• Phương phỏp cố định lipase trờn Nylon-6 [23]
* Nguyờn lý
Sử dụng phương phỏp gắn enzym lờn chất mang bằng liờn kết đồng hoỏ trị. Dựa trờn hoạt độ enzym trước và sau khi cố định, xỏc định được hiệu suất cốđịnh enzym.
* Tiến hành
Lấy 30g hạt Nylon-6 được lắc trong 600ml dung dịch HCl 3,5N ở
45°C trong 15 phỳt (tốc độ lắc 200 vũng/phỳt). Sau đú những hạt này được tỏch ra bằng mỏy lọc chõn khụng và rửa nhiều lần bằng nước cất.
Sau đú được bổ sung 150ml glutaraldehit 10% và lắc với tốc độ 200 vũng/phỳt ở 30°C trong 30 phỳt. Những hạt này lại được tỏch ra bằng mỏy lọc chõn khụng.
Sau khi hoạt hoỏ, những hạt này được trộn với 100ml dung dịch enzym (1mg/ml) trong đệm phosphat pH=7,7; rồi lắc ở 45°C trong 120 phỳt (tốc độ lắc 200 vũng/phỳt).
Sau đú hỗn hợp được để ở 4°C qua đờm. Rồi được rửa nhiều lần bằng nước cất, mỗi lần 20ml để loại những enzym khụng được gắn kết.
• Phương phỏp xỏc định hoạt độ lipase bằng chuẩn độ [32]
Dựa trờn khả năng xỳc tỏc thuỷ phõn lipit của lipase, xỏc định lượng axit bộo tạo ra trong 15 phỳt bằng lượng NaOH cần bổ sung để duy trỡ pH cố định. Hiệu số giữa lượng NaOH sau và trước khi bổ sung enzym đặc trưng cho hoạt tớnh xỳc tỏc của lipase.
* Tiến hành:
Lấy 10ml dầu ăn + 200ml nước cất + 1% Gum arabic -> đỏnh tan bằng mỏy xay sinh tố trong 5 phỳt, tạo huyền phự.
Lấy 20ml dung dịch huyền phự cho vào cốc thuỷ tinh đặt lờn mỏy khuấy từ, điều chỉnh nhiệt độ tới 65°C.
Thờm 470 àl dung dịch CaCl2đo pH và điều chỉnh pH tới 8,3 (chuẩn bằng NaOH 10mM). Sau khi ổn định pH và nhiệt độ, đo độ tự thuỷ phõn của dung dịch cơ chất trong 15 phỳt để giữ pH luụn luụn bằng 8,3 (lượng NaOH tiờu tốn là a ml).
Sau đú thờm 20 àl dung dịch lipase vào hỗn hợp cơ chất và chuẩn bằng NaOH 10mM để đạt pH= 8,3 và bắt đầu tớnh lượng tiờu hao NaOH trong 15 phỳt để giữ pH luụn luụn = 8,3 (lượng NaOH tiờu tốn là b ml).
* Đơn vị hoạt độ lipase
Một đơn vị hoạt độ lipase (U) được xỏc định như là lượng enzym cú khả năng chuyển hoỏ tạo 1 micromol axớt bộo trong thời gian 1 phỳt.
Hoạt độ lipase trong 1ml dịch nổi được tớnh theo cụng thức: (b-a)*0,01
Hoạt độ lipase = --- U/ml t*v
Với t: thời gian đo độ tự thuỷ phõn (phỳt) v: Thể tớch enzym (ml)
a: Lượng NaOH 10mM tiờu tốn khi chưa cú enzym (àl) b: Lượng NaOH 10mM tiờu tốn khi cú enzym (àl) 0,01: hệ số chuyển đổi nồng độ
• Phương phỏp tỏch tinh chế lipase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE cellulose [15]
* Nguyờn lý:
Dựa trờn phương phỏp sắc ký trao đổi ion, chớnh là sự trao đổi ion của protein tớch điện với ion của nhựa trao đổi ion. Trong đú nhúm tớch
điện (+) là chất mang trao đổi với cỏc ion (-) và do đú chỳng được gọi là cỏc chất trao đổi anion và ngược lại chỳng được gọi là chất trao đổi cation.
* Tiến hành:
Dịch enzym sau kết tủa phõn đoạn bằng etanol nồng độ 60% được cho qua cột DEAE cellulose với điều kiện tỏch phõn đoạn như sau: cột
được cõn bằng trong đệm Tris-HCl 25mM, pH 7,5; tốc độ chảy 1 ml/phỳt với gradien nồng độ 0-0,25M NaCl, mỗi phõn đoạn thu mẫu là 1ml/ống. Ở
mỗi phõn đoạn đo hàm lượng protein, xỏc định hoạt độ lipase để biết được phõn đoạn tỏch lipase tốt nhất.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});