Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms) bằng kĩ thuật IN vitro

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài có thể được sử dụng nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu.. Tác dụng dược lý của cây Đinh lăng Qua nghiên cứu và thử nghiệm, Viện Y h

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

- -  - -

TRẦN THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY

ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms)

BẰNG KĨ THUẬT IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

- -  - -

TRẦN THỊ THẮM

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY

ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms)

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s La Việt Hồng – Khoa Sinh

KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình

của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân Phong - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ đã

giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi

về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội,10 tháng 04 năm 2014

Sinh viên

TRẦN THỊ THẮM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố

Hà Nội,10 tháng 04 năm 2014

Sinh viên

TRẦN THỊ THẮM

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 4 Ý nghĩa của đề tài 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Mô tả 3

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố 3

1.1.4 Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L) Harms 4

1.1.4.1.Trong lá 4

1.1.4.2 Trong rễ 4

1.1.5 Tác dụng dược lý của cây Đinh lăng 4

1.2 Sơ lược về nhân giống cây in vitro 5

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.2.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 6

1.2.2.1 Ưu điểm 6

1.2.2.2 Nhược điểm 7

1.2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro 8

1.2.3.1 Giai đoạn 1: Khử trùng mô cấy 8

1.2.3.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy 8

1.2.3.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi 8

1.2.3.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh 9

1.2.3.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất 9

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 9

1.2.4.1 Mô nuôi cấy 9

1.2.4.2 Vô trùng trong nuôi cấy 10

1.2.4.3 Điều kiện nuôi cấy 11

1.2.4.4 Môi trường nuôi cấy 13

1.2.4.5 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy 13

1.2.4.6 Ảnh hưởng của pH và Agar 15

1.3 Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng 16

1.3.1 Tạo cây con 16

1.3.2 Tạo phôi soma 16

1.3.3 Tạo sẹo và phát sinh phôi soma 16

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 18

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 18

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 20

2.2.4 Điều kiện nuôi cấy in vitro 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu 21

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 22

2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh Đinh lăng 23

2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng phương pháp tạo

đa chồi (Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi) 24

2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro (Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi đỉnh Đinh lăng) 24

2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và sinh lý của cây Đinh lăng in vitro 25

a Thí nghiệm 4a: Đánh giá một số đặc điểm hình thái, giải phẫu 25

b Thí nghiệm 4b: Đánh giá một số đặc điểm sinh lý 26

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) 28

3.2 Nhân nhanh cây Đinh lăng bằng phương pháp tạo đa chồi (Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi cây Đinh lăng in vitro) 33

3.3 Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 35

3.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và sinh lý của cây Đinh lăng in vitro 37

3.4.1 Thí nghiệm 4a: Đánh giá đặc điểm hình thái, giải phẫu 37

3.4.2 Thí nghiệm 4b: Đánh giá một số đặc điểm sinh lý 39

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 46

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC GIẢ 47

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng 23Bảng 2.2 Công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của BAP đến khả 24

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của NAA đến tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 25

Bảng 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng 29 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Đinh lăng 33 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ ở cây Đinh lăng 36 Bảng 3.4 Hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và tổng số (a+b) 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa (L.) Harms 3

Hình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng 30

Hình 3.2 Đỉnh sinh trưởng cây Đinh lăng (Trái) mẫu in vitro vô trùng sau 5 ngày nuôi cấy, (Phải) mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy 31 Hình 3.3 Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây

Đinh lăng 33 Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Đinh lăng 34 Hình 3.5 Chồi Đinh lăng sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BAP 35

Hình 3.6 Tạo rễ cây Đinh lăng in vitro 37

Hình 3.7 Hình thái chồi ngọn cây Đinh lăng 38 Hình 3.8 (A) Lát cắt ngang chồi đỉnh Đinh lăng tự nhiên, (B) Cắt ngang chồi

đỉnh Đinh lăng in vitro 38

Hình 3.9 (A) Lát cắt ngang cuống lá Đinh lăng tự nhiên; (B)Lát cắt ngang cuống

lá Đinh lăng in vitro 39

Hình a: Thao tác trong box cấy vô trùng 45 Hình b: Kiểm tra mẫu nuôi cấy trong phòng cây tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học & Chuyển giao Công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.45

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA: Napthlacetic acid

IBA: Indol butyric acid 2,4 – D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic aicd BAP: 6-Benzyl amino purin

Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh

và cũng thể hiện các tác dụng dược lý mạnh hơn so với các bộ phận khác (lá, thân) [3], [4], [23]

Đinh lăng thể hiện nhiều ưu điểm như dễ trồng, dễ sử dụng, nhưng việc sử dụng dược liệu hiện nay còn hạn chế do chưa được chú ý trồng trọt, khai thác, bào chế Mặt khác, Đinh lăng có nhiều loại khác nhau như: Đinh lăng lá nhỏ

(Polyscias fruticosa (L.) Harms), Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana), Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei) [1] Sự khác biệt về điều kiện dinh dưỡng

và địa lí có thể làm thay đổi hình thái và chất lượng của Đinh lăng

Để góp phần việc đẩy mạnh việc sử dụng có hiệu quả nguồn dược liệu trong nước, khai thác vốn quý của y học dân tộc, cụ thể là đối với cây Đinh lăng nói riêng và các cây trong họ Nhân sâm nói chung Một hướng nghiên cứu mới

đã và đang được quan tâm đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn giống đồng nhất, năng suất cao, thời gian thu hoạch ngắn hơn so với trồng ngoài tự nhiên

Việc tạo ra cây Đinh lăng ổn định và đồng nhất là vấn đề cần thiết để phục vụ cho nhu cầu trồng trọt và nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm

từ Đinh lăng Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân

giống cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) bằng kĩ thuật in vitro.”

2 Mục đích nghiên cứu

Nhân giống cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harm) bằng phương pháp tạo đa chồi trong điều kiện in vitro

3 Nội dung nghiên cứu

- Quy trình tạo vật liệu in vitro chồi đỉnh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)

- Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trong nhân giống in vitro

- Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng ra rễ của cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trong nhân giống in vitro

- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và sinh lý chồi đỉnh cây

Đinh lăng in vitro

4 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa lí luận: Nhằm góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài có thể được sử dụng nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm từ Đinh lăng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms

1.1.1 Phân loại

Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan)

Lớp: Magnolyopsida (Ngọc lan)

Bộ: Araliales (Nhân sâm)

Họ: Araliaceae (Nhân sâm hay Ngũ gia bì)

Loài: Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng, cây gỏi cá, Nam dương

lâm, ) [1]

1.1.2 Mô tả

Cây Đinh lăng - Polyscias

fruticosa (L.) Harms là cây bụi cao

0,5 – 2 m Thân tròn sần sùi, không có

gai Rễ phù như củ Lá kép mọc cách,

có bẹ, phiến lá xẻ lông chim 2 – 3 lần,

dài 20 – 40 cm Lá chét có cuống gầy

dài 3 -10 mm, phiến lá chét có răng

cưa không đều, chóp nhọn các đoạn

đều có cuống, lá có mùi thơm Cuống

lá dài, tròn, màu xanh sậm, đáy cuống

phình to thành bẹ lá Cụm hoa hình

thùy ngắn 7 - 18 mm ở ngọn, gồm

nhiều tán mang nhiều hoa nhỏ, màu

trắng xám Tràng 5, nhị 5, bầu hạ 2 ngăn có dìa trắng nhạt Quả hình trứng, dẹt, dài 3 -4 mm, màu trắng bạc [1]

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố

Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ các đảo Thái Bình Dương Cây phân bố ở Malayxia, Indonexia, Lào, miền Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, hiện có hơn

Hình 1.1: Cây Đinh lăng –

Polyscias fruticosa (L.) Harms [25]

10 loài Đinh lăng [1], được trồng làm cảnh ở khắp nơi hoặc trồng làm thuốc ở quy mô nhỏ theo từng hộ gia đình, loài Đinh lăng được sử dụng làm thuốc phổ

biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms Đây là loài có nhiều tác dụng dược

lý giống Nhân sâm [2]

1.1.4 Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L) Harms

Cây Đinh lăng chứa alkaloid, glycosid và các vitamin tan trong nước như:

B1, B2, B6 và các phytosterin Vỏ và lá Đinh lăng chứa saponin [3]

1.1.4.1.Trong lá

Lá Đinh lăng chứa sapoin triterpen chiếm 1,65%, sapoin triterpen trong lá

là một genin dạng acid olenolic, đây là một hợp chất thứ cấp có tác dụng dược liệu

Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được 5 hợp chất polyacetylen từ lá Đinh lăng là: Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca – 1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3,10 diol, Heptadeca – 1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3ol- 10on

và Heptadeca – 1,8 (Z)- dien-4,6 diyn- 3ol- 10on [3]

1.1.4.2 Trong rễ

Trong rễ Đinh lăng có glycosid, alkaloid, vitamin (B1, B2, B6, C), các phytosterin và 20 acid amin, trong đó có các acid amin không thể thay thế (lysin, methionin, trytophan, cystein) [4] Và trong rễ Đinh lăng mới chỉ thấy 5 hợp chất polyacetylen trong đó có Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca – 1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3,10 diol là 3 hợp chất giống trong lá Các hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư [3]

1.1.5 Tác dụng dược lý của cây Đinh lăng

Qua nghiên cứu và thử nghiệm, Viện Y học quân sự đã tìm được từ cây Đinh lăng những tính chất của Nhân sâm: Rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng cường sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể, chống hiện tượng mệt mỏi, giúp

ăn ngủ ngon, tăng khả năng lao động, lên cân và chống độc.Ngoài ra, theo Y học cổ truyền, Hải Thượng Lãn Ông đã dùng rễ Đinh lăng sao vàng, sắc cho

phụ nữ uống sau khi đẻ để chống bệnh đau dạ con và làm tăng tiết sữa Đinh lăng còn được dùng chữa ban sởi, ho ra máu, kiết lỵ Phối hợp với sữa ong chúa

là thuốc bổ rất tốt [23]

1.2 Sơ lược về nhân giống cây in vitro

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học

thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào Theo Haberlandt G (1902), nhà thực vật học người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [5] Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [20]

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Trong đó:

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau

Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào ngược lại với sự phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,

ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới, còn một số gen khác lại

bị ức chế hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa

trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trưởng của cơ thể thực vật luôn được hài hòa

Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) Đây là một điểm rất quan trọng vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kĩ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng [6], [7]

1.2.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

1.2.2.1 Ưu điểm

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở

ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là những ưu điểm chính:

- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và đạt năng suất cao

- Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc

- Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao

- Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội)

- Bảo quản và lưu trữ tập đoàn gen

- Có khả năng sản xuất quanh năm

- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém

- Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà [8]

Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp

không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt Thí dụ: Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối với cây khoai tây bằng phương pháp này [9] Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải mất

10 – 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống

mới rất khó khăn [5] Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể

cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm [21]

1.2.2.2 Nhược điểm

Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết

bị đắt tiền và kĩ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác [22] Ngoài ra, phương pháp này còn có những nhược điểm sau:

- Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây non có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm

- Cây có thể có những đặc tính không mong muốn

- Khả năng tạo đột biến tăng

- Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus, hay huyền phù tế bào nhiều lần

- Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt

Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi

- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây lâm nghiệp

và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ

- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus

- Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen

1.2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Sự thành công của việc nhân giống in vitro đạt được khi trải qua các giai

đoạn sau [7]:

1.2.3.1 Giai đoạn 1: Khử trùng mô cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình

nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu thực

vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả

1.2.3.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy

Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồi

hoặc chồi nách của cây mẹ Ngoài ra, tùy từng đối tượng mà người ta còn có thể dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa, Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ các hợp chất auxin, cytokinin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh lý của mẫu cấy Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy của cây được lấy vào thời

kỳ sinh trưởng mạnh cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

1.2.3.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích tạo

ra hệ số nhân cao nhất Chính vì vậy, giai đoạn này được xem là giai đoạn then chốt của quá trình

Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, Gibberelin), các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết giấm men, dịch thủy phân

Casein kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

1.2.3.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường sau từ 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các Auxin, các chất IAA, IBA, α-NAA và 2,4-D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất

1.2.3.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Ở giai đoạn này, đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra

đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định

khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất

Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ, để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc Để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ

10 - 15 ngày, lúc này rễ mới sinh ra, lá non bắt đầu hình thành Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường [7]

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

1.2.4.1 Mô nuôi cấy

Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non…, khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hormon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau

Do đó kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuôi cấy Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò

quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu được những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển

ở một giai đoạn nhất định [12] Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh

1.2.4.2 Vô trùng trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:

- Vô trùng mô cấy

- Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy

- Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy

Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy [13]

Street (1974), đưa ra khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như sau [13]:

1.2.4.3 Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ:

Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro

qua các tiến trình sinh lý như hô hấp, hình thành tế bào và cơ quan, nhiệt độ thích hợp nhất thường được dùng trong nuôi cấy mô tế bào là từ 20 – 27oC [13]

Có nhiều đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ cao, bởi vì nhiệt độ cao có thể làm cho chức năng kích thích tạo chồi của Cytokinin giảm Hầu hết, những thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật được thực hiện trong phòng thí nghiệm khống chế nhiệt độ Những người trồng cây công nghiệp cũng sử dụng nhiệt độ để duy trì khả năng sinh trưởng khi yêu cầu nhiệt cho cây non còn thấp Nuôi cấy ở ngăn lạnh làm giảm sinh trưởng và làm giảm giá thành cần thiết do cấy truyền

Ánh sáng:

Ảnh hưởng của ánh sáng có thể được chia ra trong sự tác động của cường

độ ánh sáng (bức xạ hoạt động quang hợp), thời gian chiếu sáng (quang chu kỳ)

và chất lượng ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển của thực vật Cường độ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy

in vitro ở những cây có diệp lục tố, mức cường độ ánh sáng điển hình cho vi

nhân giống là từ 40 – 80 μmol/m2/giây trong nuôi cấy vươn thân, nhưng cường

độ ánh sáng bên trong các bình nuôi cấy có thể thấp hơn nhiều

Kiểu nút đậy kín có thể làm giảm sự truyền ánh sáng vào trong bình cấy, các loài cây khác nhau thì yêu cầu mức độ ánh sáng khác nhau, biên độ ánh sáng này rất thấp so với bức xạ bên ngoài và trong nhà kính (600 – 1200 μmol/m2

/giây)

Chất lượng ánh sáng là chức năng của đèn chiếu sáng trong nuôi cấy và kiểu bình cấy được sử dụng Thông thường trong các phòng nuôi cấy mô sử dụng đèn ánh sáng trắng hoặc ánh sáng trắng pha đỏ Chất lượng ánh sáng cũng

làm thay đổi phản ứng sinh trưởng của chồi in vitro Người ta cho rằng chất

lượng ánh sáng là quan trọng trong giai đoạn thuần hóa cây non và có thể bị kích thích bởi xử lý ánh sáng xanh trước khi di chuyển cây từ nuôi cấy Chất lượng ánh sáng cũng có thể tác động gián tiếp lên sự phát triển chồi, là nguyên nhân làm các yếu tố môi trường phát triển trong nuôi cấy thay đổi (Hartmann và ctv, 1997)

Không khí:

Các chất khí có tác động lên sự phát triển chồi trong nuôi cấy in vitro bao

gồm oxy, carbon dioxide và ethylene Các nhà trồng cây thương mại không nỗ lực làm thay đổi mức không khí trong nuôi cấy, tuy nhiên tất cả sự đóng kín và nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí được ở một vài mức độ khác nhau, thường có sự thúc đẩy tăng trưởng thông qua lỗ thông khí bị đóng kín hoặc cung cấp qua màng lọc trao đổi khí (Hartmann và ctv, 1997)

1.2.4.4 Môi trường nuôi cấy

Trong tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần chính sau đây:

- Các muối khoáng đa luợng

- Các muối khoáng vi lượng

- Các Vitamin

- Đường làm nguồn cacbon

- Các chất điều hòa sinh trưởng

Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định như acid amin, EDTA, hoặc không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men…vào trong môi trường tùy theo nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi cấy Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, có thể phân loại ra 3 môi trường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: White, Knop

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: B5, Gamborg

- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: MS (Murashige – Skoog)

1.2.4.5 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác Chất điều hoà sinh trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hoá sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện

của môi trường [15]

Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu Sự kéo dài của tế bào

rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi Hiệu ứng auxin giảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ưu và trở nên độc ở các nồng độ quá cao

Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo giai đoạn phát triển của chúng Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm

Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tương tự như các đặc tính của chất auxin, nhưng thường với các liều lượng thấp hơn, hơn nữa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme và có thể có một tác động kéo dài trong đó có NAA Trong

lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí quan trọng, hai

tính chất được nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế bào và sự hình thành rễ [13]

Cytokinin:

Các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhưng lại ức chế sự tạo rễ [11]

Sự sinh trưởng tổng hợp Cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ) Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ

Tuy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất Vì vậy khi rễ bị tổn thương thì thấy nụ phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin Nó hoạt hoá sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện trong sự phối hợp với auxin [13] Trong nuôi cấy mô, cytokinin thể hiện các tính chất cho phép chúng ta giải quyết những khó khăn trong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng

tế bào trong con đường phân hoá [13]

Gibberellin:

Hiệu ứng chính của các gibberellin là kéo dài thân, kích thích sự kéo dài lóng Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu bì Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin Gibberellin liều cao (hay phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá [15]

Ảnh hưởng của than hoạt tính:

Nồng độ sử dụng thường là từ 0,2 – 3% Than hoạt tính có những tác dụng sau:

- Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố không màu khác

- Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin, chelate Fe và Zn…)

- Thúc đẩy sự tạo phôi soma

- Ổn định độ pH

1.2.4.6 Ảnh hưởng của pH và Agar

pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi cấy mô Nếu pH môi trường thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô [10], [14]

Agar xuất phát từ rong biển, được sử dụng như là chất keo trong hầu hết môi trường dinh dưỡng Agar là polysaccharide, trọng lượng phân tử cao có khả năng làm đông môi trường Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nước

và hấp thụ hoá chất Nồng độ agar thường sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8 %

1.3 Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng

1.3.1 Tạo cây con

Mô phân sinh của Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms được cảm

ứng để phát triển thành cây con trong môi trường MS dinh dưỡng khoáng và bổ sung 2mg/l BAP Trong môi trường này trung bình tạo 4,1 ± 0,25 chồi trong 60 ngày Tất cả chồi phát triển từ chồi nách mà không tạo sẹo [17]

Quy trình nhân giống cây Đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp nuôi cấy

mô – tế bào: Vật liệu sử dụng ban đầu là chồi đã qua quá trình khử trùng, sau 2 tuần cho tỷ lệ mẫu sạch tái sinh cao nhất là 73,33% Các mẫu sạch được tái sinh tốt nhất và nhanh nhất trên môi trường MS có bổ sung BAP 2 mg/l và IBA 0,5 mg/l Trong môi trường tạo đa chồi (tăng các chất khoáng đa lượng trong môi trường MS lên 1,5 lần và bổ sung 2 mg/l BAP), 100% mẫu cấy tạo đa chồi và số chồi trung bình đạt 7,13 chồi/mẫu, chất lượng chồi tốt sau 6 tuần nuôi cấy [24]

1.3.2 Tạo phôi soma

Cây Đinh lăng tái sinh được hình thành qua con đường tạo phôi soma Mẫu sử dụng để nuôi cấy là chồi đỉnh hay chồi bên còn non của cây Đinh lăng Môi trường sử dụng là MS cơ bản và có bổ sung Vitamin Morel, nước dừa 10%,

30 g/l saccaroso và các hoocmon sinh trưởng Điều kiện nuôi cấy mô ở nhiệt độ

26oC, cường độ chiếu sáng 2000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày [2]

1.3.3 Tạo sẹo và phát sinh phôi soma

Môi trường MS bổ sung 2,4-D 2mg/l là thích hợp cho sự cảm ứng tạo mô sẹo ở mẫu cấy lá và thân cây Đinh lăng Nếu chuyển loại mô sẹo này sang môi trường không có auxin ngoại sinh sẽ tạo phôi soma sau 8 tuần Mô sẹo có rễ và cây con từ phôi soma được xác định có sự hiện diện sapoin thông qua phương pháp sắc ký lớp mỏng và đánh giá khả năng tạo bọt [17]

Mô sẹo 14 tuần tuổi của cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms

nuôi trên môi trường MS có bổ sung 2,4 –D 2mg/l và 20% nước dừa là vật liệu tốt nhất để sử dụng làm vật liệu tạo dịch treo tế bào Môi trường lỏng MS có bổ sung 2,4 – D 1mg/l và 20% nước dừa là môi trường thu nhận các dòng tế bào

cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms có khả năng sinh phôi Đó là các

tế bào vách mỏng, đẳng kính, nhân to, tế bào chất đậm đặc Môi trường lỏng MS

có bổ sung 2,4 – D 1mg/l, BA 2 mg/l và 20% nước dừa là môi trường mà các

dòng tế bào có khả năng sinh phôi của cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.)

Harms tạo được rễ Từ số lượng lớn rễ này có thể thu nhận sapoin bằng các phương pháp li trích [20]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 7/2013 đến tháng 4/2014 tại Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, phòng thí nghiệm Thực vật Trường Đại học Sư phạm

Hà Nội 2

2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) được thu ngoài tự

nhiên tại khu vực phường Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc Cây được trồng, chăm sóc trong chậu, khi cây có chồi non khoảng 3-4 cm thì tiến hành thu mẫu cho nghiên cứu về nuôi cấy mô tại Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học & Chuyển giao Công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ