Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro.

Yêu cầu của đề tài Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu cây Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA KIÊN CHƯƠNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.)

Harms) CHẤT LƯỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Thái Nguyên, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA KIÊN CHƯƠNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.)

Harms) CHẤT LƯỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: 1 ThS Vi Đại Lâm

Khoa CNSH & CNTP- Trường ĐHNL Thái Nguyên

2 ThS Đào Duy Hưng

Viện Khoa học Sự Sống - Trường ĐHNL Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2015

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: ThS Vi Đại Lâm và ThS Đào Duy Hưng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạ điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 26 tháng 5 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Ma Kiên Chương

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Các vi lượng thông dụng được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào

thực vật 19

Bảng 2.2 Bốn loại vitamin thường dùng 20

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy 31

Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy 33

Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng với HgCl2 (0,1%) 34

đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy 34

Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi 36

Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi 38

Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả tái sinh chồi 40

Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả tái sinh chồi 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy……… 32 Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy 33 Hình 4.3: Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng v ới HgCl2 (0,1%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy 35 Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi 37 Hình 4.5 Ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng Hình A: Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 2 38 Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi 39 Hình 4.7 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng; Hình A: Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 4 40 Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả tái sinh chồi 41 Hình 4.9 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng; Hình A: Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 4 42 Hình 4.10 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả tái sinh chồi 43 Hình 4.11 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng; Hình A: Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 3 44

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

CV : Coeficient of Variation LSD : Least Significant Difference Test Kinetin : Furfurylaminopurine

BAP : Best Absolute Perfect IAA : Indole-3- lacetic acid IBA : Indole-3-butyric acid NAA : α-naphthaleneaceticd Đ/C : Đối chứng

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 3

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiến của đề tài 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây Đinh lăng 4

2.1.1 Đặc điểm thực vật học của cây Đinh lăng 4

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 4

2.1.3 Giá trị của cây Đinh lăng 5

2.1.4 Saponin 7

2.2 Tình hình nghiên cứu cây Đinh lăng ở trong nước 10

2.3 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.3.1 Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật 10

2.3.2 khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

2.3.3 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy 13

2.3.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 16

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy 16

2.4.2 Điều kiện nuôi cấy 17

2.4.3 Thành phần môi trường nuôi cấy 17

2.4.4 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 23

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1.Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 25

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 25

3.1.2 Hóa Chất 25

3.1.3.Thiết bị 25

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 25

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu Đinh lăng 26

3.4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng 28

3.5 Xử lý số liệu 30

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

4.1 Kết quả ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu Đinh lăng 31

4.1.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu 31

4.1.2 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy 33

.1.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng với HgCl 2 (0,1%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy 34

4.2 Kết quả của một số chất điều hòa sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng 36

4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi 36

4.2.2 Kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi 38

4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả tái

sinh chồi 40

4.2.4 Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả tái sinh chồi 42

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

I Tài liệu tiếng Việt 46

II Tài liệu tiếng Anh 48

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây Đinh lăng có tên khoa học là Polyscias fruticosa (L.) Harms, thuộc họ

ngũ gia bì Araliaceae (Đỗ Tất Lợi, 2004) [17] Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ Polynesie (Thái Bình Dương), thuộc họ Ariliaceae, chi Polyscias Forst và Forst.f, chi này gần 100 loài trên thế giới phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đảo Thái Bình Dương (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]

Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ… Trong đó loài đinh lăng

lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi

làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6]

Đinh lăng là một loài thực vật được sử dụng nhiều trong y học dân gian Viê ̣t Nam và Trung Quốc (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4] Cây Đinh lăng có chứa hai hợp chất chính quan tro ̣ng là polyacetylen và saponin, các hợp chất này

có nhiều ở rễ và lá (Phạm Thị Tố Liên và cs, 2007) [12] Saponin trirtepen có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống stress Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa

20 acid amin và các loại acid amin không thay thế được như lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985) [15] Nhiều nghiên cứu cho thấy ở

rễ củ của cây Đinh lăng có chứa nhiều chất có tác dụng bồi bổ sức khoẻ và chữa bệnh Đặc biệt, trong cây Đinh lăng chứa các hợp chất saponin tương tự như trong nhân sâm (Ninh Thị Phím, 2013) [20]

Năm 1961, các khoa dược lý, dược liê ̣u và giải phẫu bê ̣nh lý Viê ̣n y ho ̣c quân sự Viê ̣t Nam nghiên cứu tác du ̣ng của Đinh lăng làm tăng cường sức dẻo dai của cơ thể và mô ̣t số tác du ̣ng khác Trên cơ sở kết quả nghiên cứu dược lý, Viê ̣n y ho ̣c quân sự Viê ̣t Nam năm 1964 cho thử nghiê ̣m trên người thấy với

0,23g đến 0,50g bột Đinh lăng mô ̣t ngày dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu nhẹ độ (30 đô ̣) thì có kết quả tăng sức dẻo dai của cơ thể n hư khi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Trong dân gian, ngoài công dụng ăn gỏi cá, có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho ra máu, thong tiểu, thong sữa, kiết lỵ nă ̣ng Tại Ấn Độ, theo K M Naikairai, Đinh lăng được dùng chữa sốt, làm săn da (Đỗ Tất Lợi, 2004) [17]

Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng thuốc sắc, rượu ngâm hoắc bột khô để chữa ho, đau tức cú, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè Đặc biệt rượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng để chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực

Hiện nay, công tác sản xuất giống phần lớn cây Đinh lăng được trồng bằng phương pháp giâm hom, vì vậy cây giống có độ đồng đều không cao, hệ

số nhân giống thấp, chất lượng thấp không đáp ứng được yêu cầu của thị trường Trong khi đó cây Đinh lăng giống được sản xuất bằng công nghệ nguôi cấy mô tế bào cho hệ số nhân giống cao, sạch bệnh, đồng đều và giữa được tính trạng ưu việt của giống gốc Việc ứng dụng phương pháp này để nhân giống cây Đinh lăng là một phương pháp mang lại hiệu quả kinh tế cao

Nhằm đáp ứng được nhu cầu thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro” nhằm góp phần hoàn thiê ̣n quy trình nhân

nhanh cây Đinh lăng

1.2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô

trùng mẫu cây Đinh lăng bằng kĩ thuật invitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng

1.3 Yêu cầu của đề tài

Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu

cây Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro

Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Quá trình nghiên cứu sẽ đưa ra được một số kĩ thuật góp phần xây dựng

và hoàn thiện tái sinh giống Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro Từ đó đánh giá

được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến kỹ thuật tái sinh

giống cây Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro

Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây dược liệu nói chung và cây Đinh lăng nói riêng

1.4.2 Ý nghĩa thực tiến của đề tài

Từ các kết quả nghiên cứu bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho các nghiên cứu, giảng dạy và kỹ thuật tái sinh giống Đinh lăng có chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro

Góp phần nhân giống cây Đinh lăng, tạo ra một số lượng cây giống lớn, đồng đều có chất lượng cao để cung c ấp phu ̣c vu ̣ cho s ản xuất và thị trường tiêu dùng ngày mô ̣t lớn

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây Đinh lăng

2.1.1 Đặc điểm thực vật học của cây Đinh lăng

Đinh lăng là cây dạng bụi, cao 1,5-2m Thân ngắn, không có gai, ít phân nhánh, các nhánh có nhiều lỗ bì lồi, Rễ phù như củ Lá kép 3 lần, mọc so

le, có bẹ, phiến lá xẻ lông chim, dài 20-40cm, không có lá kèm rõ Lá chép có cuống dài 3-10mm, phiến lá chép có răng cưa không đều, chóp nhọn, các đoạn đều có cuống, lá có mùi thơm Cụm hoa hình chùy ngắn 7-18mm ở ngọn, gồm nhiều tán, mang nhiều hoa nhỏ, màu trắng xám, tràng 5, nhị 5 với chỉ nhị gầy, bầu hạ ngăn có 2 đĩa trắng nhạt Quả hình trứng dẹp, dài 3-4mm,

dày 1mm, màu trắng bạc (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6]

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ Polynesie (Thái Bình Dương), thuộc họ Ariliaceae, chi Polyscias Forst và Forst.f, chi này gần 100 loài trên thế giới phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đảo Thái Bình Dương (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1] Ở Việt Nam, hiện có 10 loài Đinh lăng (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6], đa số Đinh lăng hiện nay được trồng làm cảnh, chỉ có một vài loài được sử dụng làm thuốc, loài Đinh lăng được sử

dụng làm thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms Đây là loài

có tác dụng dược lý giống Nhân sâm (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4].

Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình, lá có vị nhạt, hơi đắng, tính bình Có thể thu hoạch rễ ở những cây trồng 3 năm trở lên (trồng càng nhiều năm thì hệ rễ càng phát triển và lượng hợp chất thu càng được nhiều) Có thể thu rễ vào mùa đông sau đó rửa sạch phơi khô và bảo quản

ở chỗ mát Có thể thu lá quanh năm, thường dùng tươi (Đỗ Huy Bích và

cs, 2004) [1], (Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2004) [8]

Loài: Polyscias fruticosa (L.) Harms

Tên thông thường: Đinh lăng lá nhỏ, cây gỏi cá, Nam dương lâm, Đinh lăng lá xẻ, Đinh lăng hương (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6]

2.1.2.4 Thành phần hóa học

Trong rễ Đinh lăng có glycoside, alkaloild, vitamin (B1, B2, B6, C), các phytostrol và 20 acid amin, trong đó các acid amin không thể thay thế (lysin, methionin, trytophan, cystein) (Ngô Ứng Long, 1985) [15] Qua phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong lá, thấy có saponin, coumarin, tinh dầu, phytosterol, tanin, acid hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic Từ rễ và lá Đinh lăng, 11 saponin triterpen có thành phần aglycon và acid oleanolic đã được xác định, trong đó có 8 hợp chất mới được đặt tên là polysioside A-H (Võ Duy Huấn, 1998) [28] Có 5 hợp chất polyacetilen trong rễ Đinh lăng cũng được phân lập, trong đó panaxynol, panaxydol và heptadecaien-dyin-dyol là những chất có trong Nhân Sâm (Trần Công Luận, 1996) [18] và 2 polyacetilen chủ yếu được phân lập từ lá cũng là panaxynol, heptadecaien-dyin-duol (Trần Công luận và cs, 2000) [19]

2.1.3 Giá trị của cây Đinh lăng

2.1.3.1 Giá trị dinh dưỡng

Đinh lăng có chứa các hợp chất như alkaloid, glycoside, saponin, và các acid a min tan trong nước như B1, B2, B6, C và các phytosterin

Ở tất cả các bộ phận như rễ, và thân lá đều chứa saponin nhưng nhiều nhất là ở vỏ rễ và lá (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1] Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa 20 acid amin và có các loại acid amin không thay thế như lysin, methionin, trytophan, cystein (Ngô Ứng Long, 1985) [15].

Trong lá: Trong lá, Đinh lăng có chưa saponin triterpen (chiếm 1,65%), tinh dầu, phytosterol, tamin, acid hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic Saponin triterpen có thành phần aglycon và acid oneanolic, đây là một chất có tác dung dược liệu (Wenck A R., 1988) [29] Có 5 hợp chất polyacetylen được phân hóa từ lá cây Đinh lăng là: Panaxydol, panoxydol, heptadeca – 1,8 (E) dien – 4,6 diyn – 3,4 diol, Heptadeca – 1,8 (E) – dien – 4,6 diyn – 3ol – 10on và Heptadeca – 1,8 (Z) – 4,6diyn – 3ol – 10on (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]

Trong rễ: Trong rễ, Đinh lăng có chứa 5 hợp chất polyacetylen, bao gồm: Panaxydol, panoxydon, heptadeca – 1,8 (E) – dien – 3,10 diol và 3 hợp chất giống trong lá, các hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]

2.1.3.2 Giá trị dược liệu

Đinh lăng có tác dụng bồi bổ cơ thể, tăng thể trọng, thúc đẩy sự hình thành và củng cố trí nhớ đặc hiệu trên động vật có trí nhớ kém, tang lực, tăng sức dẻo dai của cơ thể, có tác dụng liên hệ nội tiết

Lá đinh lăng chống bệnh co giật cho trẻ em, lấy lá non và lá già phơi khô đem lót vào gối hoặc trải giường cho trẻ nằm Thân cành đinh lăng sắc uống chữa được bệnh đau lưng, mỏi gối, tê thấp, dùng phối hợp với rễ cây xấu hổ, cúc tần, cam thảo dây

Đinh lăng có tác dụng chống stress

Đing lăng có tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống sơ vữa động mạch, dựa trên tác dụng hạ cholesterol toàn và lipid toàn phần trong huyết thanh

Có tác dụng chống khuẩn tốt trên vi khuẩn Gram (+) như Staphylococus

Kích thích sự hoạt động của K+, Na+, ATPase (Phạm Thị Tố Liên và cs,

2007) [11], (Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2001) [9]

2.1.4 Saponin

Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao (Trần Hùng, 2003) [7]

Saponin có một số tính chất đặc biệt:

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

- Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất hydroxysteroid khác

3-b Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo = xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng)

Dựa vào cấu chúc người ta chia Saponin thành 2 nhóm là saponin triterpen (Có 30 chất cấu tạo bởi 6 nhóm Hemiterpen) và saponon steroid có 27 chất Trong

họ Nhân sâm thường chứa saponin triterpen (Trần Công Luận, 1996) [18]

Saponin là một nhóm hợp chất thứ cấp có vai trò quan trọng trong thực vật, saponin hiện diện ở cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm Quá trình tổng hợp saponin trong thực vật phụ thuộc vào sự di truyền, các loại mô khác nhau, tuổi của thực vật và các yếu tố môi trường xung quanh

Saponin có nhiều tác dụng dược lý như có tính phá huyết, tạo phức hợp với cholesterol, kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống tạo khối u, nhiều saponin có tác dụng diệt các loài nhuyễn thể,… Nhiều saponin có tính chất tạo bọt khi gia nhiệt, tính chất này có thể áp dụng để định tính saponin (Ngô Văn Thu, 1990) [24]

2.2 Tình hình nghiên cứu cây Đinh lăng ở trong nước

Theo (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4] tiến hành đề tài: “Nhân giống cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms thông qua con đường tạo phôi soma

trong nuôi cấy in vitro” và cho kết quả như sau: cây con được tạo thành từ mô

phân sinh của cây Đinh lăng trong môi trường có thành phần là MS có bổ sung BAP 2,0 mg/l, sau 60 ngày từ mô phân sinh tạo thành chồi và chồi nách

Theo (Trần Thị Liên và cs, 2005) [13] tiến hành nghiên cứu nhân nhanh cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L Harms bằng phương pháp in vitro và cho kết quả như sau: Vật liệu sử dụng là chồi đỉnh và chồi bên còn non của cấy Đinh lăng Môi trường sử dụng là môi trường MS có bổ sung vitamin Morel, nước dừa 10%, sucrose 30g/l và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Cây con được tái sinh qua con đường tạo phôi soma

Theo (Lê Thiên Thư và cs, 2005) [25] tiến hành: “Nghiên cứu sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms” và đưa ra kết quả như sau: Mô sẹo được hình thành từ các chồi in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4 – D2,0 mg/l các mô sẹo phát triển tốt nhất trển môi trường này và từ đó tạo phôi trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, những vật liệu này có thể phát hiện saponin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hay khả năng tạo bọt

2.3 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.1 Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật

Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức Schleiden và Schwan đã

đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành Các tế bào phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, đó là trứng sau thụ tinh, và

là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” (Nguyễn Đức Thành, 2000) [22]

Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy mô tế bào đã phân lập, người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng” Ông cũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây lá mầm như: Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27]

Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoà thảo Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới (Nguyễn Đức Thành, 2000) [22]

Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J H., Roberts L W, 1999) [32]

Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài Năm 1941, Van Overbeek và cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi

và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Dodd J H., Roberts L W, 1999) [32] Cũng trong thời gian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA, 2,4-D đã được tổng hợp Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật

mà trước đó rất khó nuôi cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005) [21]

Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá Ông nhận thấy chế phẩm này có

tác dụng kích thích sinh trưởng mô nuôi cấy rõ rệt Một năm sau, Skoog và cộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine và đặt tên là kinetin Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin và cùng với kinetin gọi chung

là nhóm cytokinin Cytokinin được tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên là zeatin có trong mầm ngô Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phân chia tế bào của các mô đã biệt hoá cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt

đã phơi khô (Dodd J H., Roberts L W, 1999) [32]

Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các protocorm (mô sẹo) từ địa lan Khi để trong các điều kiện nhất định, các protocorm có thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh Cùng năm

đó, Cocking ở trường đại học tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực vật được xử lý với enzym xenlulaza Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia) Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp rất lớn cho các ngiên cứu di truyền và lai tạo giống (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27]

Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được xenlulozo Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai

xa ở thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27]

2.3.2 khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy in vitro các nguyên liệu như đoạn thân, đoạn rễ, vảy củ hay mẫu mô, cánh hoa có kích thước phù

hợp được nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện vô trùng và môi trường thích hợp để tạo thành mô hay cây hoàn chỉnh (Vũ Văn Vụ và cs,2009) [27]

Ưu điểm của phương pháp này là: Cho hệ số nhân giống cao nên có

thể tạo ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn; Thực hiện quanh năm không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; Tạo ra cá thể mới giữ được đặc tính của cây ban đầu (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4], (Ngô Ứng Long, 1985) [15]

2.3.3 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy

Trong nhiều thập kỷ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới Có thể nói đây là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của nghành sinh học

Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus, nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên Điều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của

cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa một giống mới vào sản xuất với quy mô lớn (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006) [15], (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [27]

Ngoài ra, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài sinh vật sinh dưỡng Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra những con lai về mặt di truyền mà phương pháp nhân giống cổ điện không thực hiện được Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn định và độc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất thực vật ở ngoài tự nhiên “mở ra triển vọng sử dụng kỹ thuật này để nuôi cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học để thu nhận các hợp chấp trên quy mô công nghiệp” (Quách thị liên, 2004) [14]

Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro dễ sản

xuất các hợp chất thứ cấp:

 Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý Không cẩn thiết để vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

 Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu quả sản phẩm bằng cách loại bỏ những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản

 Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất được từ nuôi cấy mô dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006) [15]

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ xung các kỹ thuật nhân giống

vô tính cổ điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng một kỹ thuật tiến bộ với những ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực

kỳ cao và có tiềm năng công nghiệp hóa (Lê Trần Bình, 1997) [3]

Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền - đột biến, sinh lý sinh dưỡng ở các tế bào thực vật và nhiều đề sinh học khác…(Vũ Văn Vụ và

cs, 2008) [27]

2.3.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.4.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ

chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một

cơ thể đều chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng tổng hợp những kiểu protein – enzym giống hệt nhau và nếu được nuôi trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường Khả năng đó của tế bào được gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật” (Nguyễn Đức Thành, 2002) [22]

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt đã đưa ra chính là cơ sở lí luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái tạo của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một

tế bào riêng rẽ (Nguyễn Đức Thành, 2002) [22]

2.3.4.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Theo (PGS.TS Nguyễn Quang Thạch, 2015) [23]: Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa)

Sau đó từ tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các

tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan khác nhau của cơ thể

Tế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế

bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Qúa trình này gọi là quá trình phản phân hóa tế bào,ngược lại với phân hóa tế bào Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu thị bằng biểu đồ:

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa Kỹ thuật nuôi cấy

mô, tế bào thực vật xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào Trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật (Nguyễn Đức Thành, 2002) [22]

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nhân

giống in vitro Do đó, việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp là cần thiết Đối với Đinh lăng, vật liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính in vitro có thể là

chồi đỉnh, đỉnh sinh trưởng, hoặc đoạn thân non Các vật liệu này cần được

đảm bảo vô trùng trước khi tiến hành nuôi cấy in vitro Phương pháp vô trùng

vật liệu thông dụng nhất hiện nay là sử dụng các chất hóa học Đối với các thí

nghiệm nuôi cấy Đinh lăng in vitro, tôi sử dụng đỉnh sinh trưởng đã qua khử trùng để phục vụ cho việc nhân giống in vitro

Tế bào phôi sinh

Phân hóa tế bào

Tế bào giãn

Phản phân hóa

Tế bào chuyên hóa

2.4.2 Điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của tế bào và

mô trong quá trình nuôi cấy in vitro Trong đó, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm là

ba điều kiện có vai trò quan trọng nhất (Nguyễn Đức Thành, 2002) [22]

Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổn định ở 25 - 280

C, nhiệt độ còn ảnh hưởng tới hoạt động của Auxin (Vũ Văn

Vụ và cs, 2009) [27]

Ánh sáng: Các nghiên cứu cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy Các loại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng khác nhau Thời gian chiếu sáng với đa số các loài cây thích hợp là 12 - 18h/ngày Cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô là 1000 - 2500 lux (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27]

Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn luôn là 100%

2.4.3 Thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô tế bào có thành phần thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy Đối với cùng một loại mô,

cơ quan nhưng mực đích nuôi cấy mô không giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27]

Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy mô tế bào thực vật Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thục vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, WP Ví dụ môi trường MS ( Murashige & Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm Hay môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần

Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau (Lê Trần Bình, 1997) [3]:

 Các muối khoáng đa lượng vi lượng

 Nguồn cacbon

 Các vitamin và aminoacid

 Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

 Các chất điều hòa sinh trưởng

2.4.3.1 Nguồn cacbon

Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu vì vậy phải bổ sung thêm nguồn cacbon để mẫu cấy có thể tổng hợp được các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia Thông thường nguồn cacbon bổ sung là đường saccharose và

glucose với liều lượng 20-30 g/l dung dịch (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [11]

2.4.3.2 Nhóm nguyên tố vi lượng

Là những nguyên tố thường được sử dụng với hàm lượng thấp hơn 300mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme (Đỗ Văn Vịnh, 2007) [26]

Bảng 2.1 Các vi lƣợng thông dụng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô tế

2.4.3.3 Nhóm nguyên tố đa lượng

Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng như: N, P, K,

Mg, Ca, Na, S, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường và xây dựng nên thành tế bào, môi trường nhiều nito thích hợp cho việc hình thành chồi, với môi trường nhiều kali sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [11]

2.4.3.4 Vitamin

Do các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được hầu hết các loại vitamin nhưng không đủ về số lượng Do đó trong quá trình

nuôi cấy in vitro, các vitamin cần được bổ sung vào môi trường với nộng độ

thích hợp Đặc biệt là các vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6 Trong

đó, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật (Nguyễn Đức Thành, 2002) [22]

Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 đến

1000 lần dung dịch làm việc Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trong điều kiện lạnh dưới 0O

Choặc chỉ pha chế trước khi sử dụng (Đỗ Văn Vịnh, 2007) [26]

2.4.3.5 Các chất phụ gia hữu cơ

Các chất phụ gia được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan khác như: Nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu

cơ, đường, Myo – inositol và các chất có hoạt tính Auxin, các gluoxit của Cytokinin Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng, vì trong thành phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27]

2.4.3.6 Các chất làm đông cứng môi trường

Một số chất được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy đông đặc lại để tạo thành giá thể cho mẫu phát triển như agar: Dây là một loại polysaccharid làm từ rong biển và có khả năng ngậm nước cao, ở 800C Agar ngậm nước và tồn tại ở trạng thái lỏng, còn ở dưới 400C nó tồn tại ở trạng thái rắn Trong môi trường có tính axit cao, khả năng đông đặc của agar giảm Nồng độ thường sử dụng 5-8g/l (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [11]

2.4.3.7 pH của môi trường

Là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy Thực tế đã chứng minh khi PH thấp (PH < 4,5) hoặc cao hơn (PH > 7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triển của mô và tế bào nuôi cấy Nếu PH của môi trường giảm mạnh mẽ sẽ làm rối loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy, thường PH dao động trong khoảng từ 5,5 – 6,5 trong nuôi cấy mô tế bào thực vật (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [11]

2.4.3.8 Các chất kích thích sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hòa sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27]

Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chia chất điều hòa sinh trưởng thành 2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm chất ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng (Nguyễn Kim Thanh và cs, 2005) [21]

2.4.3.8.1 Nhóm Auxin

Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách) Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia

của tế bào trụ bì-nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu bì Ngoài ra, auxin còn có tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá (Nguyễn Như Khanh và cs, 2011) [10]

Các auxin thường được sử dụng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (auxin tự nhiên) Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự

từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân hủy trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [11]

2.4.3.8.2 Nhóm Cytokinin

Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim Zeatin có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô Tỷ

lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin Ngoài ra, cytokinin còn làm chậm sự già hóa (Nguyễn Như Khanh và cs, 2011) [10]

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin với tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền với nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea… (Trần Thị

Lệ và cs, 2008) [11]

2.4.3.8.3.Nhóm Gibberellin

Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Gibberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất (Trần Thị Lệ và cs, 2008) [11]

2.4.4 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo (PGS.TS Ngô Xuân Bình và cs, 2003) [2]: Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giao đoạn sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in

vitro Mục đích của giai đoạn này phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng

để đưa vào nuôi cấy

Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa tự, hoa, thân đoạn, mảnh, lá, rễ

Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy

Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy Thường các mô non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hóa

Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi

Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số nhân cao nhất Chính vì thế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy Để tăng

hệ số người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, …), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp, Tùy thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi) hoặc kích thích sự phát triển của các chồi nách thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ Thường sau 2 - 3 tuần các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này có các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi

Giai đoạn 5: Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là gia đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng

dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất Đây là giai

đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong vườn sản xuất