Trong nghiên cứu này, chitosan đã được cắt mạch trong dung dịch chitosan/H2O2 bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60. Khối lượng phân tử (Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA) của chitosan lần lượt được xác định bằng phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC) và phương pháp phổ hồng ngoại (IR).
Số 32 (57) - Tháng 9/2017 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN Nghiên cứu chế tạo Oligochitosan phương pháp chiếu xạ Gamma Co-60 dung dịch Chitosan/H2O2 khảo sát hiệu ứng gia tăng số lượng hoa dâu tây (Fragaria Vesca L.) A study on preparation of Oligochitosan by Gamma irradiation onto Chitosan/H2O2 solution and examining effects of increase in the number of flowers on strawberry (Fragaria Vesca L.) TS Đặng Xuân Dự, Trường Đại học Sài Gòn Dang Xuan Du, Ph.D., Saigon University Tóm tắt Trong nghiên cứu này, chitosan cắt mạch dung dịch chitosan/H2O2 phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 Khối lượng phân tử (Mw) độ đề axetyl (ĐĐA) chitosan xác định phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC) phương pháp phổ hồng ngoại (IR) Kết cho thấy oligochitosan khối lượng phân tử Mw < 10 kDa chế tạo cách hiệu phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 dung dịch chitosan/H2O2 liều xạ thấp, khoảng kGy Oligochitosan chế tạo có hiệu ứng gia tăng số lượng hoa dâu tây Nồng độ phù hợp oligochitosan để phun lên dâu tây khoảng 50 ppm Từ khóa: Oligochitosan, xạ Gamma, dâu tây Abstract In this study, the degradation of chitosan in the presence of H2O2 solution by gamma irradiation was investigated The molecular weight and the degree of deacetylation of chitosan were determined by gel permeation chromatography (GPC) and infrared spectra (IR), respectively Results showed that oligochitosan with molecular weight Mw < 10 kDa were preparared efficiently by gamma irradiation in small doses, ~8 kGy The obtained oligochitosan imposes effects of increase in the size of leaves of fracaria vesca L The appropriate concentration of oligochitosan used to spray onto fracaria vesca L trees was 50 ppm Keywords: Oligochitosan, Gamma irradiation, fracaria vesca L phản ứng cắt mạch Oligochitosan tự phân hủy sinh học, prebiotic có độc tính thấp, có khả kháng khuẩn [8], [7] kháng nấm [6] Ngồi ra, oligochitosan làm tăng sinh tế bào, tăng cường miễn dịch Mở đầu Chitosan polyme có nguốn gốc tự nhiên, sản phẩm biến tính từ chitin cách loại nhóm axetyl Oligochitosan dẫn xuất chitosan chế tạo 49 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60… thể động vật cách kích thích sản sinh bạch cầu, giảm cholesterol máu có tác dụng làm lành vết thương, vết bỏng [11] Hoạt tính oligochitosan thường định khối lượng phân tử (KLPT, Mw) độ đề axetyl (ĐĐA) Do có nhiều hoạt tính sinh học độc đáo, oligochitosan ứng dụng đa dạng nhiều lĩnh vực khác làm chất điều hòa sinh trưởng, phòng trị nấm bệnh thực vật gia tăng khả miễn dịch động vật Các phương pháp cắt mạch chitosan để chế tạo oligochitosan phổ biến bao gồm: phương pháp hóa học, phương pháp enzym phương pháp chiếu xạ Ưu điểm phương pháp hóa học dễ dàng tiến hành với quy mô lớn điều kiện phản ứng đơn giản Tuy nhiên, hạn chế phương pháp cho hiệu suất thấp có nguy gây nhiễm mơi trường Phương pháp enzym cho hiệu suất cao chi phí đắt Trong đó, phương pháp chiếu xạ có lợi tiến hành dễ dàng với quy mơ lớn để chế tạo oligochitosan đòi hỏi phải sử dụng liều xạ cao [2] Điều dẫn đến khả sản phẩm tạo thành dễ bị cắt mạch nhóm amin phá vỡ vòng glucopyranose [5], làm giảm hoạt tính oligochitosan Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết chế tạo oligochitosan dựa kết hợp đồng thời xạ gamma Co-60 H2O2 Ưu điểm phương pháp tiến hành nhiệt độ phòng, giảm thời gian liều xạ, chế tạo sản phẩm với quy mơ lớn dạng lỏng hay dạng rắn đáp ứng yêu cầu sử dụng Ngoài ra, tác nhân cắt mạch H2O2 xạ gamma Co-60 tác nhân cho thân thiện với môi trường Sản phẩm cắt mạch nghiên cứu ứng dụng làm chất gia tăng số lượng hoa dâu tây (Fragaria vesca L), loại cho hiệu kinh tế cao, trồng phổ biến cao nguyên Lâm Đồng Kết nghiên cứu hướng đến cung cấp chất kích thích tăng trưởng nơng nghiệp có nguồn gốc tự nhiên góp phần phát triển nơng nghiệp sinh thái bền vững Thực nghiệm 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất α - chitosan chế tạo từ vỏ tôm có ĐĐA khoảng 90%, Mw khoảng 50 kDa Dâu tây Labiang (Fragaria vesca L.) mua vườn giống Dâu tây xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai Hydro peroxit (H2O2) sản phẩm tinh khiết Merck, Đức Các hóa chất axit lactic, etanol, amoniac… dùng dạng tinh khiết phân tích Nước cất lần sử dụng cho tồn thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chế tạo oligochitosan Trong nghiên cứu này, oligochitosan chế tạo cách hòa tan g chitosan dung dịch axit lactic 3%, thêm lượng H2O2 30% định mức đến 100 mL để thu dung dịch chiếu xạ chứa 5% chitosan 1% H2O2 Tiến hành chiếu xạ nguồn SVST Co-60/B trung tâm Nghiên cứu Triển khai Công nghệ Bức xạ VINAGAMMA, Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam với suất liều 1,33 kGy/h, khoảng liều đến 15 kGy [5] Dung dịch sau chiếu xạ trung hòa NH4OH 5%, thêm lượng cồn lần thể tích dung dịch mẫu, khuấy đều, sau lọc kết tủa rửa cồn [1] Mẫu sau rửa sạch, để khô tự nhiên sấy nhiệt độ 60°C 2.2.2 Xác định khối lượng phân tử độ đề axetyl chitosan Khối lượng phân tử mẫu chitosan xác định phương pháp sắc kí gel (GPC), máy LC-20AB 50 ĐẶNG XUÂN DỰ oligochitosan để làm đối chứng Thời điểm bắt đầu phun oligochitosan sau giống trồng khoảng tuần Sau đó, oligochitosan phun bổ sung vào ngày thứ 30 60 kể từ lần phun Cây chăm sóc theo quy trình thơng thường canh tác địa phương, xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai Số hoa dâu tây đếm vào ngày thứ 120, 130 140 kể từ trồng Kết tính trung bình cho lơ Sau 140 ngày tuổi, lơ thí nghiệm chia làm nhóm, nhóm đếm số hoa lặp lại để phân tích thống kê, đánh giá khác biệt lô nghiên cứu Kết thảo luận Sự thay đổi KLPT chitosan theo liều xạ thể hình Kết cho thấy KLPT giảm nhanh khoảng thời gian đầu chiếu xạ, khoảng liều từ đến kGy Sau khoảng liều trên, KLPT chitosan suy giảm chậm theo liều xạ Điều nồng độ H2O2 khoảng thời gian đầu chiếu xạ mức cao Ngồi ra, q trình chiếu xạ hình thành nên gốc tự hydroxyl làm phân hủy nhanh H2O2 [4] Do đó, gần q trình cắt mạch chủ yếu xảy giai đoạn đầu trình chiếu xạ Khi liều xạ lớn kGy, phần lớn H2O2 bị phân hủy, nồng độ giảm mạnh nên hiệu cắt mạch giảm theo Shimadzu, Nhật, sử dụng detector RID 10A cột Ultrahydrogel 250 hãng Water, Mỹ, nhiệt độ vận hành cột 40°C, pha động đệm axetat CH3COOH 0,25M/CH3COONa 0,25M, tốc độ dòng 1mL/phút Chất chuẩn sử dụng polysacarit Pullulan có khối lượng phân tử khác từ 738 đến 380 000 Da [1] Mẫu chitosan chuẩn bị cách hòa tan axit axetic 0,25M với nồng độ 0,3% đến tan hoàn toàn, thêm muối CH3COONa 0,25M sau lọc dung dịch qua màng 0,45μm (Millipore filters) Mẫu chitosan tiêm vào cột sắc kí với thể tích khoảng 50 μl Dựa vào thời gian lưu so sánh với đường chuẩn xác định KLPT chitosan Độ đề axetyl chitosan xác định phương pháp hồng ngoại máy FT – IR 8400S, Shimadzu, Nhật ĐĐA tính dựa theo phương trình [3]: ĐĐA,% = 100 – ([31,92 × (A1320/A1420)] -12,00) Trong đó, A1320 A1420 mật độ quang tương ứng đỉnh 1320 1420 cm-1 2.2.3 Khảo sát hiệu ứng gia tăng số lượng hoa oligochitosan dâu tây Chuẩn bị lơ thí nghiệm đánh số từ đến lô gồm có 40 Tiến hành phun oligochitosan có KLPT khoảng 7,5 kDa với nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm từ lô đến lô Lô khơng phun Hình Sự thay đổi KLPT chitosan theo liều xạ 51 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60… khoảng 80% Giá trị nội suy từ bảng Nguyễn Quốc Hiến cộng chế tạo oligochitosan kỹ thuật chiếu xạ Kết cho thấy để chế tạo oligochitosan có KLPT < 10 kDa phải sử dụng liều xạ cao 100 kGy [2] Điều cho thấy có mặt H2O2 nồng độ thấp khoảng 1% nghiên cứu làm giảm đáng kể liều xạ cần thiết để chế tạo oligochitosan Nguyên nhân tượng giải thích hiệu ứng đồng vận (synergistic effect) tác nhân cắt mạch Hiệu ứng đồng vận định nghĩa tương tác đồng thời hai tác nhân phản ứng lớn tổng tương tác thành phần riêng lẻ [5] Duy cộng nghiên cứu hiệu ứng đồng vận tia γ H2O2 để chế tạo oligochitsan dung dịch Kết cho thấy để chế tạo oligochitosan có KLPT < 10 kDa liều xạ cần thiết khoảng 10 kGy [5] Tuy nhiên, nghiên cứu Duy cộng thực β – chitosan, loại chitosan dễ cắt mạch α – chitosan, nồng độ áp dụng 3%, thấp so với nghiên cứu Như vậy, việc áp dụng hiệu ứng đồng vận xạ γ H2O2 cho phép giảm đáng kể lượng chiếu xạ, tăng hiệu chế tạo oligochitosan Cơ chế cắt mạch có mặt đồng thời H2O2 tia γ Ulanski cộng đề nghị [12] Theo đó, gốc tự hydroxyl (•OH) hình thành nhờ trình phân ly xạ nước H2O2 đóng vai trò tác nhân oxy hóa mạnh cắt mạch chitosan: γ ray H2O eaq- , H• , • OH, H 2O2 , H , H3O+ (1) γ ray H2O2 • OH (2) Hơn nữa, sản phẩm q trình phân ly xạ e-aq H• phản ứng với H2O2 để gia tăng gốc hydroxyl •OH [9]: eaq- + H 2O2 • OH + OH (3) H • + H 2O • OH + H 2O (4) Theo Ulanski cộng [12], gốc OH bắt hydro, làm đứt liên kết C – H hình thành gốc cacbohydrat R•, dẫn đến trình chuyển vị cuối liên kết glycoside bị cắt, tạo thành phân tử CTS có KLPT thấp Hằng số tốc độ phản ứng (3) (4) k3 = 1,1×1010 l.mol-1.s-1 k4 = 9×107 l.mol-1.s-1 [4] Điều giải thích nồng độ H2O2 giảm nhanh trình cắt mạch chitosan xảy có hiệu khoảng thời gian đầu chiếu xạ Hình cho thấy oligochitosan, KLPT < 10 kDa, chế tạo liều xạ thấp, khoảng kGy, tương ứng với độ suy giảm KLPT • Bảng 1: Sự thay đổi KLPT ĐĐA chitosan theo liều xạ Liều xạ(*), kGy 2,7 6,7 11,0 15 Thời gian, 11 KLPT, kDa 50 20,5 12,5 7,5 5,5 Độ giảm KLPT, % 59 75 85 89 ĐĐA, % 90 87 87 86 83 (*) Suất liều 1,33 kGy/h 52 ĐẶNG XUÂN DỰ Hình Phổ FT - IR chitosan ban đầu (a) chitosan chiếu xạ liều 6,7 kGy (b); 11 kGy (c); 15 kGy (d) [10] Các đỉnh 1320 1420 cm-1 tương ứng đặc trưng cho dao động kéo giãn liên kết C–N nhóm CH3CONH– (amide III) dao động biến dạng liên kết C–H, hai đỉnh đặc trưng sử dụng để tính tốn thay đổi ĐĐA chitosan [3] Kết xác định cho thấy oligochitosan KLPT khoảng 5,5 kDa, thu liều xạ 15 kGy, có ĐĐA giảm khoảng 8% so với chitosan ban đầu (bảng 1) Kết phù hợp với nghiên cứu Duy cộng cắt mạch chitosan dung dịch chứa 3% chitosan tia γ H2O2 với độ giảm ĐĐA khoảng 10% [5] Như vậy, sử dụng H2O2 nồng độ thấp khoảng 1% kết hợp đồng thời với tia γ cho phép chế tạo hiệu oligochitosan liều xạ thấp khoảng kGy Oligochitosan thu có cấu trúc không thay đổi so với chitosan ban đầu Phổ FT- IR mẫu chitosan ban đầu mẫu chitosan sau chiếu xạ liều khác thể hình Kết cho thấy cấu trúc oligochitosan thu (hình 2b, c, d) không thay đổi so với chitosan ban đầu (hình 2a) Các đỉnh đặc trưng tiêu biểu cho nhóm liên kết chitosan xuất mẫu oligochitosan Đỉnh phổ nằm vùng 3200 – 3500 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo giãn liên kết N–H nhóm amine liên kết O–H Đỉnh 1655 1595 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo giãn liên kết C=O nhóm –CONH– (amide I) dao động uốn –NH nhóm –CONH– (amide II) Các đỉnh 1072, 1028, 1153 893 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo giãn liên kết C–O, dao động kéo giãn C–O–C vòng glucopyranose dao động liên kết β – 1,4 glycoside 53 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60… Hình Cây dâu tây 140 ngày tuổi lơ đối chứng (a) lô 2, phun oligochitosan nồng độ 50 ppm (b) thêm Tuy nhiên, theo nhận định chúng tơi oligochitosan kháng sinh thực vật [9] sử dụng liều cao (150 ppm) gây ngộ độc cho dẫn đến ức chế khả hoa Ảnh hưởng oligochitosan đến khả cho hoa dâu tây theo ngày tuổi thể hình Kết cho thấy số lượng hoa thu sau 120, 130 140 ngày lô có phun oligochitosan tương đối lớn so với lơ đối chứng Hình cho thấy khác số lượng cuống hoa dâu tây sau 140 ngày tuổi Ở lơ đối chứng (hình 3a) số lượng cuống hoa thu tương đối so với lơ có phun oligochitosan nồng độ 50 ppm (hình 3b) Trong trình theo dõi, nhận thấy dâu tây bắt đầu hoa 120 ngày tuổi lô 1, 2, 3, riêng lơ chưa quan sát thấy hoa sau thời gian Nguyên nhân vấn đề chưa rõ cần nghiên cứu Hình Ảnh hưởng oligochitosan đến khả cho hoa dâu tây 54 ĐẶNG XUÂN DỰ Bảng Số lượng hoa trung bình dâu tây sau 140 ngày tuổi lơ khác Nhóm (8 cây/nhóm) Trung bình Lơ đối Lơ chứng (50 (0 ppm) ppm) 42,8 43,8 42,7 43,5 42,7 43,7 42,9 43,9 42,7 43,6 42,8 ± 0,1 43,7 ± 0,2 Lô (100 ppm) 43,7 43,6 43,7 43,5 43,5 43,6 ± 0,1 liều xạ thấp, khoảng kGy Cấu trúc oligochitosan thu khơng khác biệt so với chitosan ban đầu ĐĐA oligochitosan KLPT 5,5 kDa giảm khoảng 8% Oligochitosan KLPT khoảng 7,5 kDa có hiệu ứng gia tăng số lượng hoa dâu tây Nồng độ phù hợp oligochitosan để phun lên dâu tây khoảng 50 ppm Kết phân tích ANOVA chiều kiểm định LSD chương trình SPSS 16.0 nhóm lặp lại lơ thí nghiệm 140 ngày tuổi (Bảng 2) cho thấy nồng độ 50 100 ppm oligochitosan phun lên dâu tây cho hiệu gia tăng số lượng hoa cao so với lô đối chứng (p = 0,00) Ngoài ra, số lượng hoa lô tương ứng với nồng độ oligochitosan phun 50 100 ppm khác có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) Điều chứng tỏ oligochitosan nồng độ thấp khoảng 50 ppm có khả kích thích gia tăng số lượng hoa tốt so với nồng độ 100 ppm Đối với lô 4, nồng độ oligochitosan 150 ppm, cho hoa sau 133 ngày tuổi, quan sát ban đầu cho thấy số lượng hoa không đồng so với lô 1, Cơ chế kích thích ức chế khả cho hoa oligochitosan lên dâu tây cần nghiên cứu thêm Tuy nhiên, việc sử dụng oligochitosan phun cho dâu tây theo nên tiến hành liều thấp, với nồng độ nhỏ 100 ppm Kết luận Oligochitosan có KLPT < 10 kDa chế tạo hiệu phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan 5%, H2O2 1% TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Xuân Dự, Đinh Quang Khiếu, Diệp Khanh, Nguyễn Quốc Hiến “Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận dung Co – 60 H2O2 cắt mạch chitosan chế tạo oligochitosan”, Tạp chí Hóa Học, 51(2C), 627-631 (2003) Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quang Luân, Trương Thị Hạnh, Phạm Thị Lệ Hà “Nghiên cứu chế tạo oligochitosan kỹ thuật xạ”, Tạp chí Hóa học, 38(2), 22-44 (2000) J Brugnerotto, J Lizardi, F M Goycoolea, W Arguelles – Monal, J Desbrieres, M Rinaudo “An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization”, Polymer, 42, 3569-3580 (2001) G V Buxton, C L Greenstock, W P Helman, A B Ross “Critical review of rate constants for hydrated electron, hydrogen atoms and hydroxyl radical (OH/O-) in aqueous”, Journal of Physical and Chemical Reference Data, 17(2), 513-886 (1988) 55 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60… S K Kim, N Rajapakse “Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): A review”, Carbohydrate Polymers, 62, 357-368 (2005) N N Duy, D V Phu, N T Anh, N Q Hien “Synergistic degradation to prepare oligochitosan by - irradiation of chitosan solution in the presence of hydrogen peroxide”, Radiation Physical Chemistry, 80, 848-853 (2011) 10 10.J Kumirstra, M Czerwicka, Z Kaczynski, A Bychowska, K Brozowski, J Thoming, P Stepnowski “Application of spectroscopic methods for structural analysis of chitin and chitosan”, Marine Drugs, 8, 1567-1636 (2010) S Hirano, N Nagao “Effects of chitosan, pectic acid, lysozyme and chitinase on the growth of several phytopathogens” Agricultural and Biological Chemistry, 53, 3065-3066 (1989) 11 J Shao, Y Yang, Q Zhong “Study on preparation of oligoglucosamine by oxidative degradation under microwave”, Polymer Degradation and Stability, 82, 395398 (2003) 12 P Ulanski, C von Sontag “OH – radical induced chain scission of chitosan in the absence and present of dioxygen”, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions, 2, 2022-2028 (2000) Y J Jeon, S K Kim “Effect of antimicrobial activity by chitosan oligosaccharides Nconjugated with asparagines”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 11, 281-286 (2001) Y J Jeon, P J Park, S K Kim “Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor”, Carbohydrate Polymers, 44, 71-76 (2001) Ngày nhận bài: 28/7/2017 Biên tập xong: 15/9/2017 56 Duyệt đăng: 20/9/2017 ... vật gia tăng khả miễn dịch động vật Các phương pháp cắt mạch chitosan để chế tạo oligochitosan phổ biến bao gồm: phương pháp hóa học, phương pháp enzym phương pháp chiếu xạ Ưu điểm phương pháp. .. theo liều xạ 51 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 khoảng 80% Giá trị nội suy từ bảng Nguyễn Quốc Hiến cộng chế tạo oligochitosan kỹ thuật chiếu xạ Kết cho... thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chế tạo oligochitosan Trong nghiên cứu này, oligochitosan chế tạo cách hòa tan g chitosan dung dịch axit lactic 3%, thêm lượng H2O2 30%