c v t

t ng h p các ch t, sinh lý phân t , di truy n - t bi n, sinh lý

cs, 2008) [27]

2.3.4 khoa h c c a nuôi c y mô t bào th c v t

hành nuôi c y các t bào th c v ch ng minh t

Haberlandt cho r ng m i t bào c a b t k sinh v u có

m i t bào c u phát sinh t h p bào thông qua quá trình

ch a toàn b thông tin di truy n c n thi t c a m hoàn ch nh Khi g p

u ki n thu n l i nh nh, nh ng t s phát tri n thành m t hoàn ch nh

Theo quan ni m c a sinh h c hi T t c m i t bào c a m t

ti ng h p nh ng ki u protein enzym gi ng h t nhau và n c

ng thích h p u có th phát tri n thành cây nguyên v n

2002) [22]

lu n c a nuôi c y mô t bào th c v

ch ng minh c kh tái t o c a m th c v t hoàn ch nh t m t

t bào riêng r (Nguy c Thành, 2002) [22]

2.3.4.2 S phân hóa và ph n phân hóa t bào

Theo (PGS.TS Nguy n Quang Th ch, 2015) [23 th c v t

ng thành là m t ch nh th th ng nh t bao g m nhi

khác nhau Tuy nhiên, t t c các lo i t u b t ngu n t m t t bào

u tiên (t bào h p t ) u, t bào h p t phân chia hình thành

t bào phôi sinh này chúng ti p t c bi i thành các

T bào phôi sinh -> T bào dãn -> T bào phân hóa có ch

bi t

chuyên hóa, chúng không hoàn toàn m t kh a mình Trong

ng h p c n thi t, u ki n thích h p, chúng l i có th tr v d ng t

bào phôi sinh và phân chia m nh m cho ra các t bào m i có kh

sinh thành cây hoàn ch nh Qúa trình này g i là quá trình ph n phân hóa t

c l i v i phân hóa t bào S phân hóa và ph c bi u

th b ng bi :

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi c y mô, t bào th c v t th c

ch t là k t qu c a quá trình phân hóa và ph n phân hóa K thu t nuôi c y

mô, t bào th c v n cùng là k thu u khi n s phát sinh hình thái

c a t bào th c v t m ng d a vào s phân hóa và ph n

c Thành, 2002) [22]

2.4 M t s y u t n nuôi c y mô t bào th c v t

2.4.1 V t li u nuôi c y

V t li u nuôi c y là ngu n nguyên li u kh u cho quá trình nhân

gi ng in vitro vi c l a ch n v t li u nuôi c y thích h p là c n thi t

i v t li u kh u cho nhân gi ng vô tính in vitro có th là

m b o vô trùng c khi ti n hành nuôi c y in vitro

v t li u thông d ng nh t hi n nay là s d ng các ch t hóa h c i v i các thí

trùng ph c v cho vi c nhân gi ng in vitro.

T bào phôi sinh

Phân hóa t bào

T bào giãn

Ph n phân hóa

T bào chuyên hóa

2.4.2 u ki n nuôi c y

u ki n nuôi c y n s phát sinh hình thái c a t bào và

mô trong quá trình nuôi c y in vitro , ánh sáng, nhi m là

u ki n có vai trò quan tr ng nh t (Nguy c Thành, 2002) [22]

Nhi : Là y u t quan tr ng n s phân chia t bào và

nh 25 - 280C, nhi còn ng t i ho ng c a Auxin (

V và cs, 2009) [27]

Ánh sáng: Các nghiên c u cho th y ánh sáng r t c n thi t cho s phát sinh hình thái m u nuôi c y Các lo i m u c y khác nhau có nhu c u v th i gian chi ánh sáng khác nhau Th i gian chi u sáng v

các loài cây thích h p là 12 - 18h/ngày ánh sáng thích h p cho nuôi c y mô là 1000 - 2500 lux ( và cs, 2009) [27]

m: Trong các bình nuôi c i luôn luôn là 100%

thành công hay th t b i c a nuôi c y mô t bào th c v t M i m t lo i v t li u

nghiên c u m t s loài m i ho c gi ng m i c n ph i l a ch ng

T nh u t o ra ng nuôi c y

bi , WP Ví d ng MS ( Murashige & Skoog, 1962) là môi

c s d ng r ng rãi nh t trong nuôi c y mô t bào th c v t, môi

ng MS thích h p cho c th c v t 1 lá m m, 2 lá m ng Gramborg (1965) còn g i là B5 dùng th nghi c s

d ng trong tách và nuôi t bào tr n

Tuy có r t nhi u lo i ng nuôi c y mô t bào th c v

sung thêm ngu n cac m u c y có th t ng h c các ch t h

ng ngu n cacbon b ng saccharose và glucose v i li ng 20-30 g/l dung d ch (Tr n Th L và cs, 2008) [11]

2.4.3.2 Nhóm nguyên t ng

Là nh ng nguyên t c s d ng v i hàm l ng th p

không th thi i v i s phát tri n c a mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co

nh, 2007) [26]

B ng 2.1 ng thông d c s d ng trong nuôi c y mô t

c pha d ng dung d ch m có n cao t n

1000 l n dung d ch làm vi c Dung d ch vitamin d b h ng do n m, khu n nhi m

t p và d b phân h y nhi cao, vì v y c n b o qu u ki n l nh

i 0OC ho c ch pha ch c khi s d ng nh, 2007) [26]

2.4.3.5 Các ch t ph gia h

Các ch t ph ng nuôi c y nh m kích thích s

d ch chi t n m men Trong thành ph n c c d a ch a các axit amin, axit h u

ng, Myo inositol và các ch t có ho t tính Auxin, các gluoxit c a Cytokinin Ngoài ra, khoai tây và chu c s d ng, vì trong thành

t n t i tr ng thái l ng, còn i 400C nó t n t i tr ng thái r n Trong

ng có tính axit cao, kh c c a agar gi m N

ng s d ng 5-8g/l (Tr n Th L và cs, 2008) [11]

Các ch ng là thành ph n không th thi u trong môi

ng nuôi c y, có vai trò quan tr ng trong quá trình phát sinh hình thái th c v t

Hi u qu c a ch ng ph thu c vào: N , ho t tính c a ch t

ng và y u t n i sinh c a m u c y ( và cs, 2009) [27]

D a vào ho t tính sinh lý phân chia ch u hò ng thành 2

Trong nuôi c y mô, t bào th c v t, nhóm ch ng là nhóm

c s d ng (Nguy n Kim Thanh và cs, 2005) [21]

2.4.3.8.1 Nhóm Auxin

c phát hi n l u tiên b i Charles Darwin và con trai là Francis

khoa h u và d n m r ng hi u bi t v nhóm ch t này Auxin

th c v t t p trung nhi u các ch i, lá non, h t n y m m, trong

ph n hoa Auxin có nhi ng t i các hi u ng và phát tri n

c a t bào tr bì- s ng xuyên qua v và bi u bì Ngoài ra,

n vi c hình thành ch i hoa, s phát tri n c a qu và

c s d ng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân

t o), IAA (auxin t nhiên) Ho t tính c a các ch c x p theo th t

ng nuôi c y mô NAA và 2,4D không b bi n tính nhicao Tuy nhiên ch t 2,4D là ch t d ó tác d ng nh n sphân chia t bào và hình thành callus (Tr n Th L và cs, 2008) [11]

2.4.3.8.2 Nhóm Cytokinin

c phát hi n t nh a th k XX, ch u tiên là Kinetin b t ngu n t tinh d ch cá trích Ti n zeatin tách t n i a

ng dãn dài c a t u ng c a cytokinin Ngoài ra,

Trong các ch t thu c nhóm cytokinin thì k c s

d ng ph bi n vì ho t tính m nh: Kinetin (ph i h p cùng auxin v i t l

L và cs, 2008) [11]

2.4.3.8.3.Nhóm Gibberellin

c tách chi t l u tiên t d ch ti t c a n m b i các nhà khoa h c Nh t

t n t i trong c h t non và qu n Gibberellin có tác d ng chính trong

vi c ho t hóa phân bào c a

thích s kéo dài c a t c c a ch i nuôi c y GA3 là lo i

c s d ng nhi u nh t (Tr n Th L và cs, 2008) [11]

n chính trong nuôi c y mô t bào th c v t

Theo (PGS.TS Ngô Xuân Bình và cs, 2003) [2]: Trong nuôi c y mô, t

n 2: Tái sinh m u nuôi c y

tri n c a mô nuôi c y Quá u khi n ch y u b ng các ch t

nuôi c y

n nhân nhanh ch i

M n này là t o h s nhân cao nh t Chính vì th

n then ch t c a quá trình nuôi c

n m men t h p v i các y u t ánh sáng, nhi thích h p, Tùy thu c

ng nuôi c i ta có th nhân nhanh b ng cách kích thích shình thành các c m ch i (nhân c m ch i) ho c kích thích s phát tri n c a các ch i nách thông qua vi c t o thành cây t phôi vô tính

n 4: T o cây hoàn ch nh

c nh nh các ch i s c chuy n sang môi

ng ra r ng sau 2 - 3 tu n các ch i riêng l này s ra r và tr thành cây

ng thu c nhóm auxin, là nhóm hormon th c v t quan tr ng có

ch o r ph t mô nuôi c y Trong nhóm này có các ch t IAA, IBA, NAA, 2.4-D c nghiên c u và s d ng nhi u nh t o r cho ch i

t

n cu i cùng c a quá trình và nó quy nh kh ng

d ng c a quá trình nhân gi ng in vitro trong th c ti n s n xu t.

m b o u ki n ngo i c nh thích h cây có th