Tái sinh cây dâu tây (fragaria vesca l ) in vitro từ mảnh lá

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với TDZ đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo sau 4 tuần theo dõi .... Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của chồi dâu t

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG THỊ KIM QUYÊN

Tên đề tài:

TÁI SINH CÂY DÂU TÂY (Fragaria Vesca L.) IN VITRO TỪ MẢNH LÁ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG THỊ KIM QUYÊN

Tên đề tài:

TÁI SINH CÂY DÂU TÂY (Fragaria Vesca L.) IN VITRO TỪ MẢNH LÁ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Duy

ThS Nguyễn Thị Quỳnh

Thái Nguyên, năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Sau 6 tháng thực tập tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đến nay em đã hoàn thành xong đề tài của mình Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập

Em xin chân thành cảm ơn đến TS Nguyễn Văn Duy và ThS Nguyễn Thị Quỳnh, người trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với những đóng góp và hướng dẫn quý báu của Ks Lã Văn Hiền trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn Khoa Nông Học, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự sống đã cung cấp nguồn vật liệu cho em thực hiện đề tài này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm, chăm sóc, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Do còn nhiều hạn chế về trình độ cũng như kinh nghiệm thực tế nên không tránh khỏi những thiếu sót trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện đề tài, em rất mong nhận được sự góp ý, bổ sung của thầy cô và các bạn để khoá luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Hoàng Thị Kim Quyên

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của quả dâu tây 8 Bảng 2.2 Diện tích, năng suất, sản lượng dâu tây trên thế giới giai đoạn 2006 -

2012 12 Bảng 4.1 Kết quả khả năng nảy mầm của hạt để tạo nguồn vật liệu sạch cho nuôi cấy (sau 4 tuần theo dõi) 23 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng/ tối đến quá trình tạo mô sẹo từ mảnh lá (sau 3 tuần theo dõi) 24 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá (sau 3 tuần theo dõi) 26 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với TDZ đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo (sau 4 tuần theo dõi) 27 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến nhân nhanh chồi (sau 4 tuần theo dõi) 29 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến nhân nhanh chồi (sau 4 tuần theo dõi) 30 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin kết hợp với TDZ đến nhân nhanh chồi (sau 4 tuần theo dõi) 32 Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của chồi dâu tây (sau

4 tuần theo dõi) 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cây dâu tây 6 Hình 4.1 Khả năng nảy mầm của hạt (sau 4 tuần theo dõi) 23 Hình 4.2 Hình thái mô sẹo trong các điều kiện chiếu sáng (sau 3 tuần theo dõi) 25 Hình 4.3 Mô sẹo được hình thành từ mảnh lá (sau 3 tuần theo dõi) 26 Hình 4.4 Tái sinh chồi từ mô sẹo (sau 4 tuần theo dõi) 28 Hình 4.5 Chồi dâu tây khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung BAP (sau 4 tuần theo dõi) 30 Hình 4.6 Chồi dâu tây khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung Kinetin (sau 4 tuần theo dõi) 31 Hình 4.7 Chồi dâu tây khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung Kinetin + TDZ (sau 4 tuần theo dõi) 32 Hình 4.8 Rễ dâu tây (sau 4 tuần theo dõi) 34

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

ĐTST : Điều tiết sinh trưởng

MS : Murashinge and Skoog, 1962 BAP : 6-benzylaminopurine

Kinetin : 6-furfuryaminopurine NAA : Naphlene acetic acid IAA : 3-Indol acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.3 Giới thiệu chung về cây dâu tây 4

2.3.1 Nguồn gốc 4

2.3.2 Phân loại 5

2.3.3 Đặc điểm thực vật học của cây dâu tây 5

2.3.4 Giá trị của cây dâu tây 6

2.3.5 Các phương pháp nhân giống cây dâu tây 9

2.4 Tình hình nghiên cứu nhân giống cây dâu tây bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 9

2.4.1 Trên thế giới 9

2.4.2 Ở Việt Nam 10

2.5 Tình hình sản xuất cây dâu tây giống 11

2.6 Một số khó khăn, thách thức trong quá trình sản xuất và nhân giống dâu tây 13

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 14

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 14

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 14

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

3.2.1 Địa điểm 14

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 14

3.3 Điều kiện nghiên cứu 14

3.4 Hóa chất và thiết bị 14

3.5 Nội dung nghiên cứu 15

3.6 Phương pháp nghiên cứu 15

3.6.1 Nghiên cứu khả năng nảy mầm của hạt dâu tây 15

3.6.2 Ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng đến quá trình tạo mô sẹo từ mảnh lá 16

3.6.3 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá 17

3.6.4 Ảnh hưởng của BAP kết hợp với TDZ đến tái sinh chồi từ mô sẹo 18

3.6.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin, Kinetin kết hợp với TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi dâu tây 19

3.6.6 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ 20

3.7 Phương pháp xử lý 21

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả khả năng nảy mầm của hạt để tạo nguồn vật liệu sạch cho nuôi cấy 23

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng/ tối đến quá trình tạo mô sẹo từ mảnh lá 24

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá 26

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với TDZ đến tái sinh chồi từ mô sẹo 27

4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, Kinetin, Kinetin kết hợp với TDZ đến nhân nhanh chồi 29

4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của chồi dâu tây 33

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Theo Dương Tấn Nhựt (2004) [8], dâu tây là một cây trồng ôn đới, có nguồn gốc ở châu Âu và châu Mỹ Trên thế giới, dâu tây đã trở thành một cây công nghiệp

có giá trị kinh tế, là một trong những loại quả được ưa chuộng trên thế giới do quả dâu tây có giá trị dinh dưỡng, trong quả có chứa nhiều lọai vitamin, trong đó hàm lượng vitamin C cao nhất Quả dùng để ăn tươi, làm mứt, nước giải khát, rượu và hương vị thực phẩm Hiện nay, nguồn dâu tây sản xuất ở Việt Nam chủ yếu nhập từ giống dâu tây Pháp, Mỹ, Nhật Bản, một số giống được nhập nội từ Isarel Sản xuất dâu tây ở quy mô lớn tập trung ở Đà Lạt, nơi có khí hậu ôn đới Tuy nhiên, dâu tây cũng bị nhiều loại sâu bệnh phá hoại như mốc đen, mốc xám, bọ trĩ, nhện đỏ, thối quả… dẫn đến năng suất và phẩm chất của quả giảm sút Năm 2005 – 2006 ở Đà Lạt có diện tích 120 ha, đến năm 2011 chỉ còn 40 ha Đến năm 2012, diện tích trồng dâu tây ở Đà Lạt lại tăng nhanh chóng, đạt 135ha, năng suất 60 - 70 tấn/ha Ở Việt Nam có hai vùng sinh thái Đà Lạt – Lâm Đồng và Sapa – Lào Cai có những điều kiện khí hậu thuận lợi để phát triển giống cây dâu tây [48] Hiện nay ở miền Bắc, giống được trồng nhiều là giống dâu tây Mỹ, giống này mang nhiều đặc điểm tốt như khả năng kháng bệnh tốt, quả có màu sắc đẹp, quả to mùi thơm đặc trưng, quả

có độ cứng và phù hợp với điều kiện sinh thái miền Bắc Phương pháp nhân giống dâu tây chủ yếu hiện nay bằng nhân giống truyền thống bao gồm tách thân bò và tách cây con từ thân chính Phương pháp này cho hệ số nhân giống không cao và có thể lây nhiễm một số bệnh từ cây mẹ Nhiều nghiên cứu cho thấy việc ứng dụng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh có hiệu quả tốt Tuy nhiên, sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy có ảnh hưởng đến sức sống cây mẹ và số lượng mẫu

để phục vụ nuôi cấy không có nhiều [8], [45] Vì vậy, việc tối ưu nguồn vật liệu cho nuôi cấy là một vấn đề quan trọng trong nhân giống vô tính Hệ thống tái sinh trên cây dâu tây đã được thiết lập dựa trên nhiều nguồn vật liệu khác nhau bao gồm : lá [45], [37], cuống lá [37], nụ hoa [20], [22], rễ [22] , hạt phấn [22], đoạn thân [37],

cuống hoa [37]

Xuất phát từ thực tiễn trên, nghiên cứu tiến hành "Tái sinh cây dâu tây

(Fragaria Vesca L.) in vitro từ mảnh lá" để khắc phục hiện tượng giảm sức sống

của cây mẹ, trong nghiên cứu sử dụng lá dâu tây làm nguyên liệu phục vụ nuôi cấy tái sinh cây dâu tây từ mô sẹo, qua đó góp phần hạn chế những khó khăn trong quá trình nhân giống dâu tây hiện nay

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Tái sinh thành công cây dâu tây (Fragaria Vesca L.) in vitro từ mảnh lá

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Nghiên cứu được khả năng nảy mầm của hạt để tạo nguồn vật liệu sạch cho nuôi cấy

- Nghiên cứu được ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng đến khả năng tạo mô sẹo

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Thực vật là một đối tượng được nghiên cứu nhiều và sự phát sinh hình thái dựa trên hai yếu tố là tính toàn năng của tế bào thực vật và sự phân hóa, phản phân hóa

Năm 1902, lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đưa ra quan niệm: “Mỗi tế bào bất kì (đã biệt hóa) của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh”

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: Tất cả mọi tế bảo của một cơ thể đều chứa mộ bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng tổng hợp những kiểu protein – enzyme giống hệt nhau và nếu được nuôi cấy trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài cụ thể và ra hoa kết trái bình thường Khả năng đó của tế bào được gọi là tính toàn năng tế bào thực vật” [11]

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào [1] Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu thị bằng biểu đồ:

2.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo PGS.TS Ngô Xuân Bình (2004) [2] có 5 giai đoạn trong nuôi cấy mô:

- Giai đoạn 1: Chuẩn bị mẫu cấy

Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ

- Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất kích thích sinh trưởng (tỷ lệ Auxin/Cytokinin)

- Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy Để tăng hệ số người ta thường sử dụng các chất kích thích sinh trưởng (Auxin, Cytokinin…), nước dừa, dịch chiết nấm men… kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp

- Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra rễ

để tạo cây hoàn chỉnh Các chất kích thích được sử dụng để tạo rễ cho chồi: IAA, IBA, NAA, 2,4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi

-Giai đoạn 5: Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xuất

2.3 Giới thiệu chung về cây dâu tây

2.3.1 Nguồn gốc

Cây dâu tây có tên khoa học là Fragaria Vesca L., là loài cây được biết từ

thời La Mã và cũng có thể từ thời Ai Cập Lúc này, trái dâu tây được dùng chung với các loại trái dại khác Đến đầu thế kỷ XIV, người Pháp bắt đầu trồng loại cây dâu rừng này và dần dần thuần hóa chúng Cuối thế kỷ XVI, ba loài dâu tây của

Châu Âu là Fragaria vesca, Fragaria moschata và Fragaria viridis được ghi nhận

là loại cây ăn quả [14]

Ở nước ta, vào đầu những năm 30 của thế kỷ XX, cây dâu tây Fragaria

vesca được trồng thử nghiệm ở Đà Lạt bởi người Pháp Các cây dâu tây đầu tiên có

trái nhỏ, màu sắc nhạt nhưng có mùi đặc trưng Nguyên nhân là do giống dâu tây này mới được trồng ở Đà Lạt nên còn chưa thích nghi với điều kiện khí hậu ở đó

Đến năm 1963, một số giống dâu tây mới được du nhập từ Mỹ cho trái đậm, năng suất cao, nhưng không thơm bằng các giống dâu Pháp Để đáp ứng nhu cầu thị trường, từ những năm 1994, nhiều loại dâu tây mới đã được nhập và trồng tại Lâm Đồng và một số tỉnh phía Bắc [14]

2.3.3 Đặc điểm thực vật học của cây dâu tây

Theo Võ Khắc Chi (2003) [3], cây dâu tây có đặc điểm:

2.3.3.1 Rễ

Rễ cây dâu tây thuộc loại rễ chùm Đầu chóp rễ dâu tây có sức phân nhánh mạnh Rễ cây dâu tây phát triển tốt nhất trong điều kiện khi nhiệt độ đất là 25oC

2.3.3.2 Thân cây dâu tây

Dâu tây thuộc loài cây thân thảo, có hai kiểu thân là thân chính và thân bò Thân bò bắt đầu từ cổ rễ vươn dài trên mặt đất và tận cùng là một chồi Chồi này phát triển thành một cây mới Gióng của thân bò đó có thể chết đi hoặc bị cắt đứt nhưng chồi mới được hình thành vẫn sống độc lập Thường thì từ thân chính sẽ phát sinh thêm 1 đến 2 thân con nữa và các nhánh này góp phần vào năng suất của cây dâu tây sau này

A B

Hình 2.1 Cây dâu tây

A Ảnh chụp cây dâu tây B Ảnh mô tả cấu trúc cây dâu tây 2.3.3.3 Lá

Lá phát sinh bao quanh xung quanh thân, lá có cuống dài, lá kép lông chim

có 3 lá chét Lá có dạng ô van

2.3.3.4 Hoa

Phân chia thành nhiều nhánh, mỗi nhánh có một hoa Hoa có 5 cánh tràng mỏng, màu trắng, hơi tròn Hoa lưỡng tính, có 25-30 nhị và 50-500 nhụy Lá đài của hoa dâu tây nhỏ và có màu xanh

2.3.3.5 Quả

Quả dâu tây là quả giả, chứa các mô ngoài noãn, được phình ra từ đế hoa Quả thật là những quả bế gọi là hạt Số lượng quả bế nhiều, nhỏ, hình elip bao phủ bề mặt quả Quả có hình bầu dục, quả non có màu xanh lục, khi quả chín, quả có màu hồng hoặc màu đỏ tuỳ từng giống Quả Dâu tây có mùi thơm, vị ngọt lẫn vị chua

2.3.4 Giá trị của cây dâu tây

Giá trị của cây dâu tây được biết đến từ những năm 1400 ở Châu Âu do người La Mã phát hiện và được trồng vào thời Trung cổ [27], [36] Dâu tây được sử dụng để chữa bệnh, chăm sóc sắc đẹp, làm lành vết thương Sau đó người ta đã dần phát hiện thêm nhiều tác dụng chữa bệnh khác của cây dâu tây [16], [29], [39]

* Giá trị dinh dƣỡng của dâu tây

Fragaria vesca L là một loại thảo dược lâu năm thuộc trong họ Rosaceae,

mọc ở đồng cỏ, rừng và dọc theo hai bên đường [17], [21], [23], [42] F vesca,

thường được gọi là dâu tây hoang dã, là cây mọc trong điều kiện khí hậu ôn đới đến

các vùng cận nhiệt đới của Bắc bán cầu, độc quyền của vùng nhiệt đới [23], [25] F

vesca, có nguồn gốc châu Âu và các khu vực ôn đới của châu Á [19], [24], [31] F vesca đã được sử dụng như thuốc nhuận tràng, lợi tiểu, làm se vết thương, sát trùng

trong y học dân gian [29] Lá dâu tây được sử dụng chữa các bệnh đường tiêu hóa

và da [23] Ngoài ra, dâu tây còn có tác dụng là chất chống oxy hóa [16], [27], [41], thuốc chống đông máu, chống viêm [26], giãn tim mạch [34], [44], chống huyết

khối [35], kháng khuẩn [44], giảm đau [28]

Giá trị lớn nhất của quả dâu tây là tác dụng chữa bệnh mà người ta không tìm thấy trong bất kỳ loại thực phẩm nào khác Trong quả dâu tây có chứa các chất bảo

vệ, chống ôxy hóa nhiều gấp 10 lần quả cà chua [4]

Trong phần thịt của quả dâu tây có các loại sinh tố A, B1, B2 và đặc biệt là lượng sinh tố C khá cao, hơn cả cam, dưa hấu Đây là tính ưu việt của quả dâu tây giúp tăng sức đề kháng chống nhiễm trùng, nhiễm độc, cảm cúm và chống stress, lão hóa (oxy hóa) [4]

Dâu tây vị ngọt, chua, tính mát, công hiệu bổ phổi, điều hòa chức năng tiêu hóa, bồi bổ cơ thể, mát máu, giải độc Dùng chữa các chứng như ho do phổi nóng, cổ họng sưng đau, chán ăn, tiểu ngắn, tiểu gắt, thiếu máu suy nhược, ung nhọt, say rượu

Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng của quả dâu tây

190 22,0 5,0 30,0 0,58 0,03 0,06 0,3 0,06 60,0

(Nguồn: Thái Thị Thúy Liên và cs.,2008) [5]

* Giá trị kinh tế của dâu tây

Dâu tây là loại thực phẩm có mùi thơm, vị ngọt lẫn chua nên rất được ưa chuộng Ở Việt Nam có hai vùng sinh thái Đà Lạt – Lâm Đồng và Sapa – Lào Cai

có những điều kiện khí hậu thuận lợi để phát triển giống cây dâu tây Năm 2005 –

2006 ở Đà Lạt có diện tích 120 ha, đến năm 2011 chỉ còn 40 ha Đến năm 2012, diện tích trồng dâu tây ở Đà Lạt lại tăng nhanh chóng, đạt 135 ha, năng suất 60 - 70 tấn/ha [8], [48] Thời gian thu hoạch chính là từ tháng 10 đến tháng 4 cho năng suất

cao đạt từ 70kg đến 80kg trên một sào cho thu nhập cao Việc chăm sóc đạt yêu cầu

an toàn trong vườn dâu tây có thể cho thu hoạch trái vụ liên tục từ tháng 5 đến tháng

9 cho năng suất mỗi ngày trên dưới 40 ký mỗi sào, nhân với hơn 6 sào hiện có, tổng sản lượng 2,4 tạ [48]

Hiện tại dâu tây có mặt ở niều siêu thị và chợ nên việc mua bán được thuận lợi đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng Quả dâu tây có thể dùng để ăn tươi, làm mứt, nước giải khát, rượu và hương vị thực phẩm [8]

2.3.5 Các phương pháp nhân giống cây dâu tây

Có 2 phương pháp nhân giống cây dâu tây chủ yếu hiện nay là tách cây con

từ ngó cây mẹ, nuôi cấy mô

Phương pháp tách cây con từ ngó cây mẹ đơn giản, dễ thực hiện, nhưng cho

hệ số nhân giống thấp, chất lượng cây giống không đồng đều, ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát dục của cây mẹ Chỉ nên lấy cây con tách từ ngó cây mẹ dưới một năm tuổi mới đảm bảo chất lượng con giống [8]

Phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp nhân giống phức tạp, đòi hỏi đầu

tư trang thiết bị ban đầu lớn, giá thành cây giống cao hơn, tuy nhiên phương pháp này có hệ số nhân rất cao, chất lượng cây giống tốt, đồng đều, sạch sâu bệnh [12] Chính vì vậy mà phương pháp nuôi cấy mô không những phục vụ cho nhân giống

mà còn có tác dụng phục tráng giống Ngoài ra, việc nuôi cấy in vitro sử dụng

nguồn hydrocacbon nhân tạo do đó mà khả năng tự tổng hợp chất hữu cơ kém, cây

nuôi cấy in vitro được nuôi trong bình thủy tinh có độ ẩm bão hòa, do vậy mà khi

trồng cây ra ngoài điều kiện tự nhiên cây thường bị mất nước, không thích nghi được cây dễ bị héo và chết

2.4 Tình hình nghiên cứu nhân giống cây dâu tây bằng phương pháp nuôi cấy

mô trên thế giới và Việt Nam

2.4.1 Trên thế giới

Do cây dâu tây có giá trị kinh tế, giá trị sử dụng cao nên có rất nhiều nước đi sâu nghiên cứu kỹ thuật nhân giống, chọn lọc và tạo giống mới

Yildirim A.B (2014) [42] đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất tăng cường

tái sinh trên từng giống của Fragaria vesca L và so sánh phenolic của lĩnh vực

trồng và vật liệu cây trồng ống nghiệm trồng bằng phương pháp sắc ký lỏng electrospray tandem khối phổ (LC-ESI-MS / MS) Năm 2002, tác giả Passey A.J (2002) [38] đã tiến hành nghiên cứu về sự tái sinh chồi ngẫu nhiên từ bảy giống dâu

tây thương mại (Fragaria x ananassa Duch.) sử dụng nhiều loại mẫu cấy

Một trong những nhân tố tạo nên thành công cho ngành sản xuất dây tây ở

một số nước trên thế giới là đã sử dụng công nghệ nhân giống in vitro để sản xuất

cây con giống Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu sử dụng các bộ phận khác của cây dâu tây để nuôi cấy như đoạn thân, mảnh lá, cánh hoa Cũng theo phương pháp này, Passey A.J và cộng sự (2002) đã nghiên cứu thu được những giống dâu tây sạch virus [38]

Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiện

thành công bởi Chien-Ying K và cộng sự (2009) [18], kết quả thí nghiệm cho thấy phương pháp tối ưu, để mẫu có tỷ lệ sống sót, tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là bảo quản chồi đỉnh dâu tây trước nuôi cấy hai ngày trong điều kiện lạnh

Chất lượng chồi cây giống in vitro là yếu tố có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu

quả sản xuất cây giống tiêu chuẩn cũng như khả năng sinh trưởng của cây Để hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô cây dâu tây, việc nghiên cứu giai đoạn cuối cùng là đưa

cây in vitro ra ngoài đất cũng rất quan trọng [32]

2.4.2 Ở Việt Nam

Cây dâu tây được trồng ở nước ta từ lâu nhưng các kết quả nghiên cứu về loài cây này không nhiều Trong những năm gần đây việc tăng năng suất, chất lượng dâu tây cùng với sự đổi mới về các kỹ thuật nghiên cứu trên nhiều lĩnh vực khác nhau được nhiều cơ quan, trường đại học quan tâm

Tiêu biểu trong đó có Phân viện sinh học Tây nguyên, Trung tâm nghiên cứu Khoai tây rau và hoa, Trung tâm nghiên cứu và ứng dụng nông nghiệp Lâm Đồng

Dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và cung cấp cây giống dâu tây sạch bệnh,

số lượng lớn cho các vùng trồng dâu tây trong tỉnh Lâm Đồng” do Viện Sinh học

Tây Nguyên chủ trì đã đặt ra mục tiêu: Hoàn thiện công nghệ nhân giống và trồng dâu tây, tạo ra cây giống dâu sạch bệnh có chất lượng tốt đồng thời, xây dựng một

số mô hình trong dân

Năm 2007, tác giả Phạm Xuân Tùng và cộng sự [13] đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp xử lý khử trùng mẫu và các yếu tố môi trường trong nhân

nhanh giống dâu tây in vitro cho phép sản xuất hàng loạt cây dâu tây trong khoảng

thời gian 10 đến 12 tuần

Năm 2010, tác giả Nguyễn Trí Minh [7] đã thử nghiệm nghiên cứu hệ thống

nhân giống cây dâu tây (Fragaria x ananassa Duch.) bằng công nghệ nuôi cấy mô

thực vật đặc biệt chú trọng công nghệ quang tự dưỡng, nhằm tạo ra cây dâu tây sạch

bệnh và chất lượng cao kết quả như sau: Môi trường tái sinh chồi dâu tây in vitro là

môi trường 1/2MS có bổ sung agarose 8,5g/l, saccarose 35g/l , BAP 1,5mg/l và IBA 0,1 mg/l cho hiệu quả cao nhất, đỉnh sinh trưởng phát triển mạnh và hệ số nhân cao, chồi xanh, khỏe mạnh và phát triển bình thường Môi trường kéo dài chồi và phát triển rễ là môi trường MS không đường, không vitamin, không chất điều hòa sinh trưởng, giá thể florialite; cường độ ánh sáng 200 mol m-2 s-1, nồng độ CO2 1000 µmol mol-1 Dâu tây nuôi cấy trong điều kiện quang tự dưỡng tiết kiệm được 25% chi phí sản xuất cây giống so với điều kiện quang dị dưỡng nhờ vào tỷ lệ nhiễm thấp Kết quả này mở ra triển vọng về ứng dụng nuôi cấy mô quang tự dưỡng trong việc sản xuất dâu tây giống ở quy mô công nghiệp

Trước đây đã có nhiều nghiên cứu về giống dâu tây trên những phương diện khác nhau Năm 2004, tác giả Dương Tuấn Nhựt và cộng sự [8] đã tiến hành nghiên cứu hệ thống nhân giống dâu tây bằng túi nilon để nâng cao chất lượng và số lượng dâu tây giống Bên cạnh đó, cường độ chiếu sáng, các chất điều hòa tăng trưởng và hàm lượng CO2 cũng có ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng sinh trưởng in vitro

của dâu tây [6], [9]

2.5 Tình hình sản xuất dâu tây

Theo thống kê của tổ chức lương thực và nông nghiệp thế giới (FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations), hiện nay có khoảng trên 70

quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới trồng và sản xuất dâu tây, sản lượng trung bình đạt 3,1 triệu tấn Đức và Pháp là hai nước tiêu thụ nhiều nhất, khoảng 320.000 tấn/ năm Trong khi đó, Hoa Kỳ đứng đầu thế giới về sản xuất dâu tây (khoảng 840.000 tấn/năm), tiếp theo là Trung Quốc và Tây Ban Nha (FAO, 2010) [46]

Bảng 2.2 Diện tích, năng suất, sản lƣợng dâu tây trên thế giới

(tạ/ha) 150 276 151 075 166 661 186 951 190 688 177 816 187 335 Sản lượng

Qua các nghiên cứu cho thấy phạm vi trồng dâu tây tại Việt Nam có thể mở rộng nếu ứng dụng công nghệ sinh học, áp dụng khoa học công nghệ trong canh tác thì tiềm năng tiêu thụ của trái dâu tây của Việt Nam là rất cao, ở cả thị trường trong

và ngoài nước, đặc biệt có thể hình thành các vùng chuyên canh dâu tây theo mô hình phát triển các vùng chuyên canh cây ăn trái lớn trong cả nước

2.6 Một số khó khăn, thách thức trong quá trình sản xuất và nhân giống dâu tây

Dâu tây là loại cây dễ trồng tuy nhiên công tác mở rộng diện tích canh tác cũng gặp không ít những khó khăn và thách thức Cũng như những loại cây khác, dâu tây cũng bị nhiều loại sâu bệnh phá hoại như mốc đen, mốc xám, bọ trĩ, nhện

đỏ, thối quả… dẫn đến năng suất và chất lượng của quả giảm sút Năm 2005 – 2006

ở Đà Lạt có diện tích 120 ha, đến năm 2011 chỉ còn 40 ha [48] Hiện nay, việc nhân giống vẫn được tiến hành theo phương pháp truyền thống là tách cây con từ cây mẹ Đây là phương pháp cho hệ số nhân giống thấp, chất lượng cây con giống kém Do vậy, yêu cầu đặt ra lúc này là nghiên cứu các phương pháp đơn giản, cho hệ số nhân

cao, chất lượng cây giống tốt, sạch bệnh Nuôi cấy in vitro là một phương pháp đáp

ứng được các yêu cầu trên [8] Bên cạnh đó, điều kiện môi trường như ánh sáng,

CO2, độ ẩm cũng là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình sản xuất và nhân giống cây dâu tây Xuất phát từ những khó khăn đó mà cần phải tìm ra các hướng nghiên cứu mới phục vụ cho việc thúc đẩy sản xuất và nhân giống dâu tây trên quy mô công nghiệp thông qua phương pháp nuôi cấy mô [7], [8], [9], [13] Việc ứng dụng khoa học kỹ thuật đem lại nhiều hiệu quả cho rõ rệt so với các phương pháp truyền thống Gần đây đã có nhiều nhà nghiên cứu tiến hành thí nghiệm chuyển các gen chống chịu sâu bệnh, chịu hạn…vào dâu tây thông qua vi khuẩn để nâng cao khả năng chống chịu của cây trong điều kiện thời tiết không ổn định, dịch hại nhiều [32] Tuy nhiên, việc nghiên cứu chuyển gen nâng cao khả năng chống chịu vào cây

trồng nói chung và cây dâu tây nói riêng phải thực hiện qua bước nhân giống in

vitro để tạo vật liệu chuyển gen và tái sinh cây sau chuyển gene Hiện nay ở miền

Bắc, giống được trồng nhiều là giống dâu tây Mỹ, giống này mang nhiều đặc điểm tốt như khả năng kháng bệnh tốt, quả có màu sắc đẹp, quả to mùi thơm đặc trưng, quả có độ cứng và phù hợp với điều kiện sinh thái miền Bắc

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Hạt và lá cây dâu tây do Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Viện Khoa học Sự sống cung cấp

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Tái sinh cây dâu tây in vitro cây dâu tây (Fragaria Vesca L.) thông qua tạo

mô cấy vô trùng, tái sinh chồi từ mô sẹo, nhân chồi và ra rễ ở quy mô phòng thí nghiệm

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.3 Điều kiện nghiên cứu

Các thí nghiệm in vitro được duy trì trong điều kiện nhân tạo:

- Số giờ chiếu sáng trong ngày: 8 – 12h/ngày

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 250C ± 20C

GA3 (Duchefa), đường (Việt Nam), agar (Việt Nam), …vv

- Thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Cân điện tử Olhous-Vietlabcu (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản), tủ sấy Memmert

(Đức), tủ cấy vô trùng II Airtech (Hàn Quốc), máy chuẩn pH Hanna HI2210 (Đức),

lò vi sóng Sanyo, tủ lạnh Sanyo, pipet, máy ảnh,…vv

Ngoài ra còn có các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

3.5 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu khả năng nảy mầm của hạt để tạo nguồn vật liệu sạch cho nuôi cấy

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng tạo mô sẹo

từ mảnh lá

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với TDZ đến tái sinh chồi từ mảnh lá

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, Kinetin, Kinetin kết hợp với TDZ đến nhân nhanh chồi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây dâu tây

3.6 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp tái sinh cây dâu tây từ mảnh lá dựa trên nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2004 [8]

3.6.1 Nghiên cứu khả năng nảy mầm của hạt dâu tây để tạo nguồn vật liệu sạch cho nuôi cấy

- Bước 2: Khử trùng bằng HgCl2 0,1% và Javen 1%:

+ HgCl2 0,1%: Hạt dâu tây sau khi được khử trùng với cồn 70o sẽ được khử trùng bằng HgCl2 trong 5 phút (lắc nhẹ) sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 5-7 lần

+ Javen 1%: Nếu khử trùng bằng Javen thì thời gian khử trùng là 3 phút (lắc nhẹ) sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 5-7 lần

*Các thí nghiệm tiến hành:

- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng nảy mầm của hạt để tạo vật liệu nuôi cấy

Các công thức thực hiện như sau: Bố trí 2 công thức thí nghiệm, mỗi công thức tiến hành trên 150 mẫu (3 lần nhắc lại, 50 mẫu/ 1 lần nhắc lại)

Công thức 1: Hạt không xử lý phá ngủ

Công thức 2: Hạt xử lý phá ngủ

* Các chỉ tiêu theo dõi:

- Chỉ tiêu theo dõi: Số hạt nảy mầm, tỷ lệ phần trăm số hạt nảy mầm

3.6.2 Ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng đến quá trình tạo mô sẹo từ mảnh lá

*Cách tiến hành:

Mảnh lá sau khi được khử trùng được cấy vào môi trường tạo mô sẹo trong

các bình trụ 250ml Sau đó đưa các bình mẫu vào môi trường nuôi cấy với điều kiện không có ánh sáng và có ánh sáng

Môi trường nuôi cấy là môi trường MS + Saccarose 30g/l + agar 5,0g/l + Myo Inositol 100mg/l, pH= 5,6-5,8

*Các thí nghiệm tiến hành:

- Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng/ tối đến quá

trình tạo mô sẹo từ mảnh lá

Các công thức thực hiện như sau: bố trí 3 công thức thí nghiệm, mỗi công thức tiến hành trên 300 mẫu (3 lần nhắc lại, 100 mẫu/ 1 lần nhắc lại)

Công thức 1: Không ánh sáng (để tối) 03 tuần

Công thức 2: Ánh sáng 2000 lux 03 tuần

Công thức 3: Không ánh ánh (để tối) 02 tuần =>Ánh sáng 2000 lux 01 tuần

* Các chỉ tiêu theo dõi:

- Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ phần trăm mẫu lá tạo mô sẹo + Tỷ lệ mẫu lá tạo mô sẹo (%) = Σ Số mẫu tạo mô sẹo

x 100

Σ Số mẫu (mảnh lá)

- Hình thái mô sẹo:

+++: Trắng, cứng ++: Vàng, cứng

*Các thí nghiệm tiến hành:

- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA

đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá (bao gồm 5 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 60 mẫu/ 1 công thức)

Công thức 1: Môi trường nền + BA 0mg/l + NAA 0mg/l

Công thức 2: Môi trường nền + BA 0,5mg/l + NAA 0,5mg/l

Công thức 3: Môi trường nền + BA 1,0mg/l + NAA 1,0mg/l

Công thức 4: Môi trường nền + BA 2,0mg/l + NAA 2,0mg/l

Công thức 5: Môi trường nền + BA 3,0mg/l + NAA 3,0mg/l

Môi trường nền: Môi trường MS + Saccarose 30g/l + agar 5,0g/l + Myo Inositol 100mg/l, pH= 5,6

* Các chỉ tiêu theo dõi:

- Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu tạo mô sẹo, hình thái mô sẹo

+ Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) = Σ Số mẫu tạo mô sẹo

x 100

Σ Số mẫu (mảnh lá)

- Hình thái mô sẹo:

+++: Trắng, cứng ++: Vàng, cứng

*Các thí nghiệm tiến hành:

- Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với TDZ đến

khả năng tái sinh chồi (bao gồm 5 công thức, các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 30 mẫu/ 1 công thức)

Công thức 1 (ĐC): Môi trường nền + BA 0,2mg/l + TDZ 0,0mg/l

Công thức 2: Môi trường nền + BA 0,2mg/l + TDZ 0,1mg/l

Công thức 3: Môi trường nền + BA 0,2mg/l + TDZ 0,3mg/l

Công thức 4: Môi trường nền + BA 0,2mg/l + TDZ 0,5mg/l

Công thức 5: Môi trường nền + BA 0,2mg/l + TDZ 1,0mg/l

Môi trường nền: Môi trường MS + Saccarose 30g/l + agar 5,0g/l + Myo Inositol 100mg/l, pH= 5,6

* Các chỉ tiêu theo dõi:

- Chỉ tiêu theo dõi: Số mô sẹo tái sinh chồi, số chồi thu được, hình thái chồi + Tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi (%) = Σ Số mô sẹo tái sinh chồi

3.6.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin, Kinetin kết hợp với TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi dâu tây

* Cách tiến hành:

Chồi bất định hình thành từ mô sẹo sau khi nuôi cấy ở môi trường tái sinh Môi trường nhân nhanh là môi trường nền có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, Kinetin, Kinetin kết hợp với TDZ) ở các nồng độ được

bố trí ở thí nghiệm 5, 6 và 7

*Các thí nghiệm tiến hành

- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân

nhanh chồi dâu tây (bao gồm 5 công thức, mỗi công thức 5 bình, mỗi bình cấy 3 mẫu, lặp lại 3 lần)

Công thức 1 (ĐC): Môi trường nền + BAP 0,0mg/l

Công thức 2: Môi trường nền + BAP 0,2mg/l

Công thức 3: Môi trường nền + BAP 0,3mg/l

Công thức 4: Môi trường nền + BAP 0,5mg/l

Công thức 5: Môi trường nền + BAP 1,0mg/l

MT nền = MS + Saccarose 30g/l + agar 5,0g/l + Myo Inositol 100mg/l, pH= 5,6 - 5,8

- Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng

nhân nhanh chồi dâu tây (bao gồm 5 công thức, mỗi công thức 5 bình, mỗi bình cấy

3 mẫu, lặp lại 3 lần)

Công thức 1 (ĐC): Môi trường nền + Kinetin 0,0mg/l

Công thức 2: Môi trường nền + Kinetin 0,2mg/l

Công thức 3: Môi trường nền + Kinetin 0,3mg/l

Công thức 4: Môi trường nền + Kinetin 0,5mg/l

Công thức 5: Môi trường nền + Kinetin 1,0mg/l

MT nền = MS + Saccarose 30g/l + agar 5,0g/l + Myo Inositol 100mg/l, pH= 5,6-5,8

- Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với TDZ

đến khả năng nhân nhanh chồi dâu tây (bao gồm 5 công thức, mỗi công thức 5 bình, mỗi bình cấy 3 mẫu, lặp lại 3 lần)

Công thức 1 (ĐC): Môi trường nền + Kinetin 0,0mg/l + TDZ 1,0mg/l

Công thức 2: Môi trường nền + Kinetin 0,2mg/l + TDZ 1,0mg/l

Công thức 3: Môi trường nền + Kinetin 0,3mg/l + TDZ 1,0mg/l

Công thức 4: Môi trường nền + Kinetin 0,5mg/l + TDZ 1,0mg/l

Công thức 5: Môi trường nền + Kinetin 1,0mg/l + TDZ 1,0mg/l

MT nền = MS + Saccarose 30g/l + agar 5,0g/l + Myo Inositol 100mg/l, pH= 5,6 -5,8

* Các chỉ tiêu theo dõi:

- Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi thu được, hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, hình thái chồi

+ Số chồi thu được = ∑ Số mẫu bật chồi

∑ Mẫu nuôi cấy đưa vào

+ Hệ số nhân chồi (chồi) = ∑ Số chồi tạo thành

∑ Số chồi ban đầu

- Hình thái chồi:

+++: Chồi tốt (Chồi xanh, mập)

++: Chồi trung bình (Chồi xanh, nhỏ)

+: Chồi kém (Chồi vàng, nhỏ)

3.6.6 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ

* Cách tiến hành:

- Sau 4-6 tuần nhân nhanh chồi Khi chồi đạt chiều cao 3 – 4cm, sinh trưởng

và phát triển bình thường được chuyển sang môi trường ra rễ để phát triển thành cây hoàn chỉnh Môi trường ra rễ là môi trường nên có bổ sung IBA ở nồng độ được bố trí ở thí nghiệm 8

*Các thí nghiệm tiến hành