NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYM TRONG CHẾ BIẾN MỘT SỐ NÔNG SẢN THỰC PHẨM

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYM TRONG CHẾ BIẾN MỘT SỐ NÔNG SẢN THỰC PHẨM

Bộ khoa học và công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Báo cáo tổng kết Khoa học và kỹ thuật Đề tài cấp nhà nớc Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản thực phẩm Mã số : KC 04 07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nớc : PGS. TS. Ngô Tiến Hiển Đề tài nhánh cấp nhà nớc Nghiên cứu công nghệ sản xuất một số loại dầu béo bằng lipaza Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nớc : PGS. TS. Đặng thị Thu Hà Nội, 10 2004 Bản thảo viết xong tháng 09 2004 Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện đề tài cấp nhà nớc, mã số : KC 04 - 07. Danh sách ngời thực Hiện STT Họ và tên Cơ quan công tác Mục 1 Đặng Thị Thu Đại Học Bách Khoa HN 2 Quyền Đình Thi Viện CNSH TTKHTN và CNQG 3 Phùng Thị Thuỷ Đại Học Bách Khoa HN 4 Hoàng Lan Đại Học Bách Khoa HN 5 Đỗ Biên Cơng Đại Học Bách Khoa HN 6 Thiều Linh Thuỳ Đại Học Bách Khoa HN 7 Nguyễn Thị Sánh Đại Học Bách Khoa HN Tóm tắt nội dung Lipase (EC 3.1.1.3) l enzym đợc ứng dụng trong nhiều ngành nh cụng nghip thc phm, cụng nghip hoỏ hc, cụng nghip m phm, cụng nghip da, trong y dc v cỏc ngnh cụng nghip khỏc do có khả năng xúc tỏc thu phõn triglyxerit thnh di, mono glyxerit hoc glyxerol v cỏc axit bộo nh hot ng trờn b mt phõn pha du nc. Trong cụng nghip du v cht bộo, vic s dng lipase ó rt ph bin. Cú khong hn 100 loi lipase khỏc nhau c dựng chuyn i lipit thnh cỏc cht khỏc Hin nay, Vit Nam ó s dng mt lng ln lipase trong ngnh cụng nghip thc phm, cụng nghip ty ra, hoỏ hc, y hc song cỏc ch phm lipase ang s dng phn ln l nhp khu. Do vy, mục đích của đề tài tập trung nghiên cứu thu nhận và sử dụng hiệu quả lipase từ hai đối tợng là nấm men Candida rugosa và Bacillus sp Phơng pháp nghiên cứu - Vi sinh vật đợc nuôi cấy theo phơng pháp nuôi chìm cả 2 chủng Candida rugosa và Bacillus sp trên máy lắc lc n nhit Shellab và trên thiết bị lên men 2 lít. - Xác định hoạt độ lipase bằng phơng pháp chuẩn độ. - Cố định lipase trên nylon 6 bằng liên kết đồng hoá trị. - Tách và tinh chế lipase bằng etanol và sắc ký trao đổi ion DEAE cellulose. - Bằng phơng pháp toán học thực nghiệm tối u môi trờng nuôi cấy theo mô hình bậc 1 của Box Wilson. - So sánh sản phẩm phomat đợc chế biến có bổ sung lipase và không bổ sung lipase bằng phơng pháp cảm quan thực phẩm. Đề tài đã thu đợc những kết quả chính sau: - Tìm đợc điều kiện nuôi cấy tối u cho sinh tổng hợp lipase từ Candida rugosa cho một lít là: Môi trờng nuôi gồm: KH2PO4: 15 g; K2HPO4:5,5 g; (NH4)2SO4:4g; MgSO4:1g; FeCl3:10m g; inositon: 0,004mg; biotin: 0,008mg; Thiamine.HCl: 0,2mg; Dầu oliu: 1%; axit palmitic: 1.2 g; H2O: 1000ml; Số tế bào nấm men cấy ban đầu: 2,6.10 6 tb/ml canh trờng; Thời gian nuôi: 40 giờ - Tìm đợc điều kiện nuôi cấy tối u cho sinh tổng lợp lipase từ Bacillus sp là: môi trờng BMGY với thành phần: (1% (w/v) cao nấm men, 2% (w/v) bacto-peptone, 100 mM kali phosphate, pH 7.0, 4 x 10-5% (w/v) biotin và 1% (v/v) methanol) ở 30C lắc 220 vòng/phút - Nồng độ cồn thích hợp cho kết tủa thu lipase là 90%. Lipase sau kết tủa cồn cho chạy sắc ký trên sc ký cho thy lipase sau khi qua ct trao i ion DEAE - cellulose xut hin 3 pick. Tin hnh xỏc nh hot lipase cỏc phõn on. Kt qu cho thy ch cú pick 1 v pick 3 cú hot tớnh lipase (69UI/ml v 77UI/ml) và Lip1 v Lip3 cú khi lng phõn t l 58 v 62 kDa. Lipase sau cỏc bc lm sch: kt ta etanol, sc ký trao i ion DEAE Cellulose thu c ch phm cú hot riờng 55,16 U/mg protein, mc tinh sch l 12,5 ln; hiu sut thu hi l 37,06%. - ó kho sỏt c cỏc iu kin ti u c nh lipase trờn Nylon-6 ú l: nng HCl cht mang l 3,5N; glutaraldehit l 10%, nng lipase em c nh l 1mg/ml (550U/ml); s dng dung dch m phosphat pH 7,7. - ó xỏc nh mt s c tớnh ca lipase c nh trờn Nylon-6 Nhit ti u l 70C, bn vựng nhit 40 - 60C, sau 18 gi hot cũn li l 52,4 66,7%. pH ti u l 7,0; bn vựng pH 7 - 7,5; sau 18 gi hot cũn 50,6 - 57%. - ó xỏc nh mt s c tớnh ca lipase tan t Candida rugosa Nhit ti u l 60C, bn vựng nhit 40 - 50C, sau 18 gi hot cũn li l 50,2 - 59%. pH ti u l 8,0; bn vựng pH 7,5 - 8,0, sau 18 gi hot cũn 53,9 - 62%. im ng in ca lipase l pI = 7,5 nh hng ca cỏc ion kim loi n hot tớnh ca lipase: - Ion Pb 2+ c ch mnh (lm gim hot ti 33,26%) - Cỏc ion Cu 2+ , Fe 3+ , Zn 2+ c ch yu (lm gim hot tớnh 13%) - Cỏc ion Na + , K + khụng nh hng. - Cỏc ion Mg 2+ , Ca 2+ cú kh nng hot hoỏ lipase. - Một số đặc tính lipase từ Bacillus sp Tính đặc hiệu cơ chất đối với tributyrin là cao nhất: 101 U/ml. Nhiệt độ tối u là 70C (91,1 U/ml). Lipase có độ bền nhiệt, sau 24 giờ hoạt tính vẫn còn 63%. pH 9,5 là thích hợp nhất cho phản ứng, hoạt tính đạt 108,1 U/ml. pH 9,0 đệm Tris-HCl và pH 10,0 đệm glycine không ảnh hởng tới độ bền của lipase, hoạt tính còn lại vẫn đạt 117%. Ca 2+ tăng hoạt tính lipase lên 10-12%, ngợc lại K 1+ , Mg 2+ , Fe 3+ giảm hoạt tính lipase từ 11-42%. Các dung môi hữu cơ đều giảm hoạt tính lipase. Acetone, 2-propanol và ethanol giảm một nửa, methanol giảm một phần t. Các chất tẩy ảnh hởng lên hoạt tính lipase. Triton X-100 tăng hoạt tính lên 63%. Tween 20 giữ nguyên hoạt tính (107%). Tween 80 giảm một nửa. Còn SDS kìm hãm hoạt tính lipase 3%. - ó kho sỏt kh nng thuỷ phân dầu đậu tơng của lipase cố định thu đợc dầu có chỉ số axit đạt 80,5. - Sử dụng lipase trong sản xuất phomat kết quả cho thấy phomat có bổ sung lipase đã làm tăng các chỉ tiêu chất lợng cảm quan (màu sắc, hơng thơm, .)so với sn phm phomat khụng b sung lipase MC LC Mở đầu TNG QUAN TI LIU . 1.1. Các nguồn thu lipase 1.2. các yếu tố ảnh hởng đến khả năng sinh tổng hợp lipase 1.2.1. ảnh hởng của thành phần môi trờng dinh dỡng . 1.2.2. ảnh hởng của điều kiện nuôi . 1.3. Cu to ca lipase: . 1.3.1. Khi lng phõn t 1.3.2. Trỡnh t axit amin, cu trỳc khụng gian 1.4.Một vài đc tớnh ca lipase . 1.4.1.Cht hot hoỏ v cht kỡm hóm 1.4.2. Tớnh c hiu c cht 1.4.3. C ch ng hc xỳc tỏc ca lipase 1.4.4. Nhit v pH hot ng ca lipase 1.5. Tỏch tinh ch lipase 1.6. Cỏc phng phỏp c nh lipase . 1.6.1. Phng phỏp gn enzym bng liờn kt ng hoỏ tr 1.6.2. Phng phỏp gúi enzym trong khuụn gel 1.6.3. Phng phỏp hp ph vt lý trờn cỏc cht mang cú cha hoc khụng cha in tớch. 1.7. ng dng ca lipase 1.7.1. Trong cụng nghip sn xut cỏc cht ty ra . 1.7.2. Trong cụng nghip thc phm. 1.7.3. Trong cụng nghip dc v hoỏ cht . 1.7.4. Trong cụng nghip thuc da 1.7.5 Trong cụng nghip m phm. NGUYấN LIU V PHNG PHP . 2.1. Nguyờn liu . 1 2 2 3 3 5 5 5 6 8 8 9 11 12 12 14 14 15 16 16 17 17 18 19 19 20 20 2.1.1. Chng vi sinh vt 2.1.2. Cht mang Nylon-6 2.1.3. Hoỏ cht 2.1.4. Thit b s dng. 2.1.5. Mụi trng nghiờn cu. 2.2. Phng phỏp nghiờn cu 2.2.1. Phng phỏp vi sinh vt . 2.2.2. Phng phỏp hoỏ sinh KT QU V THO LUN . 3.1. Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp thu lipase 3.1.1. Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp thu lipase từ Candida rugosa 3.1.1.1. Khảo sát ảnh hởng của thời gian nuôi tới sinh tổng hợp lipaza . 3.1.1.2. Khảo sát ảnh hởng của tốc độ lắc đến quá trình sinh tổng hợp lipaza 3.1.1.3. Khảo sát ảnh hởng của nguồn cacbon đến sinh tổng hợp lipaza . 3.1.1.4. Khảo sát ảnh hởng của nồng độ axit palmitic đến sinh tổng hợp lipaza . 3.1.1.5. Tối u hoá điều kiện nuôi chìm Candida rugosa 3.1.2.Tìm điều kiện nuôi thu lipase từ Bacillus sp 3.2. Tỏch tinh ch lipase từ Candida rugosa 3.2.1. Kho sỏt nng etanol thớch hp kt ta lipase 3.2.2. Tinh sch lipase bng phng phỏp sc ký trao i ion trờn h thụng FPLC 3.3. Kho sỏt cỏc iu kin ti u c nh lipase t Candida rugosa trờn Nylon-6. 3.3.1. nh hng ca nng HCl x lý ht n kh nng c nh enzym lipase 20 20 20 20 21 22 22 22 25 25 25 25 25 26 26 27 31 32 32 34 35 36 3.3.2. nh hng ca nng glutaraldehit n kh nng c nh enzym 3.3.3. nh hng ca nng enzym n kh nng c nh enzym . 3.3.4. nh hng ca dung dch m n kh nng c nh enzym lipase 3.4. Xỏc nh mt s c tớnh ca Lipase 3.4.1. Một số đặc tính của lipase tự do và cố định từ Candida rugosa 3.3.1.1. nh hng ca nhit ti hot lipase từ Candida rugosa 3.4.1.2. nh hng ca nhit ti tớnh bn lipase t do v c nh . 3.4.1.3. nh hng ca pH ti hot lipase t do v c nh 3.4.1.4. nh hng ca pH ti tớnh bn lipase t do v c nh 3.4.1.5. nh hng ca ion kim loi ti hot lipase t do 3.4.1.6. Xỏc nh im ng in ca lipase . 3.4.2. Một số đặc tính của lipase Bacillus-sp 3.5. KHO ST KH NNG NG DNG LIPASE từ Candida rugosa . 3.5.1. Kho sỏt kh nng thu phõn du vi lipase c nh 3.5.2. Kho sỏt kh nng s dng lipase tan trong sn xut phomat KT LUN . TI LIU THAM KHO . 36 37 38 40 40 40 41 43 45 47 49 50 55 55 56 59 62 Mở đầu Lipase l enzym xỳc tỏc thu phõn triglyxerit thnh di, mono glyxerit hoc glyxerol v cỏc axit bộo nh hot ng trờn b mt phõn pha du nc. Lipase (EC 3.1.1.3) l enzym linh hot cú th s dng xỳc tỏc nhiu loi phn ng khỏc nhau, cú kh nng chu kim, chu nhit. Chớnh vỡ th, lipase c ng dng rng rói trong cụng nghip nh cụng nghip thc phm, cụng nghip hoỏ hc, cụng nghip m phm, cụng nghip da, trong y dc v cỏc ngnh cụng nghip khỏc[2]. Lipase đợc phân bố ở cả động vật, thực vật và vi sinh vật, song trong công nghiệp nguồn thu lipase lớn nhất là từ vi sinh vật. Trong đó cả nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và xạ khuẩn đều có khả năng tổng hợp lipase. Vo những năm cuối thế kỷ XX, tổng sản lợng các loại enzym ton th gii vo khong 1300 tn/nm[3]. Th trng th gii v enzym cụng nghip trong nm 1994 c tớnh khong 1 t ụla M, trong ú lipase chim 7% (70 triu) [sheldon, 1996]. Trong cụng nghip du v cht bộo, vic s dng lipase ó rt ph bin. Cú khong hn 100 loi lipase khỏc nhau c dựng chuyn i lipit thnh cỏc cht khỏc[13]. Hin nay, Vit Nam ó s dng rt ph bin lipase trong ngnh cụng nghip thc phm, cụng nghip ty ra, hoỏ hc, y hc v cn mt lng ln lipase, song cỏc ch phm lipase ang s dng phn ln l nhp khu. Do vy, đề tài tập trung nghiên cứu thu nhận và sử dụng hiệu quả lipase từ hai đối tợng là nấm men Candida rugosa và Bacillus sp Tæng quan 1.1. CÁC NGUỒN THU LIPASE (EC.3.1.1.3) Lipase được phân bố rộng trong các loài vi sinh vật, động vật và cả ở thực vật. Ở người và động vật có xương sống, nhiều lipase kiểm soát sự thuỷ phân, sự hấp thụ, sự tạo thành chất béo và chuyển hoá lipoprotein. Lipase động vật chia làm 3 nhóm dựa trên vị trí và hoạt động của chúng: lipase thực phẩm, lipase mô và lipase sữa. Ở thực vật, lipase được tìm thấy ở mô dự trữ của hạt dầu, hạt ngũ cốc trong quá trình nảy mầm của hạt. Hầu hết các lipase không hoạt động trong thời kỳ ngủ đông, ngoại trừ lipase tìm thấy ở hạt đậu caston[16]. Lượng lớn lipase trong công nghiệp được sản xuất từ các loại vi sinh vật: vi khuẩn, nấm mốc, nấm men[10]. Vi khuẩn: Lipase ngoại bào của Streptomyces rimous R6554 W được tách từ dịch lọc canh trường bằng sắc ký cột. Streptomyces là vi khuẩn đất Gram (+) thể hiện khả năng đặc biệt đối với sự tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và sử dụng lipase thuỷ phân ngoại bào để phá huỷ nguyên liệu hữu cơ trong môi trường sống tự nhiên. Tuy nhiên cho đến nay, chỉ có một vài lipase Streptomyces đã được xác định hoạt tính[10]. Ngoài ra, người ta cũng đã tìm thấy lipase có trong một số loài vi khuẩn khác như Pseudomonas cepacia có hoạt tính ngay ở nhiệt độ cao, trong môi trường kiềm và kỵ nước[5]. Nấm mốc: Lipase được tìm thấy ở một số loài như: Aspergillus, Rhizopus (tách từ quả dừa), Rhizopus oryzae (phân lập từ dầu dừa), Pythiumnltimum (trong dung dịch hữu cơ, không có nhũ tương), và Mucor sp humicola lamuginosa[6]. Nấm men: Nấm men Candida rugosa là một nguồn sản xuất lipase quan trọng. Các đặc tính xúc tác cấu trúc hoá sinh của lipase trong loài nấm men Candida rugosa đã được công bố trên nhiều tài liệu[7]. Có ít nhất 7 [...]... dng lm cht mang cho vic c nh lipase Trong quỏ trỡnh c nh s dng glutaraldehit 10% , nng HCl 3,5N x lý ht v nng enzym l 1mg/ml trong m photphat 7,7[23] 1.6.2 Phng phỏp gúi enzym trong khuụn gel Nguyờn tc ca phng phỏp ny l gúi enzym vo trong khuụn gel bng cỏch trựng hp hoỏ gel khi cú mt ng thi gel v enzym Sau khi kt thỳc quỏ trỡnh trựng hp ca gel thỡ enzym c gúi trong cỏc khuụn gel ú Gel thng s dng... PHNG PHP C NH LIPASE Enzym c nh l nhng enzym c gn lờn trờn nhng cht mang khụng ho tan hoc cỏc enzym c liờn kt li vi nhau to i phõn t enzym khụng tan Vic s dng enzym c nh cú ý ngha to ln nh cú th s dng nhiu ln mi lng enzym em li hiu qu kinh t cao Dựng enzym c nh ln vo trong sn phm sau ú ngi ta cú th tỏch ra khi sn phm d dng nờn khụng lm nh hng n mu sc, mựi v v cht lng thc phm S dng enzym c nh cú th lm... Na-alginat Cú nhiu phng phỏp gúi enzym vo khuụn gel: gúi di dng ht (viờn); gúi enzym trong cỏc l nh ca gel dng si; gúi enzym trong bao vi th (Microcapsul); phng phỏp tin polyme c nh lipase t Candida rugosa theo phng phỏp ny, ngi ta gn enzym vo trong khuụn gel di dng ht Monome c dựng õy l Na alginat Alginat t lõu ó c dựng to mng gel c nh t bo v enzym xỳc tỏc cỏc phn ng trong cỏc dung mụi ho tan Mng gel... C, N, H và O đầy đủ Ngoài ra vi sinh vật cần đợc cung cấp các chất khoáng Mg, Ca, S, P, Fe, K và một số chất cảm ứng đặc trng của từng enzym ảnh hởng của nguồn cacbon Các nguồn cacbon khác nhau sẽ ảnh hởng khác nhau lên sự phát triển và sản sinh enzym của mỗi sinh vật E Dalmau và cộng sự (2000) đã nghiên cứu sự ảnh hởng của nguồn cacbon đến sinh tổng hợp lipase của chủng Candida rugosa bằng phơng pháp... ly ch phm ra khi phn ng khi cn thit Chớnh vỡ vy m enzym c nh c s dng rng rói v ngi ta cng ó tỡm ra c rt nhiu phng phỏp c nh enzym 1.5.1 Phng phỏp gn enzym bng liờn kt ng hoỏ tr C nh enzym bng liờn kt ng hoỏ tr vi cỏc polyme ó c hot hoỏ l mt trong nhng phng phỏp c nh enzym ph bin nht, m bo liờn kt vng chc ca enzym vi cht mang Bn cht ca phng phỏp ny l enzym c gn vi cht mang thụng qua cu ni Cu ni ny cú... nhng bnh nhõn khụng dch tu hoc kộm hp th 1.7.3 Trong cụng nghip dc v hoỏ cht Trong nhng nm gn õy enzym ngy cng c s dng nhiu v rng rói trong y hc, sn xut mt s thuc v dựng trc tip cha bnh nhiu nc trờn th gii, c bit Nht Bn hng nm ngi ta ó sn xut mt lng ln ch phm enzym vi sinh vt cú tinh khit cao trong ú cú mt ca lipase Trong dc phm lipase c ng dng rng rói trong quỏ trỡnh sn xut thuc cha bnh cho ngi... bao quanh trung tõm hot ng Trong hu ht cu trỳc lipase, u serin hot ng trong chui pentapeptit cú trỡnh t Gly-X1-Ser-X2-Gly cu trỳc ú cng c tỡm thy protease serin (Boel v cng s, 1998) 1.4 MT VI C TNH CA LIPASE 1.4.1 Cht hot hoỏ v cht kỡm hóm Phn ng do enzym xỳc tỏc ph thuc vo nhiu yu t, trong ú cht hot hoỏ v cht kỡm hóm cng nh hng ti vn tc phn ng v hot enzym trong phn ng Hot enzym cú th b thay i di tỏc... Lipase t Candida rugosa n nh trong mụi trng kim pH t 710 v cú hot mnh nht pH 8,5 [Sharon v cng s, 1998] 1.5 TCH TINH CHế LIPASE Tu vo mc ớch s dng m ngi ta tinh sch enzym cỏc mc khỏc nhau cú c enzym thun khit hn, ngi ta tin hnh tinh ch enzym t ch phm enzym thụ Cú nhiu phng phỏp tinh ch: Phng phỏp kt ta da trờn tớnh ho tan, cỏc phng phỏp sc ký trao i ion da trờn tớch in ca enzym; phng phỏp lc gel... phng phỏp lc gel da vo khi lng phõn t, kớch thc enzym; cỏc phng phỏp sc ký ỏi lc da vo v trớ liờn kt c hiu ca enzym Hin nay, vic tỏch tinh ch enzym c tin hnh da trờn s kt hp ca nhiu phng phỏp Cỏc phng phỏp sc ký thng c s dng hn c vỡ nú cho phộp thu nhiu ch phm enzym cú thun khit cao Vn tỏch enzym thun khit vn cũn gp phi mt s khú khn do lng enzym cú trong t bo ớt nhiu cú ln tp cht v luụn cú ng thi... nhiều enzym, vì nitơ là nguồn cung cấp vật liệu (nguyên tố nitơ) cho quá trình sinh tổng hợp protein enzym trong quá trình phát triển.Silbel F và cộng sự (2002) nghiên cứu ảnh hởng của nguồn cacbon và nitơ đến sự sinh tổng hợp lipase của chủng Candida rugosa cho thấy trong những nguồn cacbon và nitơ nghiên cứu thì hoạt độ lipase của canh trờng nuôi đạt đợc cao nhất (5,58 U/ml) khi môi trờng nuôi chứa nguồn