Trong nghiên cứu này, chitosan đã được cắt mạch trong dung dịch chitosan/H2O2 bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60. Khối lượng phân tử (Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA) của chitosan lần lượt được xác định bằng phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC) và phương pháp phổ hồng ngoại (IR).
Số 31 (56) - Tháng 8/2017 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN Chế tạo Oligochitosan phương pháp chiếu xạ Gamma Co-60 dung dịch Chitosan/H2O2 khảo sát hiệu ứng gia tăng kích thước dâu tây (Fragaria Vesca L.) Preparation of Oligochitosan by Gamma irradiation onto Chitosan/H2O2 solution and examining effects of increase in the size of leaves on Strawberry (Fragaria Vesca L.) TS Đặng Xuân Dự, Trường Đại học Sài Gòn Dang Xuan Du, Ph.D., Saigon University ThS Trần Thị Anh Thư, Trường THPT chuyên Hùng Vương, Gia Lai Tran Thi Anh Thu, MSc., Hung Vuong High School, Gia Lai Province TS Lê Công Nhân, Trường Đại học Sài Gòn Le Cong Nhan, Ph.D., Saigon University Tóm tắt Trong nghiên cứu này, chitosan cắt mạch dung dịch chitosan/H2O2 phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 Khối lượng phân tử (Mw) độ đề axetyl (ĐĐA) chitosan xác định phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC) phương pháp phổ hồng ngoại (IR) Kết cho thấy oligochitosan khối lượng phân tử Mw ~ 7,5 kDa chế tạo cách hiệu phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 dung dịch chitosan/H2O2 liều xạ thấp, khoảng 11 kGy Oligochitosan chế tạo có hiệu ứng gia tăng kích thước dâu tây Nồng độ phù hợp oligochitosan để phun lên dâu tây khoảng 50 ppm Từ khóa: Oligochitosan, xạ Gamma, dâu tây Abstract In this study, the degradation of chitosan in the presence of H2O2 solution by gamma irradiation was investigated The molecular weight and the degree of deacetylation of chitosan were determined by gel permeation chromatography (GPC) and infrared spectra (IR), respectively Results showed that oligochitosan with molecular weight Mw ~7,5 kDa were preparared efficiently by gamma irradiation in small doses, ~11 kGy The obtained oligochitosan imposes effects of increase in the size of leaves of fracaria vesca L The appropriate concentration of oligochitosan used to spray onto fracaria vesca L trees was 50 ppm Keywords: Oligochitosan, Gamma irradiation, Fracaria Vesca L CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH… Mở đầu Oligochitosan polyme có nguồn gốc tự nhiên, sản phẩm biến tính từ chitosan phản ứng cắt mạch Oligochitosan tự phân hủy sinh học, prebiotic có độc tính thấp, có khả kháng nấm [6] kháng khuẩn [7] [8] Ngồi ra, oligochitosan làm tăng sinh tế bào, tăng cường miễn dịch thể động vật cách kích thích sản sinh bạch cầu, giảm cholesterol máu có tác dụng làm lành vết thương, vết bỏng [11] Do có nhiều hoạt tính sinh học độc đáo, oligochitosan ứng dụng đa dạng nhiều lĩnh vực khác làm chất điều hòa sinh trưởng, phòng trị nấm bệnh thực vật gia tăng khả miễn dịch động vật Hoạt tính oligochitosan thơng thường bị chi phối khối lượng phân tử (KLPT, Mw) độ đề axetyl (ĐĐA) Vì vậy, chế tạo oligochitosan từ chitosan ban đầu thơng số quan tâm trình phản ứng Các phương pháp chế tạo oligochitosan phổ biến bao gồm: phương pháp hóa học, phương pháp enzym phương pháp chiếu xạ Phương pháp hóa học có ưu điểm điều kiện phản ứng đơn giản nên dễ dàng tiến hành với quy mô lớn Tuy nhiên, hạn chế phương pháp hiệu suất thấp có nguy gây nhiễm mơi trường Phương pháp enzym có lợi cho hiệu suất cao chi phí lại đắt Phương pháp chiếu xạ xem thân thiện với mơi trường tiến hành dễ dàng với quy mô lớn, nhiên để chế tạo oligochitosan thường phải sử dụng liều xạ cao [2], điều dẫn đến sản phẩm tạo thành dễ bị cắt mạch nhóm amin phá vỡ vòng glucopyranose [5], làm giảm hoạt tính oligochitosan Trong báo này, chúng tơi trình bày kết chế tạo oligochitosan kết hợp đồng thời xạ gamma Co-60 H2O2 nhằm giảm liều xạ Oligochitosan thu sau phản ứng cắt mạch ứng dụng làm chất gia tăng kích thước dâu tây (Fragaria vesca L), loại trồng phổ biến cao nguyên Lâm Đồng, cho hiệu kinh tế cao Kết nghiên cứu sở để chế tạo chế phẩm kích thích tăng trưởng thực vật có nguồn gốc tự nhiên góp phần phát triển nơng nghiệp bền vững Thực nghiệm 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất Chitosan ban đầu chế tạo từ vỏ tơm có Mw khoảng 50 kDa, ĐĐA khoảng 90% Dâu tây Labiang (Fragaria vesca L.) mua vườn giống dâu tây xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai Hydro peroxit (H2O2) sản phẩm tinh khiết Merck, Đức Các hóa chất axit lactic, etanol, amoniac… dùng dạng tinh khiết phân tích Nước cất lần sử dụng cho tồn thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chế tạo oligochitosan Hòa tan g chitosan dung dịch axit lactic 3%, thêm lượng H2O2 30% định mức đến 100 mL để thu dung dịch chiếu xạ chứa 5% chitosan 1% H2O2 Tiến hành chiếu xạ đến 11 kGy [5] nguồn SVST Co-60/B trung tâm Nghiên cứu Triển khai Công nghệ Bức xạ VINAGAMMA, Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam với suất liều 1,33 kGy/h Dung dịch sau chiếu xạ trung hòa NH4OH 5%, thêm lượng cồn lần thể tích dung dịch mẫu, khuấy đều, sau lọc kết tủa rửa cồn [1] Mẫu sau rửa sạch, để khô tự nhiên sấy nhiệt độ 60°C ĐẶNG XUÂN DỰ - TRẦN THỊ ANH THƯ - LÊ CÔNG NHÂN 2.2.2 Xác định khối lượng phân tử độ đề axetyl chitosan Khối lượng phân tử oligochitosan xác định phương pháp sắc kí gel (GPC), máy LC-20AB Shimadzu, Nhật, sử dụng detector RID - 10A cột Ultrahydrogel 250 hãng Water, Mỹ, nhiệt độ vận hành cột 40°C, pha động đệm axetat CH3COOH 0,25M/CH3COONa 0,25M, tốc độ dòng 1mL/phút Chất chuẩn sử dụng polysacarit Pullulan có khối lượng phân tử (KLPT) khác từ 738 đến 380 000 Da [1] Mẫu oligochitosan chuẩn bị cách hòa tan axit axetic 0,25M với nồng độ 0,3% đến tan hoàn toàn, thêm muối CH3COONa 0,25M sau lọc dung dịch qua màng 0,45μm (Millipore filters) Mẫu oligochitosan tiêm vào cột sắc kí với thể tích khoảng 50 μl Dựa vào thời gian lưu so sánh với đường chuẩn xác định KLPT oligochitosan Độ đề axetyl (ĐĐA) oligochitosan xác định phương pháp hồng ngoại máy FT – IR 8400S, Shimadzu, Nhật ĐĐA tính dựa theo phương trình [3]: ĐĐA, % = 100 – ([31,92 × (A1320/A1420)] -12,00) Trong đó, A1320 A1420 mật độ quang tương ứng đỉnh 1320 1420 cm-1 2.2.3 Khảo sát hiệu ứng gia tăng kích thước oligochitosan dâu tây Chuẩn bị lơ thí nghiệm đánh số từ đến lơ gồm có 40 Tiến hành phun oligochitosan có KLPT khoảng 7,5 kDa với nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm từ lô đến lô Lô không phun oligochitosan để làm đối chứng Thời điểm bắt đầu phun oligochitosan sau giống trồng khoảng tuần Sau đó, oligochitosan phun bổ sung vào ngày thứ 30 60 kể từ lần phun Cây chăm sóc theo quy trình thơng thường canh tác địa phương, xã An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai Kích thước dâu tây theo đo theo thời gian đến 120 ngày tuổi Sau 120 ngày tuổi, lơ thí nghiệm chia làm nhóm, nhóm đo kích thước lặp lại để phân tích thống kê chương trình SPSS 16.0 đánh giá khác biệt lô nghiên cứu Kết thảo luận Mẫu Oligochitosan thu liều xạ ~11 kGy có KLPT Mw ~7,5 kDa Như vậy, KLPT chitosan giảm 85% liều xạ thấp có mặt H2O2 1% Nguyễn Quốc Hiến cộng cắt mạch chitosan kỹ thuật chiếu xạ Kết thu oligochitosan có KLPT ~ 10 kDa cần liều xạ lên đến 100 kGy [2] Điều chứng tỏ có mặt H2O2 1% nghiên cứu làm giảm đáng kể liều xạ cần thiết để chế tạo oligochitosan Hiện tượng giải thích hiệu ứng đồng vận (synergistic effect) H2O2 tia γ q trình cắt mạch Theo đó, gốc tự hydroxyl (•OH) hình thành nhờ q trình phân ly xạ nước H2O2 đóng vai trò tác nhân oxy hóa mạnh cắt mạch chitosan [12]: γ ray H 2O eaq , H • , • OH, H 2O2 , H , H 3O+ (1) (2) Ngồi ra, sản phẩm q trình phân ly xạ e-aq H• phản ứng với H2O2 để gia tăng gốc hydroxyl •OH [9]: e-aq + H 2O2 • OH + OH (3) (4) H • + H 2O2 • OH + H 2O γ ray H 2O2 • OH Gốc •OH đóng vai trò tác nhân bắt hydro, làm đứt liên kết C – H hình thành gốc cacbohydrat R•, dẫn đến q trình chuyển vị cuối liên kết glycoside bị cắt, tạo thành phân tử chitosan có KLPT thấp hay oligochitosan [12] CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH… Hình Phổ FT - IR chitosan ban đầu (a) oligochitosan (b) dao động kéo giãn C–O–C vòng glucopyranose dao động liên kết β – 1,4 glycoside [10] Các đỉnh 1320 1420 cm-1 tương ứng đặc trưng cho dao động kéo giãn liên kết C–N nhóm CH3CONH– (amide III) dao động biến dạng liên kết C–H, hai đỉnh đặc trưng sử dụng để tính tốn thay đổi ĐĐA chitosan [3] Từ phổ FT-IR DĐA oligochitosan xác định dựa vào phương trình mục 2.2.2 cho giá trị 86%, giảm khoảng 4% so với chitosan ban đầu Như vậy, kết hợp đồng thời tia γ với H2O2 nồng độ thấp khoảng 1% chế tạo oligochitosan liều xạ thấp khoảng 11 kGy Oligochitosan thu có ĐĐA giảm khơng đáng kể cấu trúc không thay đổi so với chitosan ban đầu Phổ FT - IR oligochitosan chitosan ban đầu thể hình Kết cho thấy cấu trúc oligochitosan thu (hình 1b) khơng khác biệt so với chitosan ban đầu (hình 1a) Phổ FT-IR oligochitosan xuất hầu hết đỉnh đặc trưng tiêu biểu cho nhóm liên kết có chitosan ban đầu Đỉnh 1655 1595 cm1 đặc trưng cho dao động kéo giãn liên kết C=O nhóm –CONH– (amide I) dao động uốn –NH nhóm – CONH– (amide II) Đỉnh phổ nằm vùng 3200 – 3500 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo giãn liên kết N–H nhóm amine liên kết O–H Các đỉnh 1072, 1028, 1153 893 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo giãn liên kết C–O, Hình Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan đến chiều dài ĐẶNG XUÂN DỰ - TRẦN THỊ ANH THƯ - LÊ CƠNG NHÂN Hình Chiều dài dâu tây 120 ngày tuổi lô đối chứng (a) lơ (b) Hình mơ tả thay đổi kích thước dâu tây từ 75 đến 120 ngày tuổi Kết cho thấy nồng độ 50 ppm oligochitosan (lơ 1), kích thước dâu tây có phát triển theo thời gian tương đối tốt so với lơ lại Kết quan sát sơ cho thấy kích thước dâu tây sau 120 ngày tuổi lô phun oligochitosan với nồng độ 50 ppm tương đối lớn so với lơ đối chứng (hình 3) Bảng Chiều dài trung bình dâu tây (cm) sau 120 ngày tuổi lơ khác Nhóm (8 cây/nhóm) Lơ đối chứng Lơ (50 ppm) Lơ (100 ppm) Lô (150 ppm) Trung bình 7,7 7,4 7,8 7,7 7,6 7,6 ± 0,2 a 8,4 8,3 8,5 7,9 8,0 8,2 ± 0,3 b 7,4 7,5 7,2 7,5 7,3 7,4 ± 0,1 c 7,9 8,0 7,5 7,6 7,8 7,8 ± 0,2 a Kết phân tích ANOVA số liệu bảng cho thấy kích thước lơ khác có ý nghĩa thống kê (p = 0,00) Trong đó, lô tương ứng với nồng độ 150 ppm oligochitosan có giá trị khơng khác biệt so với lơ đối chứng (p = 0,342) Lô tương ứng với nồng độ 50 ppm cho giá trị trung bình khác biệt có ý nghĩa so với lơ đối chứng (p = 0,00) Điều chứng tỏ nồng độ 50 ppm cho hiệu gia tăng kích thước tốt so với lơ lại CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH… Hình Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan đến chiều rộng dâu tây Hình Chiều rộng dâu tây 120 ngày tuổi lô đối chứng (a) lô (b) Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan đến gia tăng chiều rộng kích thước thể hình Kết cho thấy độ rộng kích thước lơ lớn đáng kể so với lơ lại Quan sát sơ cho thấy lô tương ứng với nồng độ 50 ppm cho chiều rộng kích thước lớn so với lơ đối chứng (hình 5) Trong đó, lô tương ứng với nồng độ 150 ppm cho chiều rộng kích thước thấp so với lơ đối chứng Nguyên nhân vấn đề chưa rõ cần nghiên cứu thêm Tuy nhiên, theo nhận định chúng tơi oligochitosan kháng sinh thực vật [9] sử dụng liều cao (150 ppm) gây ngộ độc cho dẫn đến ức chế phát triển dâu tây ĐẶNG XUÂN DỰ - TRẦN THỊ ANH THƯ - LÊ CƠNG NHÂN Bảng Chiều rộng trung bình dâu tây (cm) sau 120 ngày tuổi lơ khác Nhóm (8 cây/nhóm) Lơ đối chứng Lô (50 ppm) Lô (100 ppm) Lô (150 ppm) 7,7 8,4 7,4 7,9 7,4 8,3 7,5 8,0 7,8 8,5 7,2 7,5 7,7 7,9 7,5 7,6 7,6 8,0 7,3 7,8 Trung bình 6,2 ± 0,2 a 6,9 ± 0,3 b 6,4 ± 0,3 a 5,9 ± 0,2 a Kết phân tích ANOVA số liệu bảng cho thấy chiều rộng kích thước lơ khác có ý nghĩa (p = 0,00) Kiểm định LSD (least significant difference) cho thấy chiều rộng lô lơ lại khác có ý nghĩa (p = 0,00) Trong đó, chiều rộng lơ đối chứng so với lô (p = 0,164) lơ (p = 0,064) khơng khác Ngồi ra, chiều rộng lô lô khác (p = 0,003) Điều chứng tỏ nồng độ 50 ppm oligochitosan có khả gia tăng chiều rộng kích thước hiệu so với 100 ppm Từ kết phân tích ảnh hưởng nồng độ oligochitosan đến hiệu gia tăng kích thước dâu tây chúng tơi nhận thấy nồng độ phù hợp, khoảng 50 ppm, oligochitosan có khả gia tăng kích thước dâu tây Ở nồng độ lớn hơn, hiệu gia tăng kích thước giảm Cơ chế kích thích ức chế khả gia tăng kích thước oligochitosan lên dâu tây cần nghiên cứu thêm Tuy nhiên, việc sử dụng oligochitosan phun cho dâu tây theo nên tiến hành liều thấp, với nồng độ nhỏ 100 ppm Kết luận Oligochitosan có KLPT ~ 7,5 kDa chế tạo hiệu phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan 5%, H2O2 1% liều xạ thấp, khoảng 11 kGy Cấu trúc oligochitosan thu khơng khác biệt so với chitosan ban đầu ĐĐA oligochitosan giảm khoảng 4% Oligochitosan KLPT khoảng 7,5 kDa có hiệu ứng gia tăng kích thước dâu tây Nồng độ phù hợp oligochitosan để phun lên dâu tây khoảng 50 ppm TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Xuân Dự, Đinh Quang Khiếu, Diệp Khanh, Nguyễn Quốc Hiến “Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận dung Co – 60 H2O2 cắt mạch chitosan chế tạo oligochitosan”, Tạp chí Hóa Học, 51(2C), 627-631 (2003) Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quang Luân, Trương Thị Hạnh, Phạm Thị Lệ Hà “Nghiên cứu chế tạo oligochitosan kỹ thuật xạ”, Tạp chí Hóa học, 38(2), 22-44 (2000) J Brugnerotto, J Lizardi, F M Goycoolea, W Arguelles – Monal, J Desbrieres, M Rinaudo “An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization”, Polymer, 42, 3569-3580 (2001) CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH… “Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor”, Carbohydrate Polymers, 44, 71-76 (2001) G V Buxton, C L Greenstock, W P Helman, A B Ross “Critical review of rate constants for hydrated electron, hydrogen atoms and hydroxyl radical (OH/O-) in aqueous”, Journal of Physical and Chemical Reference Data, 17(2), 513-886 (1988) S K Kim, N Rajapakse “Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): A review”, Carbohydrate Polymers, 62, 357-368 (2005) N N Duy, D V Phu, N T Anh, N Q Hien “Synergistic degradation to prepare oligochitosan by - irradiation of chitosan solution in the presence of hydrogen peroxide”, Radiation Physical Chemistry, 80, 848-853 (2011) 10 J Kumirstra, M Czerwicka, Z Kaczynski, A Bychowska, K Brozowski, J Thoming, P Stepnowski “Application of spectroscopic methods for structural analysis of chitin and chitosan”, Marine Drugs, 8, 1567-1636 (2010) S Hirano, N Nagao “Effects of chitosan, pectic acid, lysozyme and chitinase on the growth of several phytopathogens” Agricultural and Biological Chemistry, 53, 3065-3066 (1989) 11 J Shao, Y Yang, Q Zhong “Study on preparation of oligoglucosamine by oxidative degradation under microwave”, Polymer Degradation and Stability, 82, 395-398 (2003) Y J Jeon, S K Kim “Effect of antimicrobial activity by chitosan oligosaccharides Nconjugated with asparagines”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 11, 281286 (2001) 12 P Ulanski, C von Sontag “OH – radical induced chain scission of chitosan in the absence and present of dioxygen”, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions, 2, 2022-2028 (2000) Y J Jeon, P J Park, S K Kim Ngày nhận bài: 09/7/2017 Biên tập xong: 15/8/2017 10 Duyệt đăng: 20/8/2017 ... khoảng 50 ppm, oligochitosan có khả gia tăng kích thước dâu tây Ở nồng độ lớn hơn, hiệu gia tăng kích thước giảm Cơ chế kích thích ức chế khả gia tăng kích thước oligochitosan lên dâu tây cần nghiên... đối chứng (p = 0,00) Điều chứng tỏ nồng độ 50 ppm cho hiệu gia tăng kích thước tốt so với lơ lại CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH… Hình Ảnh hưởng nồng độ oligochitosan. .. vậy, chế tạo oligochitosan từ chitosan ban đầu thơng số quan tâm trình phản ứng Các phương pháp chế tạo oligochitosan phổ biến bao gồm: phương pháp hóa học, phương pháp enzym phương pháp chiếu xạ