TỔNG HỢP NANO BẠCCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA Co60 – ỨNG DỤNG LÀM THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT

TẠP CHÍ ĐẠI HỌC SÀI GÒN Số - Tháng 6/2011 TỔNG HỢP NANO BẠC/CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA Co-60 – ỨNG DỤNG LÀM THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT (*) LẠI THỊ KIM DUNG (**) LÊ NGHIÊM ANH TUẤN (***) BÙI DUY DU TÓM TẮT Nội dung báo nêu kết nghiên cứu tổng hợp chất CTS-Ag phương pháp chiếu xạ  Co-60 với liều xạ chuyển hố bão hồ Dbh = 16 kGy, khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định CTS-Ag Kết khảo sát hoạt tính cho thấy IC50 0,59%, nồng độ 1% 2% CTS-Ag thể hoạt tính kháng nấm Corticium salmonicolor cao hẳn so với thuốc đối chứng Validin 3DD ABSTRACT Silver nano particle of polychitosan (Mw = 380 kDa, DDA = 70) is synthesized by gamma radiation dosed Co-60 with Dbh = 16 kGy, collection of an average particle size of colloidal silver nano mM obtained from nm to nm and is well soluble in water at pH to 11 Anti-fungal activity of the CTS-Ag for Corticium salmonicolor is conducted at concentration of 1% and IC50 of 0,59% MỞ ĐẦU (*) Hiện nay, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) để phòng trừ sâu hại, dịch bệnh bảo vệ mùa màng, giữ vững an ninh lương thực quốc gia biện pháp quan trọng chủ yếu, đa số loại thuốc BVTV thường chất hố học có độc tính cao, khơng quản lí chặt chẽ sử dụng cách gây ô nhiễm môi trường sinh thái, ảnh hưởng tới sức khoẻ cộng đồng Vì vậy, mục tiêu phấn đấu ngành nông nghiệp sản xuất sản phẩm nhằm bảo đảm an toàn, vệ sinh thực phẩm thân thiện với môi trường Việc đầu tư nghiên cứu ứng dụng rộng rãi chất có hoạt tính sinh học từ thiên nhiên xem giải pháp hữu hiệu, góp phần tìm lời giải cho tốn phát triển nơng nghiệp theo hướng bền vững Trong năm gần đây, nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu đến () TS, Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam () KS, Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam () TS, Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm phân bón vùng Nam Bộ - Cục Trồng trọt 155 chitin/chitosan chất có hoạt tính sinh học đa tác dụng Chitosan dẫn xuất nghiên cứu sử dụng nhiều lĩnh vực: dược phẩm (trị vết thương, vết bỏng, làm bao bì thuốc, thuốc chữa bệnh khớp) [1], thực phẩm chức (giảm béo, ), mĩ phẩm (kem dưỡng da, dầu gội đầu, ) Trong cơng nghiệp chitosan cịn dùng làm chất hấp thụ kim loại xử lí nước Trong nông nghiệp chitosan dùng làm chất diệt khuẩn bảo quản thực phẩm, thuốc BVTV [2, 3, 4] Ngày nay, trước gia tăng loại nấm gây bệnh cho trồng thiếu thuốc đặc trị việc lựa chọn chế phẩm polychitosan chứa bạc nano quan tâm Hơn bạc nano không gây phản ứng phụ, không gây độc cho người vật nuôi Trong báo chúng tơi trình bày kết nghiên cứu tổng hợp chất kích kháng sinh học từ polychitosan chứa bạc nano (CTS-Ag) dùng làm thuốc BVTV THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu - Bạc nitrat (AgNO3): loại PA, Merck, Đức - Etanol (C2H5OH): loại P - Chitosan DDA 70, (Mw) 380 kDa - Môi trường nuôi nấm: PGA - Validin 3DD - Giống nấm Corticium salmonicolor 2.2 Phương pháp 2.2.1 Xác định DDA% khối lượng phân tử (Mw) chitosan: - DDA% chitosan xác định theo phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) A1320/A1420 = 0,3822 + 0,03133  DA DDA độ đề axetyl; DA độ axetyl A cường độ hấp thụ đỉnh 1320 1420 phổ IR - Mw chitosan xác định theo phương pháp sắc kí gel thấm qua (GPC) 2.2.2 Thử hoạt tính kháng nấm CTS-Ag lên nấm Corticium salmonicolor gây bệnh nấm hồng số công nghiệp Theo nguyên tắc, để so sánh tác động chất thí nghiệm người ta dùng giá trị IC50 (nồng độ tối thiểu ức chế 50% sinh trưởng) [5] Tính phần trăm ức chế sinh trưởng theo công thức: % ức chế sinh trưởng = [(DK1 – DK2)/DK1] x 100 Trong đó: DK1: đường kính tơ nấm trung bình mẫu đối chứng DK2: đường kính tơ nấm trung bình mẫu thí nghiệm Từ % ức chế sinh trưởng nồng độ xử lí, tiến hành xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính dạng y = ax + b Từ suy IC50 (nồng độ ức chế 50% tăng trưởng nấm) 2.3 Cách tiến hành 2.3.1 Tổng hợp CTS-Ag: Hoà tan chitosan ( M w = 380 kDa, DDA = 70) dung dịch axid lactic theo tỉ lệ 1(w/v0):1(v/v0) để ổn định 16 giờ, lọc qua lưới thép không rỉ (74 micron) điều chỉnh pH dung dịch NaOH 2M, khuấy phút, nhỏ từ từ bạc nitrat vào dung dịch theo nồng độ định, khuấy 10 phút, sau chia vào ống nghiệm có nút kín khí, tiến hành sục khí 156 nitơ phút Đưa vào nguồn chiếu xạ  Co60 với liều xạ chuyển hố bão hồ Dbh = 16 kGy, ion Ag+ chuyển hố hồn tồn thành kim loại Ag thu chất CTS-Ag [6] 2.3.2 Thử hoạt tính kháng nấm Corticium salmonicolor: Chất CTS-Ag pha nồng độ 1,0 %, 1,6%, 2% Validin 3DD pha nồng độ 3% (theo hướng dẫn sử dụng) để thử hiệu lực với nấm Mỗi nghiệm thức lặp lại lần lấy giá trị trung bình Cách làm môi trường PGA: Khoai tây cắt dạng hạt lựu bỏ vào bình cầu, thêm nước cất đun hồi lưu 60 phút, lọc lấy dịch cho vào bình định mức, thêm nước cất đến 1000 ml Cho agar đường glucose khuấy cho tan đều, đun sôi hấp tiệt trùng nồi autoclave 1210C 15 phút Để nguội đến 450C, hút lượng thuốc thử cần khảo sát vào bình chứa mơi trường PGA, lắc đổ đĩa petri vô trùng Ở mẫu đối chứng lượng thuốc thử thay nước cất vô trùng Ở nghiệm thức so sánh chất thử Validin 3DD pha theo tỉ lệ hướng dẫn Cấy nấm C salmonicolor vào tâm đĩa, ủ nhiệt độ NH2 + Ag NH2  NH2 + Ag NH2 NH2 + Ag NH2 - e aq + Ag ,H 250C Theo dõi đường kính sinh trưởng tơ nấm theo dạng tỏa tròn (mm) khoảng thời gian xác định sau cấy [5] KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Trên phân tử chitosan chứa nhóm chức -OH vị trí C-3 C-6, -NH2 vị trí C-2 linh động lực cao với ion kim loại nên thích hợp sử dụng làm chất ổn định chế tạo nano kim loại Trong dung dịch Ag+ tạo phức với chitosan thơng qua liên kết điện với nhóm amin (NH2Ag+) chiếu xạ, tác nhân e-aq H khử Ag+ thành Ag0 Sau Ag0 hấp thụ Ag+ tạo thành Ag2+, trình tiếp diễn tạo Agn+ tạo hạt bạc nano ổn định cấu trúc mạng chitosan Do cấu trúc mạng cồng kềnh lớp chitosan bao phủ bề mặt hạt bạc tích điện dương (-NH3+) nên gây lực đẩy tĩnh điện hiệu ứng ức chế không gian làm hạn chế kết tụ hạt bạc Ngồi chitosan cịn thể chất bắt gốc tự OH tạo thành gốc tự chitosan có khả khử bạc ion dạng cluster, góp phần quan trọng cho q trình phát triển hình thành hạt bạc nano Tiến trình khử bạc ion, phản ứng bắt gốc tự OH khử ion bạc cluster tạo bạc nano sau [7]: NH2 + Agn NH2 NH2 + Agn NH2 NH2+ e aq , H Agn R NH2 Agn OH + RC5H5O(OH)3(NH2)CH2OH  RC5H5O(OH)3(NH2)CH2OH + H2O 157 Agn+ + RC5H5O(OH)3(NH2)CH2OH  Agn + RC5H5O(OH)3(NH2)CH2OH Như vậy, cho thấy khả sử dụng chitosan thay chất khử hoá học, chất bắt gốc tự để chế tạo keo bạc nano phương pháp chiếu xạ triển vọng Hơn nữa, keo bạc nano bảo vệ chitosan có nhiều điện tích dương (+) bề mặt (do proton hố nhóm –NH2) góp phần gia tăng hoạt tính sát khuẩn bạc nano [8] Khả ổn định keo bạc nano polyme phụ thuộc chủ yếu vào liên kết hoá học, tương tác tĩnh điện hiệu ứng không gian [9] Chúng sử dụng kĩ thuật chụp ảnh có độ phóng đại cao (FE-SEM, FE-TEM, UV-vis ) để xác định cấu trúc, tính chất polychitosan chứa nano bạc (CTS-Ag) dụng liều xạ chuyển hố bão hồ Dbh = 16 kGy kích thước hạt trung bình keo bạc nano mM (CTS-Ag) đạt từ nm đến nm tan tốt nước pH từ đến 11 Hình 3.2 mơ tả phổ hấp thụ UV-vis mẫu pha loãng nước theo tỉ lệ thể tích 1/50 (tương đương với 0,1mM bạc) Kết cho thấy, dung dịch chitosan (CTS) có đỉnh hấp thụ cực đại 3.1 Xác định cấu trúc, tính chất CTS-Ag Dùng CTS 70 2% với Mw 380 kDa làm chất ổn định/chất bắt gốc tự do, sử vùng khả khiến max 408,5 nm đỉnh đặc trưng CTS/Ag-nano Kết tương tự nghiên cứu Murugadoss [10] max 285 nm với cường độ yếu, ion hố nhóm amin (-NH2 + H+  -NH3+) CTS môi trường axit Dung dịch CTS/Ag+ trước chiếu xạ có đỉnh hấp thụ max 296 nm đỉnh hấp thụ đặc trưng phức CTS/Ag+, sau chiếu xạ cực đại đỉnh hấp thụ dịch chuyển sang 158 Tần số, % 60 50 40 30 20 10 dtb: 7,3  1,4 10 18 26 34 42 Dtb nm 380kDa Hình 3.1: Ảnh TEM phân bố kích thước hạt keo bạc nano CTS-Ag Hình 3.2: Phổ UV-vis dung dịch pha loãng nước 1/50 - CTS 70 2% chiếu xạ 16 kGy - CTS 70 2%, Ag+ mM - Keo bạc nano CTS 70 2%, Ag+ mM chiếu xạ 16 kGy (CTS-Ag) 3.2 Khảo sát độ ổn định CTS-Ag theo thời gian: Bảng 3.1: Giá trị dtb, E max CTS-Ag theo thời gian lưu giữ Thời gian (ngày) Pha loãng nước 1/50 (v/v) Khơng pha lỗng max,nm E Et/E0100 dtb ,nm max,nm E Et/E0100 dtb, nm 408,5 1,12 100,0 7,21,3 408,5 1,12 100,0 7,21,3 30 411,5 1,08 89,3 422,5 0,60 53,6 60 418,0 1,08 96,4 424,5 0,54 48,2 90 418,5 1,04 92,9 423,5 0,44 39,3 120 417,5 1,06 94,6 423,5 0,40 35,7 150 417,0 1,15 96,7 423,5 0,32 28,6 180 416,0 1,10 98,2 424,5 0,25 22,3 7,71,6 7,71,6 159 13,74,1 18,45,2 Kết bảng 3.1 cho thấy CTS-Ag không pha loãng ổn định sau tháng lưu giữ Tuy nhiên pha loãng CTS-Ag nước với tỉ lệ 1/50 mật độ quang E giảm theo thời gian Sau tháng E giảm xuống 36% sau tháng giảm cịn 22% so với thời điểm ban đầu Bước lưu giữ đến tháng Sự giảm E tăng max, chứng tỏ, dung dịch CTS-Ag có kết tụ, hạt bạc nano hình thành hạt có kích thước lớn Mẫu pha lỗng nước sau tháng, dtb từ 7,7 nm tăng lên đến ~ 14 nm Kết chứng tỏ CTS-Ag keo kị nước, pha loãng phải sử dụng bổ sung chất hoạt động bề mặt để bảo vệ sóng hấp thụ cực đại max mẫu pha lỗng có xu hướng dịch chuyển sang vùng ánh sáng đỏ (~ 423 nm) dao động khơng đổi quanh vùng 423 nm theo suốt q trình Kết thử hoạt tính CTS-Ag nấm hồng Bảng 3.2: khả ức chế CTS-Ag nấm hồng (C salmonicolor) CTS-Ag Validin 3DD ĐC (mm/ngày) 2,840,19b 70,241,24b 1,6 2,240,09c 75,860,46c 2,0 Thuốc Nồng độ (%) 1,0 STT 1,800,14c 79,981,59c 3,130,14b 67,500,80b 10,330,19a 00,000,00a % ức chế IC50 (%) 0,59 Các chữ khác cột bảng số liệu thể khác biệt mặt thống kê độ tin cậy 95% Qua bảng 3.2 cho thấy, CTS-Ag (1%) hiệu lực kháng nấm C samonicolor khơng có khác biệt mặt thống kê độ tin cậy 95% với mẫu so sánh Ở hai nồng độ 1,6% 2% PCS-02 có hiệu lực kháng nấm C samonicolor cao mẫu so sánh (có khác biệt mặt thống kê độ tin cậy 95%), IC50 thấp 0,59% Phần trăm ức chế trung bình mẫu thử chứa CTS-Ag khoảng 70,241,24 - 79,981,59%, phần trăm ức chế trung bình mẫu so sánh 67,500,80% 160 KẾT LUẬN thể hoạt tính kháng nấm Corticium salmonicolor cao hẳn so với thuốc đối chứng Validin3DD Bài báo trình bày nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp keo bạc nano phương pháp chiếu xạ chất ổn định CTS - Cơng trình nghiên cứu hoàn thành với hỗ trợ kinh phí từ đề tài sở KH&CN tỉnh Bình Dương CTS-Ag có M wCTS = 380 kDa, dtb = 7,3±1,4 nm tan pH từ – 11 - CTS-Ag khơng pha lỗng có độ ổn định sau tháng lưu giữ - Ở nồng độ 1% 2% CTS-Ag TÀI LIỆU THAM KHẢO P Sanpui et al, The antibacterial properties of a novel chitosan-Ag-nanoparticle composite, International Journal of Food Microbiology, 124(2), pp.142-146, 2008 H.J Park et al., A new composition of nanosized silica-silver for control of various plant diseases, The Plant Pathology Journal, 22(3), pp.295-302, 2006 M Singh et al., Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 3(3), pp.115-122, 2008 D.V Phu et al., Synthesis and antimicrobial effects of colloidal silver nanoparticles in chitosan by -irradiation, Journal of Experimental Nanoscience, 5(2), pp.207-213, 2010 Lê Xuân Phương, Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, 2003 S.P Ramnani, J Biswal, S Sabharwal, Synthesis of silver nanoparticles supported on silica aerogel using gamma radiolysis, Rad Phys Chem., 76, pp.1290-1294, 2007 Janata, E., Structure of the trimer silver cluster Ag+, J Phys Chem B 107, 73347336, 2003 P Chen et al., Synthesis of silver nanoparticles by -ray irradiation in acetic water solution containing chitosan, Rad Phys Chem.,76, pp.1165-1168, 2007 B.D Du et al., Preparation of colloidal silver nanoparticles in poly (Nvinylpyrrolidone) by -irradiation, Journal of Experimental Nanoscience, 3(3), pp.207-213, 2008 161 10 A Murugadoss, A Chattopadhyay, A ‘green’ chitosan-silver nanoparticles composite as a heterogeneous as well as micro-heterogeneous catalyst, Nanotechnology, 19(1), pp.01563/1-01563/9, 2008 162 163 _ In 1000 khổ 19 x 27 cm, Công Ty TNHH Một Thành Viên In Kinh Tế (thuộc trường Đại học Kinh tế TP Hồ Chí Minh) 279 Nguyễn Tri Phương, P.5, Q.10 Nộp lưu chiểu tháng …… năm 2011 164 165 ... RC5H5O(OH)3(NH2)CH2OH Như vậy, cho thấy khả sử dụng chitosan thay chất khử hoá học, chất bắt gốc tự để chế tạo keo bạc nano phương pháp chiếu xạ triển vọng Hơn nữa, keo bạc nano bảo vệ chitosan có nhiều điện tích... Corticium salmonicolor cao hẳn so với thuốc đối chứng Validin3DD Bài báo trình bày nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp keo bạc nano phương pháp chiếu xạ chất ổn định CTS - Cơng trình nghiên... bạc nano quan tâm Hơn bạc nano không gây phản ứng phụ, không gây độc cho người vật nuôi Trong báo chúng tơi trình bày kết nghiên cứu tổng hợp chất kích kháng sinh học từ polychitosan chứa bạc nano