Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản thực phẩm ĐTN nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất rượu vang chất lượng cao

Thông qua khu vực Địa Trung Hải, rượu vang đã xâm nhập mạnh mẽ vào Châu Âu cách đây 1.400 năm và chỉ có ở Châu Âu, ngành sản xuất rượu vang mới thực sự phát triển rộng khắp, đặc biệt là

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẢM

301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

BAO CAO TONG KET KHOA HOC VA KY THUAT

Đề tài cấp Nhà nước

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYM TRONG

CHE BIEN MOT SO NONG SAN THUC PHAM

Hà Nội, 10 — 2004 Bản thảo viết xong tháng 7 — 2004

Tài li ệu n ày ẩ t ợc chu ẩn b { trên c ơ s ở kết qu ả th ực hì ện đ ê t ài c ấp

Nhànước, Mã s 6: KC 04-07

hob tet am

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

Th.s Trương Hương Lan

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về r ượu vang

1.1.1 Lịch sử của rượu vang

1.1.2 Phân loại rượu vang

1.1.2.1 Rượu vang đỏ

1.1.2.2 Rượu vang trắng

1.1.3 Các thành phần chính của rượu vang

1.1.4 Tác dụng của rượu vang

1.2 Nắm men trong sản xuất rượu vang

1.2.1 Đặc điểm di truyền của nấm men Saccbaromyces cerevisiae

1.2.2 Phương pháp lai ghép

1.2.2.1 Phương pháp giọt phủ

1.2.2.2 Lai ghép các chủng đơn bội tự dưỡng

1.2.2.3 Phương pháp phân lập các hợp tử từ các hỗn hợp lai ghép

1.2.2.4 Các kỹ thuật lai hiếm

1.2.3 Tạo bào tử ở tế bảo nắm men

1.2.3.1 Phân lập bào tử

1.2.4 Phân tích bộ bốn

1.2.4.1 Phân tách tế bào thông qua thiết bị vi thao tác trên kính hiển vi

1.2.4.2 Xác định quá trình phân ly sau giảm phân

1.2.5 Các chủng nằm men quan trọng trong sản xuất rượu vang

1.2.5.1 Saccharomyces cerevisiae

1.2.5.2 Saccharomyces vini

1.2.5.3 Saccharomyces oviformis 21 1.2.5.4 Saccharomyces bayanus (S beticus, S.cherieris, S.rouxii) 21

1.2.5.5 Saccharomyces chevalieri (S fructurum, S.limdneti) - 22 1.2.5.6 Saccharomyces rosei (Toruaspora rosei) 23 1.2.5.7 Saccharomyces uvarum (S.carlsbergensis ) 23

1.2.6 Các chủng nắm men gây hư hỏng rượu vang 24

1.2.6.2 Brettanomyces vini (B.intermedius,B.schanderlii) 24

1.2.6.3 Zygosaccharomyces (S.bailii, S.acidofilus, S elegans) 24

1.2.6.4 Turulopsis stellata (T bacillaris) 25

1.2.6.5 Hanseniaspora wuvarwm và dạng bất toàn của nó 25

PHAN 2- NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 30

3.1 Xác định đặc tính của các chủng nấm men rượu vang 33

3.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và khả năng tạo bào tử của các chủng nấm

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý của các chủng nấm men rượu vang 33

3.1.1.2 Khảo sát khả năng tạo bào tử của các chủng nấm men Š cerevisiae 34

3.1.2 Xác định khả năng lên men của các chủng nấm men rượu vang

3.1.2.1 Khả năng tạo CO; trong bình engol

3.1.2.2 Nghiên cứu xác định khả năng chuyển hoá đường

3.1.3 Khảo sát khả năng chịu cồn của các chủng nấm men rượu vang

3.2 Di truyền tuyển chọn nấm men thuần khiết tạo độ cồn cao bằng phương

pháp lai ghép bào tử

3.2.1 Nghiên cứu nâng cao khả năng tạo bào tử của nấm men S.cerevisiae

3.2.2 Tuyển chọn những cá thể điển hình sau khi sốc mang đặc tính di truyền

phù hợp cho quá trình lai ghép

3.2.3 Lai ghép bào tử của các cá thể nấm men và chọn lọc

3.2.4 Xác định khả năng lên men của các cá thể lai trong sản xuất rượu vang

3.3 Sản xuất rượu vang ở quy mô thực nghiệm

3.3.2.1 Ảnh hưởng của bentonit đến quá trình lắng trong

3.3.2.2 Ảnh hưởng của polyclar đến tính ốn định của vang thành phẩm

3.3.3 Thử nghiệm sử dụng chủng nấm men FD-H3 vào sản xuất đại trà

rượu vang vải

MỞ ĐẦU

Ngành sản xuất rượu vang trên thế giới đã có cách đây hàng ngàn năm và

cho đến nay đã trở thành ngành công nghiệp sản xuất với quy mô lớn ở nhiều quốc

gia thuộc châu Âu và châu Mỹ như: Pháp, Ý, Đức, Tay Ban Nha, Bồ Đào Nha,

Nga, Mỹ, Achentina Với tổng sản lượng đạt hàng chục tỷ lí/năm và lợi nhuận kinh tế do ngành sản xuất rượu vang mang lại là rất lớn cho các quốc gia Ngày nay

rượu vang đã trở thành loại đồ uống bổ dưỡng cần thiết của người dân ở nhiều quốc

gia trên thế giới

Không chỉ hấp dẫn bởi hương vị và màu sắc đặc trưng, rượu vang còn có giá trị đỉnh dưỡng cao hơn hẳn các loại rượu khác Giá trị dinh dưỡng của rượu xang thể hiện bởi các vitamin, axit amin và chất khoáng được chuyển từ dịch quả vào

rượu thông qua quá trình lên men và tàng trữ ổn định chất lượng của rượu Chính vì

thế rượu vang thực sự tốt cho sức khoẻ con người khi được sử dụng điều độ

Rượu vang đã đem lại cho con người biết bao điều thú vị Ngoài những giá

trị về tỉnh thần, giá trị dinh dưỡng thì rượu vang còn thể hiện giá trị kinh tế cao

Trong đó không thể không nói đến những nguồn lợi nhuận to lớn đem lại từ việc

sản xuất rượu vang Do vậy, nền sản xuất rượu vang thực sự đã chiếm giữ một địa

vị hết sức quan trọng đối với nhiều doanh nghiệp ở khắp mọi nơi trên thế giới Tuỳ

theo tập quán, khẩu vị kết hợp với sự đi lên của kỹ thuật mà nhiều nước trên thế giới đã có các phương thức sản xuất khác nhau Và kết quả là hàng trăm loại rượu

vang nổi tiếng ra đời

Ở nước ta, khi đời sống người dân càng được cải thiện thì rượu vang không còn là một sản phẩm xa lạ, trái lại nó đang đân được ưa chuộng và được sử dựng rộng rãi Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới bốn mùa hoa thơm quả ngọt rất thuận lợi cho sản xuất rượu vang Vì vậy những năm gần đây nước ta đã chú ý nhiều đến việc sản xuất rượu vang và nhu cầu tiêu thụ rượu vang cũng ngày một

1

tăng Tuy nhiên kỹ thuật sản xuất rượu vang ở Việt Nam còn rất mới mẻ, sản xuất với quy mô nhỏ, phương pháp thủ công thô sơ do đó chất lượng còn thấp Một số

loại rượu vang được bán trên thị trường như vang Thăng Long, vang Đà Lạt nhưng

chất lượng chưa cao, chưa sánh được với các loại vang nhập ngoại

Ngoài ra còn có rất nhiều cơ sở sản xuất rượu vang nhưng chủ yếu sản xuất

ở quy mô nhỏ, thiết bị thô sơ nên chất lượng rượu rất không đảm bảo Hơn nữa không sử dụng triệt để được nguồn nguyên liệu nên chỉ phí cho tiêu hao nguyên

liệu lớn vì vậy giá thành của rượu thành phẩm cao hoặc không đáp ứng được chất

lượng

Để giải quyết vấn đề trên một mặt cần thiết phải đổi mới trang thiết bị, quy

trình công nghệ nhưng điều quan trong là phải tìm nguồn nguyên liệu và phương

pháp xử lý thích hợp cũng những điều kiện tối thích cho quá trình lên men nhằm nâng cao hiệu suất và chất lượng sản phẩm

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Hoàn thiện công nghệ và thiết bị sản xuất rượu vang chất lượng cao” thuộc dé tài Nhà nước mã số KC 04-07:

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản, thực phẩm.

PHAN I- TONG QUAN

1.1 GIOI THIEU CHUNG VE RUQU VANG

1.1.1 Lịch sử của rượu vang

Con người đã biết sản xuất rượu vang từ rất lâu (khoảng 12.000 năm trước

đây) và hiện nay vẫn còn các dấu vết được chạm khắc ở trên đá, mô tả các hoạt động

sản xuất rượu /ang của vùng Mésopotamis, Ai cập và Hy lạp Thông qua khu vực

Địa Trung Hải, rượu vang đã xâm nhập mạnh mẽ vào Châu Âu cách đây 1.400 năm

và chỉ có ở Châu Âu, ngành sản xuất rượu vang mới thực sự phát triển rộng khắp,

đặc biệt là các loại rượu vang truyền thống của Pháp, Italia, Đức,Tây Ban Nha

Ngay từ thời kỳ Trung đại, người ta đã biết bỗ xung vào rượu vang một số phụ gia như mật ong hoặc chất mầu đẻ hạn chế các nhược điểm trong quá trình lên men Tuy nhiên, chỉ vào thé ky XIX, đặc biệt khi Louis Pasteur (1866) bằng các nghiên cứu của mình đối với rượu vang và bia đã chỉ ra rằng quá trình lên men cồn

là do hoạt động của nấm men lên men các loại đường trong dịch nước nho ở điều

kiện hiểu khí và yếm khí [19]

Cho tới nay, nhờ có những tiến bộ khoa học trong lĩnh vực công nghệ sinh học, nhiều dòng nắm men với những đặc tính đi truyền ưu việt đã được tối ưu hoá

một cách toàn diện các thông số kỹ thuật nhăm mục đích tạo ra sản phẩm rượu đạt

chất lượng cao Chính vì vậy, mà cùng với bia, rượu vang là thứ đồ uống được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay Theo thống kê năm 1991, tổng sản lượng rượu vang của

toàn thế giới là 25 tỷ lít, năm 1992 là 29 tỷ lít và năm 1999 là xấp xi 46 tỷ lít, trong

khi đó sản lượng rượu vang của khu vực Châu Á Thái Bình Duong dat | ty lít Năm

1995, châu Úc chiếm 500 triệu lít, còn lại là Malaysia, Hồng Kông, Sigapore, Thái

lan, Philippine, Indonesia, Hàn quốc 10 triệu lít Tuy nhiên, so với châu Âu thì lượng

tiêu thụ tính theo bình quân đầu người trong năm của các nước kể trên là không

đáng kẻ, chăng hạn như ở Pháp là 65 lít, Ý là 62 lít, Bồ Đào Nha và Bi là 60 lít

{18,32]

Người Việt nam biết tới rượu vang từ hàng trăm năm thông qua con đường

thương mại từ châu Âu vào Việt nam Nhưng ngành sản xuất rượu vang ở nước ta

mới chỉ thực sự bắt đầu từ 20 — 30 năm trở lại đây Tuy ra đời chậm nhưng ngành sản xuất rượu vang đã phát triển rất nhanh về cả chất lượng và số lượng, từng bước

đáp ứng thị trường Tính tới năm 1998 tổng sản lượng vang Việt nam đạt khoảng 8 triệu lít /năm với nhiều cơ sở sản xuất khác nhau Lớn nhất là vang Thăng Long, bên

cạnh đó là vang của hãng Ninh Thuận, Hà Nội (Công ty Rượu Hà Nội), Gia Lâm,

Đông Đô, Hồng Hà Tây Đô, Bắc Đô, Đà Lạt và rất nhiều loại rượu vang được sản xuất từ các loại hoa quả khác nhau

Theo truyền thống, rượu vang được định nghĩa là sản phẩm lên men từ dịch

nước nho có chứa cồn không qua chưng cất Tuy nhiên, gần đây người ta đã mở rộng

khái niệm này để chỉ các loại rượu lên men từ các loại quả khác như táo, dâu, dứa, lê,

đào Hiện nay, tuỳ thuộc và mục đích của nhà sản xuất mà dịch nước quả có thể là đối tượng của nhiều quá trình lên men khác nhau

- _ Lên men rượu: đây là giai đoạn quan trọng nhất trong quá trình sản xuất rượu vang, cho phép biến đổi các loại đường trong dịch nước quả thành cồn, khí CO;¿, và rất nhiều sản phẩm phụ khác góp phần tạo ra hương vị đặc trưng của vang

- Lên men malolactic: Cho tới nay quá trình này đã được nghiên cứu một cách rất hệ thống Nó thực hiện quá trình chuyển hoá di-axit malic thành mono-

axit, làm hạ pH của môi trường Điều này cho phép thu được rượu vang có vị

chua dịu hơn Lên men malolactic được áp dụng rất phổ biến trong quá trình sản xuất các loại rượu vang của Pháp như Bordeaux đỏ hay các loại rượu Champagne

- Lén men rượu lần thứ hai trên cơ sở rượu vang đã lên men có bổ sung thêm

đường sacaroza của mía hoặc củ cải: hay còn gọi là quá trình tạo bọt, đóng vai trò rất quan trọng để sản xuất các loại vang nổ Quá trình này được thực hiện

dưới điểu kiện áp suất cao, hoặc là trong thùng gỗ sỏi, hoặc trong chai

(phương pháp sản xuất rượu champagne) [I9]

Qua đó, chúng ta có thể chia rượu vang thành nhiều loại khác nhau phụ thuộc vào hàm lượng cồn, đường sót và hàm lượng CO; Bên cạnh đó, rượu vang cũng có

thể được phân loại theo mâu sắc như vang đỏ, vang trắng, vang hồng Trong mỗi

nhóm lại chia thành nhiều loại nhỏ khác nhau tuỳ thuộc vào hương, vị đặc trưng của

chúng Điều này được trình bày cụ thể trong bảng I.1

Bảng 1.1 - Phản loại rượu vang [18,23]

Trên thế giới có tới hàng trăm loại rượu vang khác nhau Mỗi loại được đặc trưng bởi một phương thức sản xuất riêng, tuỳ theo đặc điểm của rượu và tính chất của công nghệ Trong thực tế có hai cách chế biến rượu vang phổ biến nhất

Đó là cách chế biến rượu vang trắng và cách chế biến rượu vang đỏ

1.1.2.1 Rượu vang đó

Khi lên men nước quả nho có lẫn với xác quả riêng gọi là vang đó Trong

vỏ quả có nhiều chất màu, chất tanin, chất gây mùi thơm những chất này khi bị phân huỷ làm tăng lượng chất hoà tan có trong rượu và tạo hương vị phong phú cho rượu, tạo màu sắc đẹp cho rượu Khi lên men cùng với xác quả, kéo theo cả quần thể men bám trên vỏ quả Trong vỏ quả giầu thức ăn về đạm, về khoáng nên quá trình lên men dễ dàng hơn Lên men cả xác quả thường được tiến hành Ở nhiệt độ cao Hơn để trích ly được các chất màu, chất thơm và tanin có thể hoà tan trong rượu

Kết thúc lên men, cần tiến hành tách xác quả ra khỏi rượu Trong sản xuất lớn, trước hết người ta cho rượu chảy qua một tấm lưới để giữ các tạp chất lại Rượu này có chất lương cao nhất và được gọi là rượu vang giọt, vang chảy Khi rượu ngừng chảy thì đưa vào máy ép Rượu vang ép chiếm khoảng 15% tổng số

rượu chế được, có thể đem trộn với vang chảy để chế biến Bã có thể đem ép lần

nữa hoặc qua sử lý, sấy khô làm thức ăn cho gia súc

Rượu vang đỏ do lên men cả xác quả nên chứa nhiều tanin hơn rượu vang

trắng, có vị chát hơn Do đó cần lên men malolactic để chuyển hoá axit malic

sang axit lactc tạo cho rượu vị chua dịu cân đối với vị chát của tanin Để lên men

malolactic tốt không nên tiệt trùng rượu trẻ vì lên men malolactic xảy ra sau vài

ngày, hoặc vài tuần sau lên men, vi khuẩn Lactic da thich nghi dần với môi

trường Có thể sử dụng vi khuẩn acc hoặc một lượng nhỏ nấm men Schizosaccharomyces để có khả năng lên men malolactic nhanh và triệt dé

1.1.2.2 Rượu vang trắng

Khác với rượu vang đỏ, rượu vang trắng được lên men từ nước quả đã được

tách bã quả Vì nước quả thường không có màu nên được gọi là vang trắng

Hương vị của rượu vang trắng chủ yếu là do nước quả Rượu vang trắng thường

được lên men ở nhiệt độ thấp hơn rượu vang đỏ để giữ hương cho rượu Rượu

vang trắng thường có ít vị chát, có độ chua cao hơn, độ cồn cao hơn vang đỏ

Nói chung hiện nay người ta dùng phương pháp cấy men thuần chủng vào

dịch lên men Trước khi lên men cần tiến hành nhân giống từ hai, ba đến nhiều

cấp trên môi trường tương tự như dịch lên men nhưng có nồng độ đường thấp hơn

và bổ xung đủ chất dinh dưỡng, cung cấp đủ oxy Men giống sau khi nhân được

cấy vào dịch lên men với tỷ lệ 4-10% thể tích

Lên men rượu vang trắng tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn so với rượu vang

đỏ, khoảng 15-20°C Rượu vang trắng rất cần giữ hương nên nhiệt độ thấp sẽ tốt

hơn Thời gian lên men là từ 6-7 ngày hoặc lâu hơn tuỳ theo nhiệt độ và yêu cầu

công nghệ

Kết thúc quá trình lên men khi nhận thấy rượu không còn sủi bọt lên nữa,

cặn và xác men đã bắt đầu đọng xuống đáy thùng Khi đó tiến hành gạn căn, thay

thùng Rượu trẻ được chuyển sang thùng mới, tiếp tục để lắng cặn rồi đưa vào tàng trữ

Lắng trong và tàng trữ rượu vang:

Quá trình lên men kết thúc, đường hầu hết được chuyển hoá thành rượu và

các sản phẩm phụ khác, ta được rượu vang non Tuy nhiên rượu chưa trong và

chưa đạt được hương vị thanh khiết như mong muốn

Lắng trong rượu nhằm tách hết những căn bẩn của men và một số protein

bị kết tủa trong rượu Quá trình lắng trong rượu thường tiến hành ở nhiệt độ thấp

và yên fĩnh Thời gian lắng trong phụ thuộc vào thành phần các chất có trong

rượu Rượu vang đỏ chứa nhiều tanin thì lắng trong tốt, rượu vang ít đường thì lắng trong nhanh hơn đo có độ nhớt nhỏ.

Sau khi lắng trong, thì thay thùng để tách cặn ra khỏi rượu, để rượu tiếp xúc với ôxy để tạo điều kiện cho rượu “chín” tốt hơn :

Tiếp theo cần tiến hành tàng trữ rượu Thực chất đây là quá trình lên men

từ từ, cường độ nhỏ nhằm phân huỷ thêm một lượng đường sót trong rượu đồng thời ổn định hương vị và tạo điều kiện kết lắng protein, peptin làm cho chất lượng

1.1.3 Các thành phần chính của rượu vang

Như đã trình bày ở trên, rượu vang là sản phẩm lên men rượu từ nước quả,

do vậy ngoài sản phẩm chính như etanol, CO; còn có các sản phẩm phụ khác của quá trình lên men như rượu bậc cao, glyxerm, aldehit, axit, chất thơm và các thành phần khác của dịch quả, chẳng hạn như polyphenol, mono, di và polysacarit, axit béo, axit amin Tất cả những thành phần này đều góp phần làm lên hương, vị đặc trưng của vang [23] Trong số đó, các chất thơm như rượu bậc cao, es(e, axit bay hơi đóng vai trò quyết định trong việc tạo hương thơm cho vang Hàm lượng của các chất thơm trong vang phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác

nhau, đặc biệt là thành phần của nguyên liệu Rượu vang được sản xuất từ các

loại quả khác nhau thì có hương vị đặc trưng riêng Bên cạnh đó các yếu tố công nghệ cũng ảnh hưởng mạnh tới sự hình thành của các chất thơm trong vang, đặc biệt là đặc tính sinh lý của nấm men được sử dụng để lên men rượu vang|4,10]

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm men tới thành phần các hợp chất thơm trong rượu vang, nhưng mới đây nhất và đây đủ nhất là các nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm men tới các hợp chất bay hơi trong rượu vang của Andrea Antonelli và các cộng sự, 1999 [2] Nhóm tác giả cho thấy rượu vang

được lên men bởi các chủng khác nhau thì tạo ra hàm lượng các chất bay hơi rất khác nhau Mặt khác có thể dựa vào chất lượng và hàm lượng chất thơm được tạo thành để tuyển chọn, phân loại và định tên các chủng nấm men Mười ba chủng nấm men khác nhau đã được sử dụng trong nghiên cứu này để lên men rượu vang

nho Và sự khác nhau giữa chúng được trình bày trong bảng 1.2 và 1.3

OI

Bảng 1.2 - Thành phần của rượu vang [2]

TT

Bảng 1.3 - Hàm lượng các hợp chất bay hơi tính theo Hgll do các chủng nấm men khác nhau sinh ra

1.1.4 Tác dụng của rượu vang

Con người biết tới và yêu thích rượu vang là do nó mang lại cảm giác kích thích, sảng khoái hay tác dụng tăng cường sức khoẻ Tuy nhiên, chúng ta không thể giải thích được nguyên nhân gây ra hiện tượng này Phải cho tới những năm

cuối thế kỷ XIX, đầu XX thì bí mật này mới được giải thích nhờ các nghiên cứu

khoa học đã chỉ ra rằng cồn và một số các hợp chấp giầu hoạt tính sinh học khác

như ethanol, polyphenol, polysacarit gây ra Chẳng hạn như, trong rượu vang

nho có chứa các hợp chất resvertrol, quercetin, và catechin có tác dụng dược lý

học như là các tác nhân chống oxy hoá, chống viêm và chống đông máu làm

thuyên giảm các căn bệnh có liên quan tới động mạch vành, ũnh mạch của tim,

chứng rối loạn lipit trong máu và bệnh huyết khối Bởi vì các hợp chất này có tác

Bên cạnh đó, trong vang còn chứa các hợp chất polyphenol (anthrocyanin, leuco- anthocyanin) được chiết suất từ vỏ quả nho có tác dụng chống oxy hoá rất mạnh Chúng có ngăn ngừa quá trình oxi hoá sinh ra các chất độc trong vang như

là lipoprotein phân tử thấp là một cholesteron rất độc Giảm hàm lượng lipoprotein thấp phân tử và tăng hàm lượng lipoprotein cao phân tử là các yếu tố góp phần tích cực vào việc chữa trị các căn bệnh về động mạch vành của tim Mới đây, Garcia 1998, đã nghiên cứu tới việc phụ nữ sử dụng rượu vang một cách điều

độ và quá nhiều với việc điều trị sự hình thành bệnh ung thư vú và thiếu máu cục

bộ của tim Ngoài ra, rượu vang còn làm giảm tỷ lệ tử vong ở nữ; chữa bệnh tiểu đường loại II; diệt khuẩn, và tác dụng chữa bệnh của rượu vang so với các loại đồ uống khác có độ cồn tương đương được trình bày trong bảng 1.4 và 1.5

12

Bang 1.4 - Tác dụng chữa bệnh và tác hại của rượu vang đỏ

Tác dụng lâm sàng Thể loại điều trị Hiệu quả

Ngăn ngừa bệnh tật có liên quan tới | Chống oxy hoá Tích cực động mạch của tim, và xơ vữa động

Bệnh thiếu máu cụ bộ của tim Bảo vệ tim Tiêu cực

Cải thiện chất lượng đời sống của các Kiểm soát hàm lượng | Tích cực bệnh nhân tiểu đường loại II glucoza trong máu

Kìm chế H,O, gây hư hỏng nhân đối | Hoá chất ngừa ung thư | Không

Giảm bênh mất trí nhớ Tác nhân chống mất trí | Tích cực

1.2 NAM MEN TRONG SAN XUAT R UQU VANG [15]

Theo truyền thống, quá trình chuyến hoá dịch nước nho thành rượu vang

là một quá trình lên men tự nhiên được thực hiện bởi các vi sinh vật có sẵn trong

nho và các thiết bị để sản xuất vang Do đó rất khó có thể kiếm soát được các quá trình lên men tự nhiên này Năm 1866, Louis Pasteur đã chứng minh rằng nắm

13

men là tác nhân chính gây ra quá trình lên men rượu vang Nắm men rượu vang

dugc xép vao lop nim Ascomycetes (tao bao tir) va Deuteromycetes (không bảo tử) Cho tới nay đã có hơn 40 loài nấm men khác nhan đã được xác định dựa vào

các đặc điểm hình thái vả đặc tính sinh lý, khả năng tiêu thụ một số loại đường và

cdc chat nito

1.2.1 Dac diém di truyền của nấm men Saccharomyces cerevisiae

Nam men Saccharomyces cerevisiae có giới tính a và œ Các tế bào đơn bội sinh sản thông qua nguyên phân bằng cách nảy chổi Các tế bào đơn bội a và kết hợp với nhau tạo nên bào tử lưỡng bội Các bào tử lưỡng bội này rất dn

định và sinh sản băng nguyên phân cũng bằng hình thức nảy chồi Nhưng nếu ndi lưỡng bội a/œ được đưa lên môi trường đói nitơ thì các tế bảo của nó bắt đầu

giảm phân, mỗi tế bào cho một nang có chứa 4 bảo tử đơn bội ở bên trong ‘Hai

bảo tử có giới tính a và hai bảo tử còn lại có giới tính œ Khi bốn bao tử thoát ra

khỏi nang bào chúng sẽ nây chỗi và sinh sản ra các tế bảo dinh dưỡng đơn bội

Các bào tử trong nang bào của nấm men Szccharomyces cerevisae bé trí một cách ngẫu nhiên không tuân theo trình tự phân ly của bốn nhiễm sắc thé tach ra

từ mỗi nhiễm sắc thể trong pha giữa của giảm phân I, vì vậy bốn bào tử trong mỗi nang gọi là bộ bốn không xếp hàng [21]

1.2.2 Phương pháp lai ghép [9]

Việc lai ghép các chủng nắm men đơn bội có thể được thực hiện bằng

nhiều cách khác nhau hoặc bằng cách trộn lẫn các chúng nấm men trên môi

trường giầu dinh dưỡng và phân lập các hợp tử tạo thành sau khi lai bằng ví thao

tác trên kính hiển vi hoặc bằng một vài sự thay đôi trong phương pháp giọt phủ

Phương pháp sau được sử dụng nhiều hơn để thực hiện việc lai ghép các chủng dị

dưỡng có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp Đối với các chủng bố mẹ đơn bội tự

14

dưỡng, tất nhiên là cả với các chủng lai chỉ có thé phân lập được bằng vi thao tác

trên kính hiển vi các hợp tử thu được từ hỗn hợp lai

1.2.2.1 Phương pháp giọt phú

Cơ sở của phương pháp là tạo ra các tế bảo lai giữa hai chủng bằng cách

nhỏ giọt huyền phủ của chủng này lên giọt huyền phù của chủng khác đã nhỏ sẵn trên bề mặt môi trường thạch trong hép petri

1.2.2.2 Lai ghép các chủng đơn bội tự dưỡng

Có thể thực hiện việc này tương tự như đối với phương pháp lai ghép các

chủng đơn bội dị dưỡng, cho dù rất khó có thể phân lập được các chủng đa bội

được tạo ra sau khi lai, ngay cả khi có sử dụng các phương pháp bé tro trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu, có ít nhất hai phương pháp đang được sử dụng hiện nay

Phân lập các chủng đa bội bằng cách tách khuẩn lạc từ hỗn hợp lai và tách

các khuẩn lạc một cách ngẫu nhiên, sau đó chúng được đem kiểm tra khả năng hình thành bào tử Phương pháp này có thé thay đổi bằng cách lựa chọn và phân

lập một số tế bào có kích thước lớn nhờ vào các vi thao tác trên kính hiển vi, sau khi đã kiểm tra khả năng tạo bào tử của các chủng như đã trình bà y ở các phần

trên Phương pháp này có ưu điểm là cho phép đảm bảo các chúng thu được chỉ

phát triển từ một tế bào duy nhất Nếu các chủng thuần khiết được lai ghép theo kiểu cặp đôi bào tử ~bào tử hoặc tế bào —bào tử thì có thể sử dụng được các thao tác trên kính hiển vi (sử dụng các chủng lai đơn tính làm tế bào dinh dưỡng) để

làm việc nảy Khó khăn của phương pháp này là làm thế nào xác định được đâu

là khuẩn lạc lai, trừ khi có một số dấu hiệu được các chủng đơn bội biểu hiện ra

và có thể nhận thấy được các dấu hiệu đó trên khuẩn lạc của các tế bào lai Chỉ

cần có các dấu hiệu giống như trong phương pháp lai hiếm cũng thoả mãn được

yêu cầu này

15

1.2.2.3 Phương pháp phân lập các hợp tứ từ các hỗn hợp lai ghép

Có thể nói đây là phương pháp nhanh nhất để phân lập các hợp tử từ các hỗn hợp lai ghép Nó chỉ mắt khoảng từ 2-6 giờ sau khi trộn lẫn canh trường các

chủng cần lai ghép trong môi trường phức tạp, cho dù trong một số trường hợp

chỉ có thể thu được các hợp tử từ các hỗn hợp lai giữa các chủng sau khi phối

trộn với nhau ít nhất từ 24-48 giờ Các hợp tử riêng biệt có thể được phân lập từ hỗn hợp lai ghép bằng các vi thao tác trên kính hiển vi, cho dù các hợp tử này

không được cấy ra từ các phân tích bộ bốn hoặc từ các tế bào riêng rễ

1.2.2.4 Các kỹ thuật lai hiểm

Kỹ thuật này chủ yếu dựa trên các quan sát của Gunge và Nakatomi

(1971), thấy sự biến đổi kiểu giống xảy ra với tỷ lệ thấp & Saccharamyces

cerevisae, trong các tế bào đa bội hoặc có số bội cao hơn và đo đó dẫn tới sự xuất

hiện của các tế bào lai, nó sẽ thay đổi giới tính và hình thành các tế bào lai nếu

đồng thời có sự xuất hiện của các tế bào có giới tính khác nhau Phương pháp này

thích hợp cho việc tạo ra các chủng nấm men bia công nghiệp, chúng thường có

tí lệ tạo bào tử thấp hoặc hoàn toàn không tạo bảo tử và nó thường không có khả năng tạo bào tử cho dù một số loại nấm men khác lại có khả năng này Các chúng

đa bội hoặc có số bội nhiều hơn bị chuyên thành dạng có chứa ít bội hon bang bat

cứ phương pháp nào trong số các phương pháp, bao gồm xử lý bằng acriflavin

hay ethidium bromit, bằng cách bỏ đói các tế bào hoặc đơn giản hơn là phương

pháp pha loãng canh trường tế bào theo một tỷ lệ thích hợp trên môi trường thường dùng chứa trong hộp petri, nuôi ấm sau vàu ngày và lựa chọn các khuẩn

lạc nhỏ, các khuẩn lạc này sau đó sẽ được đem kiểm tra dé thấy được sự mất khả

năng phát triển của chúng trên môi trường có chứa cơ chất không có khả năng lên

men như glyxêrol và lactat Các chủng có kích thước nhỏ này sau đó được đem lai với một chủng lai dị dưỡng nào đó có thê là chủng đơn bội hoặc đa bội, của cả hai kiểu giới tính, như là trong mọi trường hợp chúng sẽ được trộn lẫn cùng với

l6

cả hai kiểu giới tính trong các chủng có kích thước nhỏ Các chủng lai sau đó sẽ được phân lập trên môi trường chon lọc

1.2.3 Tạo bào tử ở tế bào nắm men

Các chủng lai đa bội hoặc có số bội cao hơn sau khi thu nhận được tiếp tục

nuôi để tạo bào tử bằng nhiều biện pháp khác nhau, chủ yếu có liên quan tới sự phát triển của chúng trên môi trường có chứa CH;OOK, gìyxerol hay những chất

không có khả năng lên men khác Tạo bảo tử có thể được thực hiện trên các môi

trường có chứa các dung dịch axetat raffinoza Sự có mặt của các ion raffinoza làm kích thích quá trình tạo bào tử Hầu hết các chủng nắm men đều có khả năng

tạo bào tử rất tốt trên môi trường McClay Phát triển trên một môi trường tương

đối giàu các tiền chất tạo bào tử như là cao nấm men, pepton, glucoza là môi

trường thích hợp nhất Sự hình thành bào tử có thể diễn ra trong môi trường lỏng

hoặc rắn, hoặc trong nguyên sinh chất hoặc trong tế bào nguyên vẹn Việc đưa bảo tử vào trong nguyên sinh chất có ưu điểm mà các thể không tạo bào tử khi

đưa vào trong nguyên sinh chất có thể làm vỡ tung nguyên sinh chất bằng cách

bố sung thêm nước vào trong môi trường thấm thấu bào tử bền vững có thể được

sử dụng trong phương pháp này, các bào tử có thể được phân lập hoặc bằng vi thao tác trên kính hiển vi theo cách chia bốn tế bào trần hoặc theo phương pháp thu hồi, sự giải phóng hoặc loại bỏ các tế bào dinh dưỡng không tạo bào tử và là đối tượng của các phân tích bào tử ngẫu nhiên

1.2.3.1 Phân lập bào tử

Phân lập các bào tử một cách ngẫu nhiên Trong kỹ thuật này, rất cần phải

loại bỏ các tế bào dinh dưỡng không tạo bào tử Điều này có thể được thực hiện bằng cách tiêu giệt các tế bào đinh dưỡng này, hoặc bằng các biện pháp vật lý để

tách chúng từ các bào tử trong một số trường hợp

17

- Tiêu diệt các tế bào dinh dưỡng bằng nhiệt độ cao

Phương pháp này dựa trên khá năng chịu nhiệt tương đối cao của các bào

tử so với các tế bào dinh dưỡng không tạo bào tử thì không có khả năng này Tuy nhiên, ở các bào tử và tế bào đinh dưỡng khác nhau thì khả năng chịu nhiệt cũng

khác nhau, cho nên trong thực tế cần phải xác định nhiệt độ và thời gian cho mỗi chủng nghiên cứu Nhiệt độ được sử dụng thông thường thay đôi từ 54-60°C đối

với các chủng khác nhau

- _ Tiêu diệt các tế bào dinh dưỡng bằng ete dietyl:

Phương pháp này dựa trên sự nhạy câm khác nhau của các tế bào dinh

dưỡng và bào tử biểu hiện đối với ete dietyl

- _ Tạo bào tử trong nguyên sinh chất và phá vỡ các tế bào đình dưỡng:

Các chủng tạo nguyên sinh chất có thể phát triển trên môi trường tiền bào

tử, được chuyên vào nguyên sinh chất (xem phần nói về sự hình thành nguyên sinh chất) và sự hình thành bào tử của dịch huyền phù nguyên sinh chất, sau đó

nguyên sinh chất đó có thê bị nỗ tung, tạo ra địch huyền phù có chứa các bào tử

thuần khiết

- Phân tách tế bào dinh dưỡng và nang bào trong hệ thống hai pha (dầu khoáng — nước, dextran — polyethylen glycon) hoặc trong các gradien nồng độ

(renografin, urografin)

- Phân lập các bào tử từ các tế bào định dưỡng bằng cách tách phân đoạn

trong dâu khoáng (dầu khoáng — nước, dextran — polyethylen glycon) hoặc

gradien nỗng độ (renografin, urografn)

Phương pháp này dựa trên các tính chất ưa béo của thành bào tử Các bào

tử có thể được giải phóng ra khỏi các nang bào tử bằng cách nghiền với bột thuỷ

tinh, hoặc bằng cách xử lý với enzym như đã trình bày ở phần trên Các bào tử thu được bằng cách nghiền hoặc ngâm trong dầu khoáng thường kết chùm rất tốt, nhưng cũng có thể phân chia được bằng cách bổ xung dung dịch gelatin 15%

18

Các bào tử được giải phóng từ nang bào tử bằng phương pháp bổ xung enzim có

thể được tách ra nhờ các thiết bị siêu âm

- Phân tích nang bào từ va cdc té bào dinh dưỡng bằng gradien nông độ

Renografin

1.2.4 Phân tích bộ bốn

1.2.4.1 Phân tách tẾ bào thông qua thiết bị vi thao tác trên kính hiển vi

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại thiết bị vi thao tác khác nhau,

hau hết trong số chúng có thể được dùng để mỗ xẻ nang bào nắm men và phân

lập các nang bào tử đó Những thiết bị này được tạo ra để vi tiêm các tế bao động vật hoặc nguyên sinh thực vật, chúng có khả năng thao tác chậm hơn,

nhưng bù lại những thao tác này hết sức chính xác, có thể được sử dụng để mô

nang bào nấm men Vi thao tác trên kính hiền vi và phân lập các tế bào nấm men

và các nang bào tử theo các phương pháp thông thường này có thể coi là hữu hiệu Tuy nhiên, giải phẫu nang bào nắm men là một kỹ thuật tinh tế, trong thực

tế nó tương đối đễ học và bất kỳ một nhà nghiên cứu nào đều có thể nắm bắt

được phương pháp này Công cụ này được tạo ra để rút ngắn thời gian yêu cầu để

năm bắt được kỹ thuật này trong các nghiên cứu có liên quan tới di truyền nắm

men

1.2.4.2 Xác định quá trình phân ly sau giảm phân (phân ly diễn ra sáu nguyên

Quy trình này cần thiết phải được thực hiện bằng phương pháp đóng dấu

các dòng bào tử đơn bảo trực tiếp trên môi trường chọn lọc mà không làm lẫn lộn với các khuẩn lạc hoặc các bảo tử sau quá trình nảy chồi của các bào tử trên đấu vết mà chúng đã được cấy lên bề mặt môi trường trước đó sau khi phân tích Sự

phân ly sau giảm phân được diễn ra tại thời điểm đầu tiên ngay sau quá trình nảy

chỗi của các bào tử, do vậy kết quả là thu được một khuẩn lạc riêng lẻ Ké từ đây

19

các bảo tử riêng lẻ không thể được lấy ra từ một vệt trên đĩa và sự biểu hiện của

các dấu hiệu đặc trưng cho các nhiễm sắc thể khác nhau được xác định, ngoại trừ

những trường hợp rất khó xác định Phương pháp tốn ít sức lực nhất này được sử

dụng để giải phẫu tích các nang bào trực tiếp trên bề mặt thạch trong hộp peptri

được sử dụng như một phương pháp chủ đạo, hơn là so với trên một phiến kính

rồi sau đó mới chuyển lên bề mặt môi trường trong đĩa No các thể được thực hiện băng hai cách khác nhau :

- _ Phẫu tích trên bề mặt đĩa mở để ngửa

- _ Phẫu tích trên bề mặt đĩa mở đặp úp

1.2.5 Các chúng nấm men quan trọng trong sản xuất rượu vang

1.2.5.1 Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae var ellipsoideus; S

Saccharomyces cerevisiae co kha năng bat đầu quá trình lên men rất nhanh chóng và cũng biến mất rất nhanh ở cuối quá trình này Trong quá trình tàng trữ, người ta hầu như không nhận ra sự có mặt của các chủng nam men thuộc loài

này Chịu được độ cồn cao tir 8-15% v/v là một ưu điểm quan trọng nhất của loài

S cerevisiae Điều đó cho phép chúng có thể sinh ra tới 18-20%v/v cồn, sau quá

trình lên men chính Hơn nữa, chịu được độ cồn cao cho phép chúng chiếm ưu

thé trong suốt quá trình lên men, đặc biệt là ở giai đoạn cuối Chẳng hạn như,

trong thời gian đầu tiên của quá trình lên men tự nhiên rượu vang các loài nam

men Hanseniasspora uvarum và Kleokera apicula thường phát triển rất mạnh

nhưng do không chịu được độ cồn cao nên chúng dẫn bị thay thế bởi nắm men S.cerevisiae Bên cạnh đó một số chủng S.cerevisiae còn có khả năng tạo hương

thơm rất đặc trưng nhờ vào khả năng sinh tổng hợp mạnh các loại este và rượu

bậc cao Do vậy, đây chính là loài nấm men được sử dụng phổ biến nhất trong

công nghiệp sản xuất rượu vang Ví dụ như trong số các chủng nắm men phân lập

được từ rượu vang vùng Gironde thì có tới 80% thuộc loài này, đặc biệt là có tới

20

98% trong số chúng được tìm thấy ở cuối quá trình lên men Theo Maugenet

(1980) ŠS.cerevisiae có khả năng lên men ngay cả các loại nho chất lượng thấp để

tạo ra các loại rượu vang có giá trị cảm quan cao [2,10,14,15]

chủng thuộc loài này có thể đạt tương đương với S.cerevisiae là 18-20%v/v Ở

giai đoạn cuối của quá trình lên men, S.vizi két ling rất nhanh và có tác dụng làm trong rượu Hơn nữa, loài này còn có thể tạo ra các chất dễ bay hơi đặc trưng cho

hương thơm của rượu vang thành phẩm Chính vì vay ma S.vini la loai nim men cũng rất được ưa chuộng trong quá trính sản xuất rượu vang

1.2.5.3 Saccharomyces oviformis

S.oviormis cha yéu tập trung trong dịch nho ép để cho lên men tự nhiên

Nắm men này có hình dạng giống với S.viui nhưng lại không được sử dụng phổ biến bằng Chúng phát triển tốt trên môi trường dịch quả, đặc biệt là nước nho

Do có khả năng lên men dịch đường có nồng độ cao nên chúng có thể được dùng

để sản xuất rượu vang khô chứa tới 18%v/v cồn và có chất lượng hảo hạng

[15,23]

1.2.5.4 Saccharomyces bayanus (S.beticus, S.cherieris, S.rouxii)

Đây chính là loài nắm men đóng vai trò kết thúc quá trình lên men tự

nhiên do hàm lượng cồn mà chúng sinh ra có thể lên tới 19%v/v Hầu hết trong

21

số chúng được tìm thấy ở cuối quá trình lên men Chính vì vậy, Š.bayanws

thường được sử dụng cho quá trình lên men lại các loại đường sót trong trường lên men y va để lên men dịch ép nước nho chín có độ đường cao Hơn nữa, các

chủng nắm men thuộc loài này có khả năng chịu SO; tương đối cao (100mg/l) va

đây chính là lý do dé sử dụng chúng trong hầu hết các quá trình lên men lại rượu

vang trắng và rượu vang ngọt nhưng chúng có một nhược điểm là tạo ra một lượng lớn axit axetic gây vị chua gắt cho vang Trước đây, người ta sắp xếp

S.bayanus va loai S.cerevisiae do chúng có một số đặc điểm giống nhau [15, 19,

23] Tuy nhiên, theo Belin (1980) thì đây là hai loài hoàn toàn khác nhau do chúng có đặc tinh sinh hoá rất khác nhau, đặc biệt là S.bayanws có khả năng phát triển trên các lớp màng của rượu vang và chúng không có khả năng lên men

đường galactoza Các chủng nấm men thuộc loài S.ðeficws, S.cheriersis eũng

được sử dụng trong sản xuất rượu trắng (sherry) Chúng phát triển trên bễ mặt

của rượu vang gốc (có bố sung thêm cồn) nhờ vào cơ chế hô hấp bằng cồn của

chúng đề tạo ra một hàm lượng axetaldehit, este va phân giải axit axetic [2,11]

1.2.5.5 Saccharomyces chevalieri (S.fructurum, S.limdneti)

Cũng có một số đặc tính sinh lý như của S.cerevisiae, các chủng nấm men

thuộc loài này cũng được sử dụng tương đối phổ biến trong công nghiệp sản xuất _ rượu vang Chúng ta hay thấy chúng trong dịch ép nước nho lên men hoặc vang non Do không có kha năng lên men đường maltoza nên các chủng nấm men nay thường có hiệu suất lên men thấp hơn so vdi S cerevisiae Tuy nhién, ching van tạo ra một lượng cồn đáng kể là 16% sau khi kết thúc quá trình lên men Rất khó

có thể phân lập thuần chủng được các nấm men thuộc loài này do chúng có liên

quan mật thiết với loài S vinw Mỗi chủng nấm men Š$ cheval¿eri khác nhau lại thích nghi và phát triển trên môi trường dịch quả khác nhan, cho nên độ côn chúng đạt được ở cuối quá trình lên men cũng rất khác nhau từ 13-18%v/v

[15,21,22]

22

1.2.5.6 Saccharomyces rosei (Toruaspora rosei)

Loài nắm men hình cầu này phát triển rất chậm trên môi trường nước quả

và được tìm thấy trên bề mặt quả nho và dịch ép nước nho Chúng cũng là

nguyên nhân của quá trình lên men tự phát dịch nước nho Đặc biệt là ở các vùng khí hậu nóng Khả năng tạo cồn của chúng rất khác nhau, thay đổi từ 6 đến 10 % v/v giữa các chủng Điều này giải thích tại sao chúng lại vắng mặt sau quá trình lên men rượu vang Không giống với các chủng nắm men Š.cerevisiae tạo ra

nhiều axit axetic khi lên men trong môi trường pH thấp S rosei lai chi sinh ra

một lượng rất nhỏ axit này, khoảng 0,04g/1 Đặc tính này đã được sử dụng trong

kỹ thuật lên men nhằm hạn chế sự tạo thành các loại axit bay hơi trong rượu vang

từ dịch ép nước nho có độ chua cao Trong một số trường hợp, ở ngày thứ tư của quá trình lên men hay cuối pha sinh trưởng của Š.rosei người ta đã cấy bổ sung

nam men S.cerevisiae dé lén men đường sót của vang non nhằm tạo ra rượu vang

chất lượng cao Mới đây, người ta đã sử dụng nắm men này để hoàn thành quá trình lên men rượu vang được tiến hành bởi Botrytis cinerea trước đó

Nông độ axit thấp thu được sau quá trình lên men là do $ rosei sinh ra it axit axetic và sự phát triển của S.rosei trong môi trường tạo điều kiện làm giảm

tốc độ của quá trình lên men glycerol, axit pyruvic trong qua trinh lén men của S.cerevisiae hay S.bayanus trong môi trường này S.rosei có quan hệ gàn gũi với

S.capenris do chúng có một số đặc tính sinh lý giống nhau [11,15]

1.2.5.7 Saccharomyces uvarum (S.carlsbergensis )

Nam men nay hay được bắt gặp trong bia, nhưng cũng có trong dịch nước nho Chúng có hình dạng không khác nhiều so với các chủng nắm men khác và

có khả năng sinh bào tử mạnh trên môi trường thích hợp và bị ức chế bởi

23

actidion Khả năng tạo cồn của chúng ở mức trung bình từ 12-13%v/v Một số

chủng thuộc loài này có khả năng tạo SO; trong quá trình lên men [11,15] -

1.2.6 Các chúng nắm men gây hư hỏng rượu vang

1.2.6.1 Saccharomyces ludwigii

Kích thước của tế bao lớn nhất của loài nắm men hình thoi này có thé dat

tới 25um và nảy chồi ở hai đầu Chúng có mặt với một số lượng rất nhỏ trên vỏ quả nho, thỉnh thoảng gặp ở dịch nước nho đã được sulffit hóa Nó có thể lên

men dịch đường đề tạo ra được 16,8%v/v cần và chịu được hàm lượng SO, rất có khoảng 600mg/1 Chúng có khả năng tạo axêton rất mạnh và có thể sinh ra 200

mg/1 axetandehit trong quá trình lên men ky khí Đây là vi sinh gat hu hỏng rượu

nguy hiểm nhất Sau vài tuần, chúng tạo ra kết tủa và lắng xuống đáy chai và kết tủa này rất khó bị phá vỡ làm cho CO; không thể thoát ra được [15,21,22,23]

1.2.6.2 Brettanomyces vini (B.intermedius,B.schanderlii)

Tế bào kéo dài có xu hướng kết thành chuỗi Nó được tìm thấy trên lớp

váng của rượu hỏng, rượu hoa quả và rượu vang có ga và trên thành của thùng

ruou B.vini chịu được môi trường có độ côn lên tới 15%v/v nhưng lại không có

khả năng sống sót khi hàm lượng SO; vượt quá 176mg/1 Khi lên men trong môi

trường hiếu khí nó tạo ra một lượng lớn rượu isobutylic, caproic, isovaloric và ethy axetat (hàm lượng este và đặc biệt trong điều kiện hiểu khí, lớn hơn 76mg)

Sự phát triển của các chủng nấm men thuộc loài này làm cho rượu vang có mùi

tương tự như acxetamit và được Ribereau Gayon gọi là mùi chuột Nó là một

trong những chủng nắm men thường gây hư hỏng rượu cần được quan tâm giải

quyết [15,22]

1.2.6.3 Zygosaccharomyces (S bailii, S.acidofilus, S elegans)

Chung nam men nay được phân lập từ quả nho, nhưng nó được tìm thấy

chủ yếu trên trường của các hầm rượu Khả năng chịu cồn và SO; cao làm cho

24

chủng nắm men này là nguyên nhân chính gây ra quá trình lên men lại các loại rượu vang ngọt Các chủng nắm men có hoạt tính fructoza mạnh nên có khá năng lên men fructoza mạnh hơn glucoza Ribereau Gayon cho rằng đây chính là một

số chủng nắm men gây hư hỏng rượu vang mặc dù chúng không sinh ra các hợp

chất dé bay hơi không mong muốn [15,23]

1.2.6.4 Turulopsis stellata (T bacillaris)

Có thể phân biệt các chủng nắm men nảy trong môi trường lỏng nhờ sự xuất hiện của nhiều chồi mọc xung quanh tế bào mẹ tạo thành hình sao và trên

môi trường rắn chúng có dạng hình que của nó Đôi khi người ta có thé tim thay

chúng trên vỏ quả nho, đặc biệt là nho chín nơi chịu sự thống trị của các chủng thuộc loài Botrytis cinerea 70% số chủng thuộc loài T: stellata duge Domercq

phân lập ở Gironde và chúng còn được tìm thấy trong các vườn nho của Italia T.stellata và Hanseniaspora uarum hay xuất biện trong những ngày đầu tiên của quá trình lên men tự nhiên và có khả năng tạo cồn yếu (trung bình 10%w/ ), thường biến mất ở cuối quá trình lên men đo chúng không có khả năng chịu cồn

cao Loai nam men có khả năng chịu nhiệt rất tốt (30-35°) và có khả năng lên men đường fructoza nhanh hơn glucoza [15,23]

1.2.6.5 Hanseniaspora uvarum va dang bat todn của nó là Kloecketa

apiculata

Các tế bào thuộc loài này đều rất nhỏ và có hình tròn như quả chanh và

cũng được nhận ra bằng chổi mọc ở hai đầu Loài này chiếm 15% khu hệ vi sinh vật trên vỏ quả nho Cho dù các chúng nam men này chịu trách nhiệm chính cho quá trình lên men tự nhiên dịch nước nho ép nhưng do chỉ chịu được độ cồn thấp

từ 3,7-6,43%v/v nên chúng nhanh chóng bị thay thế bởi các chủng nắm men khác

trong quá trình lên men

25

Chúng tạo ra nhiều axit axetic, trung bình là 1g/I va ethyl axetat là 125 — 374mg/l cũng như là amyl axetat và glyxerol Một số tác giả cho rằng nó tạo

hương quả trong rượu vang, theo một số khác thì do tạo ra nhiéu ethy! axetat nên

nó gây ra mùi khó chịu cho vang

Bảng L.5 -Các đặc tính khác nhau của moãt soá chung nadm men rééiu [15]

Ching Hinh thai Lên men các loại đường Su hap thu các loại đường

GL | Ga |Ma| S$ |LỊ R |T|Ga|Ma| S|L|RỊIT Saccharomyces Hinh + + + + |- | |+-| + + |+]-| tịỊ+ cerevisiae trứng

Saccharomyces Hinh + - + + }-] 13] +] - + pt) - +] +

Saccharomyces rosei Ì Hình + - ˆ tye) V3) +) - | te pr] ep ryt

trứng Saccharomyces Hinh + | +- | +] + |- | + |d+-| + + |+|-|+l|+

Zygosaccharomyces | Hinh + - - | + |- | + |+|+- ~ tte | | + | +e

trứng Torulopsis stellata Chôi + ˆ - + |- | +|-¬ | - - | +|- | + ¬

membranaefaciens khuẩn ty

Schizosaccharomyces | Hinh tru + : + | + |-]|1⁄3] - | - + ]J+|- | +]|~-

1.3 QÚA TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG

Lên men là giai đọan chuyển hóa dịch đường thành rượu vang dưới tác

dụng của nắm men thông qua quá trình trao đổi chất của chúng Quá trình phức tạp nhất và quan trọng nhất ở giai đoạn này là quá trình lên men rượu ở các loại

đường có trong dịch quả Song song với quá trình lên men rượu và trong quá trình tàng trữ , trong dịch lên men còn xảy ra nhiều phản ứng sinh lý, sinh hóa,

26

hóa học và lý học phức tạp khác Sản phẩm của các quá trình này làm nên hương

vị đặc trưng của rượu vang [21]

1.3.1 Quá trình lên men chính

Lên men chính là giai đoạn lên men rượu bởi nam men được tiến hành ở nhiệt dé cao 18-30°C trong thời gian từ I-2 tuần Bản chất của giai đoạn này là

quá trình chuyển hóa đường thành rượu và giải phóng CO; dưới tác dụng xúc tác của enzyme do nắm men tạo ra theo phương trình tổng quát sau:

C¿ằH;; O¿ + 2ADP + 2H ;PO¿ = 2C; H;OH + 2CO; + 2ATP + HO

Thực chất đây là quá trình oxy hóa khử đường nhờ hệ enzym của nấm

men Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của nấm men hoặc bị tiêu

hao dưới dạng nhiệt Quá trình lên men rượu là quá trình tỏa nhiệt Vì vậy nhiệt

độ trong các tank đang lên men có dung tích lớn thường cao hơn nhiệt độ môi trường tới 10°C.Quá trình lên men xảy ra trong điều kiện yếm khí, cơ chất bị oxy

hóa chỉ do hydro bị tách ra Sự vân chuyển hydro trong chuỗi các phản ứng đã

làm cho một số sản phẩm lên men bị oxy hóa nhiều hơn trong khi một số khác lại

bị khử nhiều hơn lúc ban đầu Một số các sản phẩm lên men được tạo thành bằng

cách ngưng tụ các hợp chất trung gian [21]

Trong quả nho và nhiều loại quả khác, hầu như không có đường sacaroza

mà chỉ thấy có đường khử Vì vậy nếu sử dụng dịch lên men hoàn toàn từ dịch ép

quả thì rất thuận lợi cho quá trình lên men

Đề đạt độ rượu theo ý muốn, người ta thường bổ sung một lượng nhất định

sacaroza vào dịch lên men để thực hiện một quá trình lên men bỗ sung Đường

sacaroza mau chóng được enzyme inverfaza của nắm men chuyển thành đường

khử và tiếp tục chuyển hóa thành rượu Tuy nhiên, việc bổ sung nhiều sacaroza

sẽ không có lợi cho hương vị của sân phẩm 19]

Sản phẩm thu hồi từ quá trình lên men rượu vang rất phức tạp, ngoài etytic, CO; còn có rất nhiều chất khác (gọi là sản phẩm bậc hai) như rượu bậc

27

cao, dầu fusel, axit axetic, axit pyruvic, axeton, diacetyl, cac este và axit bay hơi

Chúng là các chất giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành hương vị đặc

trưng cho vang

- Theo Dupin: khi lên men 180g đường sẽ thu được: 83,óg CO; +8§7,4g C;H;OH + 0,4g dầu fusel + 6g glyxerin + 0,3g axit lactic + 0,1g axetaldehyt

- Theo Pasteur: nếu lấy đường trong dịch lên men là 100% thì sau khi lên

men sẽ thu được:44,4%CO; + 46,36% rượu + 3,3 % glyxerin + 0,6% axit sucxinic + 1,1 % axit lactic va axit axetic [15,21]

1.3.2 Lén men phu

Lên men phụ là quá trình làm chín rượu vang được thực hiện bởi các tế

bào nắm men còn sót lại sau khi kết lắng Quá trình này tiếp tục lên men các cơ

chất còn sót lại và chuyển hóa rất nhiều thành phan khác có trong vang non Bên cạnh đó, tự trong bản thân rượu vang còn xảy ra các biến đổi sinh hóa nhờ enzim

hoặc không nhờ enzim để ôn định chất lượng của rượu vang, tạo cho vang có

hương vị hài hòa đặc trưng Trong qui trình sản xuất một số loại rượu còn có cả

giai đoan lên men malolactic nho vi khudn lactic nhu: Pediococcuss,

Leuconostoc, Lactobacillus Trong thanh phan cia qua nho, do ham luong axit

malic kha cao (2-15g/lít ) làm cho sản phẩm bị chua gắt, khó chịu [15,19] Ở giai

đoạn lên men phụ, axit malic được chuyển hóa thành axit lactic va CO, theo

phương trình tông quát dưới đây:

HOOC-CH;-CHOH-COOH —* H;C-CHOH-COOH + CO,

Kết quả là sản phẩm có vị chua hài hòa hơn Ngoài ra, theo Amerine và

cộng sự (1965): axit citric xó trong quá cũng được chuyển hóa thành các cầu tử

thơm cho rượu vang như: các hợp chất điaxetyl, axeton, 2,3 butylen- giycol làm tăng hương vị vang.Tuy nhiên, quá trình lên men malolactic cho đến nay

cũng vẫn còn là vấn đề phải tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa Không nhất thiết

28