Nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái mô sẹo của cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms)

... phần nâng cao hiệu nghiên cứu khai thác, bào chế sản phẩm từ Đinh lăng Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu hình thái đƣợc phát sinh từ mô sẹo Đinh lăng( Polyscias fruticosa (L. )Harms) đƣợc nuôi cấy in... ngắn so với trồng tự nhiên Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu trình phát sinh hình thái mô sẹo Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L. ) Harms) cần thiết để ứng dụng vào phục vụ cho nhu... 42 Hình 3.2 (d) giai đoạn phôi trƣởng thành 44 Hình 3.2 Sự phát sinh hình thái từ mô sẹo Đinh lăng sau tuần công thức: (e) CT T1, (f) CT T2, (g) CT T3, (h) CT T4 45 Hình 3.2 (i) hình thái

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN - -  - - HOÀNG THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁTSINH HÌNH THÁI MÔ SẸO CỦACÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TH.S LA VIỆT HỒNG HÀ NỘI, 2015 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân Phong - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phƣơng tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua trình học tập và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm Sinh viên HOÀNG THỊ HUYỀN 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố dƣới sự hƣớng dẫn củaTh.s La Việt Hồng. Hà Nội, ngày tháng năm Sinh viên HOÀNG THỊ HUYỀN 3 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Cây Đinh lăng –Polyscias fruticosa (L.) Harms [18] ........... 3 Hình 3.1.1. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 2 tuần .................................................................................................. 32 Hình 3.1.2. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 4 tuần .................................................................................................. 34 Hình 3.1.3. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 8 tuần .................................................................................................. 36 Hình 3.1.4. (a) Mô sẹo Đinh lăng ở các công thức sau 14 tuần ở các công thức ......................................................................................... 37 Hình 3.1.4. (b) Hiệu quả các môi trƣờng tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng ................................................................................... 38 Hình 3.2. (a) giai đoạn phôi hình cầu ............................................... 40 Hình 3.2. (b) giai đoạn phôi hình tim ............................................... 41 Hình 3.2. (c) giai đoạn phôi “cá đuối” .............................................. 42 Hình 3.2. (d) giai đoạn phôi trƣởng thành ........................................ 44 Hình 3.2. Sự phát sinh hình thái từ mô sẹo lá cây Đinh lăng sau 7 tuần ở các công thức: (e) CT T1, (f) CT T2, (g) CT T3, (h) CT T4 .......... 45 Hình 3.2. (i) hình thái chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo ở công thức CT4 sau 14 tuần ............................................................................... 46 Hình 3.3. (a) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA 0,3 mg/l ............................................................................................ 48 Hình 3.3. (b) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA 0,5 mg/l ............................................................................................ 48 4 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của 2,4 - D và Kinetin đến khả năng tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng ...................................................................................................... 27 Bảng 2.2. Công thức xác định ảnh hƣởng của BAP, Kinetin đến quá trình phát sinh hình thái mô sẹo cây Đinh lăng.............................. 28 Bảng 2.3. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng ......................................................................... 29 5 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: Napthlacetic acid CT: Công thức IBA: Indol butyric acid 2,4 – D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid GA3: Gibbrellin BAP: 6-Benzyl amino purin MS: Murashige và Skoog Nxb: Nhà xuất bản Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh 6 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1 2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2 4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2 NỘI DUNG .................................................................................................... 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3 1.1. Giới thiệu về cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms .................. 3 1.1.1. Vị trí ..................................................................................................... 3 1.1.2. Mô tả .................................................................................................... 3 1.1.3. Nguồn gốc, phân bố.............................................................................. 4 1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms 4 1.1.4.1. Trong lá ............................................................................................. 4 1.1.4.2. Trong rễ ............................................................................................. 4 1.1.5. Tác dụng dƣợc lý của cây Đinh lăng..................................................... 5 1.2. Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ............ 5 1.2.1. Cơ sở khoa học ..................................................................................... 5 1.2.2. Mục đích .............................................................................................. 7 1.2.3. Ƣu, nhƣợc điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ................................................................................................................. 7 1.2.3.1. Ƣu điểm............................................................................................. 7 7 1.2.3.2. Nhƣợc điểm ....................................................................................... 8 1.2.4. Điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro ............................................... 8 1.2.4.1. Vô trùng ............................................................................................ 8 1.2.4.2. Phòng nuôi cấy mô ............................................................................ 9 1.2.4.3. Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng................................................... 9 1.2.5. Các giai đoạn nhân giống in vitro ....................................................... 15 1.2.5.1. Giai đoạn 1 ...................................................................................... 15 1.2.5.2. Giai đoạn 2 ...................................................................................... 16 1.2.5.3. Giai đoạn 3 ...................................................................................... 16 1.2.5.4. Giai đoạn 4 ...................................................................................... 17 1.2.5.5. Giai đoạn 5 ...................................................................................... 17 1.2.6. Các giai đoạn phát sinh phôi soma ...................................................... 18 1.2.7. Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng ........................................... 20 1.2.7.1. Tạo cây con ..................................................................................... 20 1.2.7.2. Tạo phôi soma ................................................................................. 21 1.2.7.3. Tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma ................................................. 21 1.2.7.4. Nhân nhanh chóng phôi soma thứ cấp của cây Đinh lăng ................ 22 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................... 24 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................... 24 2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................... 24 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 24 2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ .................................................................... 24 2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy ........................................................................... 25 8 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ................................................................. 26 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 26 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................ 27 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 27 2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng ............ 27 2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo ở cây Đinh lăng từ lá non và thân cây..................................................................................... 28 2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng) ................................. 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 30 3.1. Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) ......................................................................................................... 30 3.1.1. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 2 tuần ở các công thức ............................................................................................ 30 3.1.2. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 4 tuần ở các công thức ............................................................................................ 32 3.1.3. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 8 tuần ở các công thức ............................................................................................ 35 3.1.4. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 14 tuần ở các công thức. .................................................................................... 37 3.2. Quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹo ở cây Đinh lăng từ lá non và thân cây................................................................................................................ 39 3.3. Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng) ................................................................ 47 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 49 9 4.1. Kết luận ................................................................................................. 49 4.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 50 10 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật đã có nhiều nghiên cứu về cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.)Harms thuộc họ Nhân sâm hay Ngũ gia bì (Araliaceae) [4], các kết quả nghiên cứu cho thấy cây Đinh lăng có nhiều tác dụng dƣợc lí giống Nhân sâm, và Tam thất nhƣ chứa saponin đƣợc coi là một trong những thành phần hóa học có tác dụng chính của dƣợc liệu, đồng thời ở cây Đinh lăng, rễ là nơi có hàm lƣợng saponin cao nhất và cũng thể hiện các tác dụng dƣợc lý mạnh hơn so với các bộ phận khác (lá, thân) [8], [1], [19]. Ngoài ra trong Đinh lăng chứa alkaloid, acid amin, vitamin,... đặc biệt dƣợc liệu từ cây Đinh lăng có tác dụng tăng cƣờng thể lực, tăng sức đề kháng và tăng khả năng thích nghi [3]. Đinh lăng có nhiều loại khác nhau nhƣ: Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms), Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana), Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei)... [4]. Mặc dù dễ trồng, dễ sử dụng nhƣng sự khác biệt về điều kiện dinh dƣỡng và địa lí có thể làm thay đổi hình thái và chất lƣợng của Đinh lăng mặt khác việc sử dụng dƣợc liệu hiện nay còn hạn chế do chƣa đƣợc chú ý trồng trọt, khai thác, bào chế.Để góp phần việc đẩy mạnh việc sử dụng có hiệu quả nguồn dƣợc liệu trong nƣớc, khai thác vốn quý của y học dân tộc, cụ thể là đối với cây Đinh lăng nói riêng và các cây trong họ Nhân sâm nói chung. Một hƣớng nghiên cứu mới đã và đang đƣợc quan tâm đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn giống đồng nhất, năng suất cao, thời gian thu hoạch ngắn hơn so với trồng ngoài tự nhiên. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái mô sẹo của cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)” là cần thiết để ứng dụng vào phục vụ cho nhu cầu trồng trọt, sản 1 xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm từ Đinh lăng. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu hình thái đƣợc phát sinh từ mô sẹo của cây Đinh lăng(Polyscias fruticosa (L.)Harms) đƣợc nuôi cấy in vitro. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng. - Quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹo cây Đinh lăng. - Ảnh hƣởng của α – NAA đến khả năng ra rễ tạo cây Đinh lăng in vitro hoàn chỉnh. 4. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa lí luận: Nhằm góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.)Harms). - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài có thể đƣợc sử dụng để ứng dụng vào sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt, góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm từ Đinh lăng. 2 NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms 1.1.1. Vị trí Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan) Lớp: Magnolyopsida (Ngọc lan) Bộ: Araliales(Nhân sâm) Họ: Araliaceae (Nhân sâm hay Ngũ gia bì) Loài: Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng, cây gỏi cá, Nam dƣơng lâm,...) [4]. 1.1.2. Mô tả Cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms là cây bụi cao 0,5 – 2 m. Thân tròn sần sùi, không có gai. Rễ phù nhƣ củ. Lá kép mọc cách, có bẹ, phiến lá xẻ lông chim 2 – 3 lần, dài 20 – 40 cm. Lá chét có cuống gầy dài 3 -10 mm, phiến lá chét có răng cƣa không đều, chóp nhọn các đoạn đều có cuống, lá có mùi thơm. Cuống lá dài, tròn, màu xanh sậm, đáy cuống phình to thành bẹ lá. Cụm hoa hình thùy ngắn 7 - Hình 1.1.Cây Đinh lăng – 18 mm ở ngọn, gồm nhiều tán mang Polyscias fruticosa (L.) Harms [18] nhiều hoa nhỏ, màu trắng xám. Tràng 5, nhị 5, bầu hạ 2 ngăn có dìa trắng nhạt. Quả hình trứng, dẹt, dài 3 -4 mm, màu trắng bạc [4]. 3 1.1.3. Nguồn gốc, phân bố Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ các đảo Thái Bình Dƣơng. Cây phân bố ở Malayxia, Indonexia, Lào, miền Nam Trung Quốc,... Ở Việt Nam, hiện có hơn 10 loài Đinh lăng [4], đƣợc trồng làm cảnh ở khắp nơi hoặc trồng làm thuốc ở quy mô nhỏ theo từng hộ gia đình, loài Đinh lăng đƣợc sử dụng làm thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms. Đây là loài có nhiều tác dụng dƣợc lý giống Nhân sâm [8]. 1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa(L). Harms) Cây Đinh lăng chứa alkaloid, glycosid và các vitamin tan trong nƣớc nhƣ: B1, B2, B6 và các phytosterin. Vỏ và lá Đinh lăng chứa saponin [1]. 1.1.4.1. Trong lá Lá Đinh lăng chứa sapoin triterpen chiếm 1,65%, sapoin triterpen trong lá là một genin dạng acid olenolic, đây là một hợp chất thứ cấp có tác dụng dƣợc liệu. Trung tâm Sâm và Dƣợc liệu thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập đƣợc 5 hợp chất polyacetylen từ lá Đinh lăng là: Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca – 1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3,10 diol, Heptadeca – 1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3ol10on và Heptadeca – 1,8 (Z)- dien-4,6 diyn- 3ol- 10on [1]. 1.1.4.2. Trong rễ Trong rễ Đinh lăng có glycosid, alkaloid, vitamin (B 1, B2, B6, C), các phytosterin và 20 acid amin, trong đó có các acid amin không thể thay thế (lysin, methionin, trytophan, cystein) [3]. Và trong rễ Đinh lăng mới chỉ thấy 5 hợp chất polyacetylen trong đó có Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca – 1,8 (E)- dien-4,6 diyn- 3,10 diol là 3 hợp chất giống trong lá. Các hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thƣ [1]. 4 1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Đinh lăng Qua nghiên cứu và thử nghiệm, Viện Y học quân sự đã tìm đƣợc từ cây Đinh lăng những tính chất của Nhân sâm: Rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng cƣờng sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể, chống hiện tƣợng mệt mỏi, giúp ăn ngủ ngon, tăng khả năng lao động, lên cân và chống độc. Ngoài ra, theo Y học cổ truyền, Hải Thƣợng Lãn Ông đã dùng rễ Đinh lăng sao vàng, sắc cho phụ nữ uống sau khi đẻ để chống bệnh đau dạ con và làm tăng tiết sữa. Đinh lăng còn đƣợc dùng chữa ban sởi, ho ra máu, kiết lỵ. Phối hợp với sữa ong chúa là thuốc bổ rất tốt [19]. 1.2. Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1. Cơ sở khoa học Haberlandt G. (1902) là ngƣời đầu tiên đề xƣớng ra phƣơng pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn thế của tế bào. Theo ông mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh[13]. Nhƣ vậy mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro)đƣợc thực hiện dựa trên tính toàn năng của tế bào, đƣợc thể hiện khi nuôi cấy mô và các tế bào cách li trong môi trƣờng thích hợp thì có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc trƣng cho loài và ra hoa tạo quả bình thƣờng, do trong nhân tế bào có chứa bộ AND(NST) hoàn chỉnh chứa toàn bộ thông tin di truyền cho một chu kì sống hoàn chỉnh. ADN→ARN→Protein→Tính trạng Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào in vitro là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó: 5 Tính phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhận các chức năng khác nhau (mô giậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết,…) nhƣng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn phân hóa để hình thành các mô riêng biệt. Tính phản phân hóa của tế bào: các tế bào khi đã đƣợc phân hóa thành các mô có chức năng riêng biệt, nhƣng trong những điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay lại trạng thái phôi sinh và phân chia tế bào mạnh mẽ. Trên thực tế đã chứng minh khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã đƣợc nhân giống trên quy mô thƣơng mại bằng cách nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [15]. Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dƣỡng của cây nhƣ thân, rễ, lá,… thì giai đoạn tạo mô sẹo (callus) chính là những tế bào đã quay trở lại trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của cơ quan dinh dƣỡng. Tùy vào từng tế bào, từng mô, từng thời kỳ sinh trƣởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động, các gen không cùng hoạt động nhƣ nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (do cơ chế điều hòa hoạt động của gen). Về bản chất sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa gen. Do thông tin về vị trí của tế bào, tƣơng quan dinh dƣỡng và tƣơng quan hormon quy định. Trong đó quan trọng nhất là thông tin về vị trí của tế bào, khi nằm trong một cơ thể các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, khi đƣợc tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các gen đƣợc hoạt hóa dễ dàng hơn, chúng có khả năng “mở” các gen để hình thành một các thể mới. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc phân tử AND 6 của mỗi tế bào, khiến quá trình sinh trƣởng của cơ thể thực vật luôn đƣợc hài hòa. Đó là cơ sở nền tảng cho việc nuôi cấy mô, tế bào. 1.2.2. Mục đích - Nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn giống. - Nhân nhanh kết hợp làm sạch virus. - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại cây trồng khác nhau. - Bảo quản các tập đoàn gen, đặc biệt với các loài cây dễ bị nhiễm bệnh trong điều kiện tự nhiên. 1.2.3. Ưu, nhược điểm của nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 1.2.3.1. Ưu điểm Theo E.F.Gerge (1993) cho biết ƣu điểm của nhân giống in vitro - Phƣơng pháp nhân giống in vitrocó khả năng hình thành một số lƣợng lớn cây giống từ một mô, cơ quan với kích thƣớc nhỏ 0,1-10 mm. - Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đƣợc hoàn toàn sạch bệnh. - Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh các giống sạch bệnh. - Hoàn toàn có khả năng điều chỉnh các tác nhân điều chỉnh khả năng tái sinh của cây nhƣ thành phần ding dƣỡng, nhiệt độ, các chất điều tiết sinh trƣởng,… theo ý muốn. - Hệ số nhân giống cao, có khả năng sản xuất số lƣợng lớn cây giống trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống trong khoảng 36 đến 1012 cây giống/năm. - Có thể tiến hành quanh năm không chịu sự chi phối của các nhân tố môi trƣờng. 7 - Cây giống in vitro nếu chua có nhu cầu sử dụng có thể bảo quản trong một thời gian dài trong điều kiện in vitro. 1.2.3.2. Nhược điểm - Mặc dù có hệ số nhân giống cao nhƣng cây giống có kích thƣớc nhỏ khó trồng trong điều kiện tự nhiên, đôi khi xuất hiện các cây không mong muốn (do biến dị, mọng nƣớc). - Do cây giống đƣợc cung cấp nguồn hydratcacbon nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ kém. Cây giống in vitro đƣợc nuôi trong các bình thủy tinh hoặc bình nhựa có độ ẩm tƣơng đối bão hòa. Do đó, khi trồng ngoài điều kiện tự nhiên thƣờng bị mất cân bằng nƣớc, gây hiện tƣợng bị héo cây và chết. Vì vậy, trƣớc khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện tự nhiên, cần trải qua giai đoạn “huấn luyện” để quen dần với điều kiện tự nhiên. - Cần thiết bị hiện đại, kĩ thuật viên có trình độ cao. 1.2.4. Điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro 1.2.4.1. Vô trùng Sự thành công hay thất bại của công việc nuôi cấy mô đều phụ thuộc vào việc vô trùng. Vì vậy, trong nuôi cấy in vitro tất cả các khâu đều phải đƣợc thanh trùng: dụng cụ nuôi cây, mẫu vật nuôi cấy, môi trƣờng nuôi cấy và các thao tác nuôi cấy. Nếu khâu nào đó trong kĩ thuật nuôi cấy không đƣợc thanh trùng thì mẫu nuôi cấy bị nhiễm vi sinh vật hoặc nấm và sẽ chết. Khử trùng đƣợc thực hiện bằng các phƣơng tiện sau: - Nồi hấp: khử trùng bằng hơi nƣớc có nhiệt độ và áp suất cao, thƣờng áp dụng tiệt trùng cho môi trƣờng nuôi cấy, dụng cụ thí nghiệm, với áp suất 1 atm tƣơng đƣơng 121 0 C trong khoảng thời gian từ 20 đến 30 phút đảm bảo khử trùng tốt. - Tủ sấy: Khử trùng bằng nhiệt độ cao nên chỉ ấp dụng cho các dụng cụ bằng thủy tinh và kim loại. 8 - Phễu lọc vô trùng: Khử trùng bằng phễu lọc có màng lọc kích thƣớc 0,2 μm, chỉ áp dụng cho các chất dễ phân hủy trong điều kiện nhiệt độ và ,áp suất cao nhƣ vitamin B2, bibberelin,… - Hóa chất khử trùng: Áp dụng để vô trùng bề mặt cấy hoặc dụng cụ, hóa chất thƣờng nhƣ Ca-hypocloride, clorua thủy ngân, nƣớc brom, oxy già, cồn. 1.2.4.2. Phòng nuôi cấy mô Các thiết bị quan trọng nhất của phòng nuôi cấy mô gồm nồi hấp vô trùng, dụng cụ nuôi cấy, máy cấy vô trùng, phòng nuôi cấy đủ ánh sáng nhân tạo, điều hòa nhiệt độ, tủ sấy, tủ ấm, máy đo pH, các loại cân phân tích,… Trƣớc khi cấy, thí nghiệm viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao cần có một đèn tử ngoại treo trên trần. Phòng cấy lớn đƣợc khử trùng tiện nhất là bằng đèn cực tím.Thời gian khử trùng tùy theo kích thƣớc của phòng và đèn cực tím chỉ đƣợc sử dụng khi không có ngƣời. Phòng cũng có thể đƣợc khử trùng bằng cách lau rửa hai lần/tháng với các dung dịch chống nấm. Phòng nhỏ hơn và tủ cấy cũng đƣợc khử trùng bằng tia cực tím hay các dung dịch khử trùng. Tủ cấy thổi gió đƣợc khử trùng bằng cách mở quạt gió và lau tất cả các bề mặt bằng cồn 95% trong 15 phút trƣớc khi bắt đầu làm việc. Phòng nuôi cũng đƣợc khử trùng trƣớc hết là bằng xà bông bột. Sau đó lau bằng dung dịch hypoclorit sodium 2% hoặc bằng cồn 95%. Tất cả sàn, trần đều đƣợc lau nhƣ vậy mỗi tuần. Cẩn thận không nên khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử.Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại ra vào buồng cấy nhiều lần. 1.2.4.3. Thành phần môi trường dinh dưỡng Đến nay có hàng trăm môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đã đƣợc xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy đều bao gồm các nhóm chất sau: 9 - Các loại muối khoáng. - Nguồn cacbon hữu cơ. - Vitamin. - Chất điều hòa sinh trƣởng. - Nhóm chất tự nhiên. - Chất làm đông môi trƣờng. Các nhà khoa học sử dụng các môi trƣờng nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trƣng phụ thuộc vào một số yếu tố: - Đối tƣợng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trƣờng. - Mục đích nghiên cứu hoặc phƣơng thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống,…). - Trạng thái môi trƣờng khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).  Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng đa lƣợng: Gồm các nguyên tố khoáng đƣợc sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, tức là trên 30 mg/l. Những nguyên tố đó là: N, S, P, K, Mg, Ca. Riêng Na và Cl cũng đƣợc sử dụng trong một vài loại môi trƣờng, nhƣng chƣa rõ vai trò của chúng. - Các nguyên tố khoáng vi lƣợng: Là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm. Đó là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co.  Nguồn cacbon hữu cơ Phƣơng thức sống chủ yếu của mô và các tế bào thực vật trong môi trƣờng nuôi cấy là dị dƣỡng, cũng có thể sống theo phƣơng thức bán dị dƣỡng dựa vào khả năng quang hợp trong điều kiện ánh sáng nhân tạo. Vì vậy, trong môi trƣờng nuôi cấy cần sử dụng nguồn cacbon hữu cơ thƣờng 10 dùng là saccarozo với liều lƣợng 2-3%, nhƣng cũng tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi, có khi xuống tới 0,2% và tăng lên đến 12%. Trong một số trƣờng hợp nhƣ nuôi cấy hạt phấn, nuôi cấy tế bào trần,… có thể sử dụng đƣờng glucozo, maltozo, galactozo,…  Vitamin Mặc dù tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp các loại vitamin cần thiết, nhƣng thƣờng không đủ lƣợng. Do đó, phải bổ sung từ môi trƣờng ngoài, đặc biệt là vitamin thuộc nhóm B với nồng độ 1 ppm.  Nhóm chất tự nhiên Các nhà nuôi cấy mô và tế bào đã khẳng định môi trƣờng chỉ bao gồm muối khoáng và đƣờng chƣa đủ cho tế bào sinh trƣởng tốt. Vì vậy, ngƣời ta bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy một số nhóm chất tự nhiên nhƣ: Nƣớc dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết mần lúa mì, một số dịch chiết rau, quả tƣơi,... nhằm làm tăng thành phần dinh dƣỡng và cũng có các chất hoạt tính sinh học giúp kích thích sự sinh trƣởng, phát triển của cây in vitro.  Chất làm đông môi trƣờng Thạch Agar – là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu là tảo hồng Rhodophyta), trong đó có rau câu mọc ở vùng đầm phá Việt Nam. Agar khi ngâm nƣớc ở 80oC sẽ chuyển sang dạng sol và ở 40oC thì trở lại trạng thái gel. Khả năng ngậm nƣớc của agar cao khoảng 6 – 12 g/l nƣớc. Tuy ở trạng thái gel nhƣng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng.  Chất điều hòa sinh trƣởng Các chất điều hòa sinh trƣởng có vai trò quan trọng nhất quyết định đến kết quả nuôi cấy in vitro. Những chất điều hòa sinh trƣởng đó thuộc các nhóm sau: 11 Nhóm các Auxin Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng thƣờng xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trƣờng dinh dƣỡng để kích thích sự tăng trƣởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó đƣợc phối hợp sử dụng với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trƣờng nuôi cấy phụ thuộc vào: - Kiểu tăng trƣởng hoặc phát triển cần nghiên cứu - Hàm lƣợng auxin nội sinh của mẫu cấy - Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy - Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh - Đặc tính của auxin: Auxin có vai trò kích thích sự tăng trƣởng và kéo dài tế bào. Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào. Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. 2,4-D (2,4-D- Dichlorophenoxyaxetic axid) rất có hiệu quả đối với môi trƣờng tạo và phát triển callus. NAA chủ yếu sử dụng cho môi trƣờng ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trƣờng ra chồi. Nhóm các cytokinin Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ƣu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô. Các cytokinin đƣợc sử dụng thƣờng xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6- benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethylaminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6- amine (kinetin), và 6(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin). Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi trƣờng nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cƣờng phát sinh chồi phụ. Chức năng chủ yếu của các cytokinin đƣợc khái quát nhƣ sau: 12 - Kích thích phân chia tế bào - Tạo và nhân callus - Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô - Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hƣởng ƣu thế của chồi đỉnh - Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào - Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế sự hình thành rễ - Ức chế sự kéo dài chồi - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục Gibberellin Nhƣng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic acid chƣa thật rõ ràng. Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trƣờng chuyên dụng nào đó. Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất đƣợc sử dụng nhiều hơn cả trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính. So với auxin và cytokinin, gibberellin hiếm khi đƣợc dùng. GA3 có tính hoà tan trong nƣớc. Gibberellin có các chức năng cơ bản sau: - Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trƣởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chƣa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit. - Kích thích kéo dài chồi do tăng cƣờng phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân. Các cây lùn thƣờng bị thiếu gibberellin. - Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch. 13 - Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Năm đầu thân mầm nằm in, sau mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa. - Ức chế sự hình thành rễ bất định. - Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây. - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ). - Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trƣởng của ống phấn. - Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thƣớc quả nho không hạt. - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi. Ảnh hưởng của than hoạt tính Nồng độ sử dụng thƣờng là từ 0,2 – 3%. Than hoạt tính có những tác dụng sau: - Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố không màu khác. - Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin, chelate Fe và Zn,…). - Thúc đẩy sự tạo phôi soma. - Ổn định độ pH.  Độ pH của môi trƣờng Độ pH của môi trƣờng dinh dƣỡng ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng vào tế bào. Độ pH của môi trƣờng cấy hầu hết đƣợc chỉnh ở 5,5 ± 0,1 trƣớc khi hấp khử trùng. Độ pH ảnh hƣởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trƣờng khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trƣởng của tế bào. Vì vậy xác định chính xác độ pH là cần thiết. Murashige và Shoog nhận thấy rằng pH 5,7-5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trƣờng MS. 14 Nếu môi trƣờng MS đƣợc sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH ở 5, môi trƣờng cấy huyền phù có pH thấp phần nào giảm bớt tính trạng nhiễm. Độ pH của môi trƣờng thƣờng đƣợc điều chỉnh bằng NaOH hoặc HCl sau khi đã pha xong môi trƣờng và chuẩn bị đƣa và hấp khử trùng. Có thể chỉnh pH bằng pH kế để bàn, pH kế cầm tay hoặc giây đo pH. Thƣờng thì nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính axit của môi trƣờng. Mann và cộng sự nhận thấy rằng nếu trƣớc khi hấp pH=5,7 thì sau khi hấp pH = 5, nếu muốn pH =5,7-5,9 thì trƣớc khi hấp khử trùng cần điều chỉnh pH đến 7. Ngoài ra môi trƣờng cần có nƣớc hoàn toàn sạch ion, thƣờng sử dụng nƣớc cất 2 lần. 1.2.5. Các giai đoạn nhân giống in vitro 1.2.5.1. Giai đoạn 1:Tạo vật liệu khởi đầu in vitro (Khử trùng mô cấy) Lựa chọn mẫu và đƣa mẫu vào nuôi cấy cần đảm bảo các yêu cầu sau: + Tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh thấp + Tỷ lệ sống cao + Tốc độ sinh trƣởng nhanh Giai đoạn này rất quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc rất nhiều vào việc lấy mẫu, vì vậy tùy thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây trồng khác nhau mà lấy mẫu cho phù hợp. Khử trùng mẫu trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy bằng hóa chất khử trùng để loại bỏ các tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn). Chọn đúng phƣơng pháp khử trùng sẽ đƣa lại hiểu quả kinh tế cao. Thông thƣờng các chất thƣờng dùng để khử trùng là: HgCl2 1%; Ca(OCl)2 từ 5 – 7%; H2O2 hoặc dung dịch brôm khoảng 3%. Mẫu sau khi đƣợc khử trùng sẽ đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy, môi trƣờng nuôi cấy tùy thuộc vào loại cây trồng nhƣng phổ biến là: + Muối khoáng theo Murashige & Skoog (1962) 15 + Chất hữu cơ: Sarcarozo + Vitamin: Làm tăng thành phần dinh dƣỡng và cũng có các chất hoạt tính sinh học nên B1, B6, inositol, nicitin axit + Hormon: Auxin (IAA, NAA, 2,4-D); cytokinin (BA, Kinin); gibbrellin (GA 3) 1.2.5.2. Giai đoạn 2:Tái sinh mô nuôi cấy Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thƣờng đƣợc sử dụng là chồi hoặc chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tùy từng đối tƣợng mà ngƣời ta còn có thể dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa,...Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hƣớng các mô nuôi cấy. Quá trình này đƣợc điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ các hợp chất auxin, cytokinin ngoại sinh đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh lý của mẫu cấy. Ngƣời ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy của cây đƣợc lấy vào thời kỳ sinh trƣởng mạnh cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. 1.2.5.3. Giai đoạn 3:Nhân nhanh chồi Giai đoạn này đƣợc xem là giai đoạn then chốt của quá trình vì mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát triển số lƣợng lớn của chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định, đơn vị mẫu cấy tính theo số chồi ban đầu hoặc số protocom ban đầu, tức là phải đạt hệ số nhân giống lớn nhất. Để tăng hệ số nhân ngƣời ta thƣờng phải đƣa thêm vào môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trƣởng (Auxin, Cytokinin, Gibberelin), các chất bổ sung khác nhƣ nƣớc dừa, nƣớc chiết giấm men, dịch thủy phân Casein,... kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào từng đối tƣợng nuôi cấy ngƣời ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: 16 + Phát triển chồi nách + Tạo cụm chồi + Tạo phôi vô tính 1.2.5.4. Giai đoạn 4:Tạo cây hoàn chỉnh và huấn luyện cây con Kết thúc giai đoạn nhân nhanh ta đƣợc số lƣợng lớn chồi nhƣng chƣa hình thành cây hoàn chỉnh do chƣa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển chồi từ giai đoạn nhân nhanh sang môi trƣờng tạo rễ. Tách các chồi đơn cấy chuyển sang môi trƣờng có bổ sung auxin, thƣờng sau từ 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con đã đủ các cơ quan nhƣ thân, rễ, lá, đỉnh sinh trƣởng,…Trƣớc khi đƣa ra điều kiện tự nhiên cần huấn luyện để cây con thích nghi dần với điều kiện tự nhiên bằng cách thay đổi từ từ các điều kiện nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, nƣớc,... Giai đoạn này chủ yếu trong ống nghiệm. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải đƣợc chăm sóc và bảo bệ trƣớc những yếu tố bất lợi sau: - Mất nƣớc nhanh làm cho cây bị héo khô. - Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tƣợng thối nhũn. - Cháy lá do nắng. 1.2.5.5. Giai đoạn 5:Đưa cây ra đất Đƣa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất là bƣớc cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bƣớc quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Trƣớc khi trồng vào đất cây con thƣờng đƣợc trồng vào các giá thể xốp nhẹ nhƣ: Trấu hun, sơ dừa,... Đặt trong nhà lƣới có sự điều chỉnh ánh sáng, độ ẩm thích hợp trong một thời gian cho cây phát triển và quen dần với điều kiện môi trƣờng trƣớc khi trồng ra đất. 17 1.2.6. Các giai đoạn phát sinh phôi soma Sự phát sinh phôi bắt đầu từ một hợp tử theo một chƣơng trình di truyền đặc trƣng cho loài chịu sự kiểm soát của yếu tố môi trƣờng. Các giai đoạn của phát sinh phôi (của cây mô hình Arabidopsis) gồm: - Giai đoạn phôi hình cầu: Sau lần phân chia đầu tiên của hợp tử, tế bào ở đỉnh trải qua một loạt phân chia có thứ tự, hình thành một thể phôi hình cầu gồm 8 tế bào, tế bào phía dƣới cũng trải qua một số lần nguyên phân để tạo thành cuống phôi, giúp đính phôi trong túi phôi và giúp hấp thụ dinh dƣỡng cho phôi từ môi trƣờng xung quanh. Trong giai đoạn này, sự phân chia tế bào xảy ra ở tất cả các tế bào. Nguyên bì sẽ trở thành biểu bì trong phôi trƣởng thành. Cuống phôi giúp đính phôi trong túi phôi. - Giai đoạn phôi hình tim: Giai đoạn này đƣợc hình thành bởi sự phân chia nhanh của các tế bào ở hai vùng đỉnh của khối cầu. Hai vùng này sinh trƣởng nhanh tạo thành hai lá mầm, kết quả phôi có hình đối xứng hai bên. - Giai đoạn phôi hình “cá đuối”: Giai đoạn này là kết quả của các tế bào kéo dài khắp trục phôi và phát triển của lá mầm sau này. Trục chồi - rễ (trục phôi) xuất hiện rõ rệt, mô phân sinh đỉnh bắt đầu hoạt động tạo thành mô mạch sơ cấp (mạch gỗ và mạch rây). - Giai đoạn phôi trƣởng thành: Là giai đoạn kết thúc quá trình phát sinh phôi. Sự phát sinh phôi ở thực vật diễn ra theo cả mô hình trục và mô hình tỏa tròn:  Mô hình trục: là sự bố trí các tế bào, mô và cơ quan thực vật theo một trục phân cực. Mô phân sinh đỉnh chồi là điểm kết thúc, mô phân sinh rễ ở đầu còn lại. Trong phôi và cây non, một hoặc hai lá mầm đƣợc gắn phía 18 dƣới của mô phân sinh đỉnh chồi. Tiếp đó là trụ dƣới lá mầm, sau đó là rễ, mô phân sinh đỉnh rễ và chóp rễ. Mô hình trục đƣợc thiết lập trong suốt quá trình phát sinh phôi. Trong bất kì một đoạn riêng biệt của rễ hoặc chồi đều có đỉnh và đầu dƣới khác nhau, chẳng hạn nhƣ khác biệt sinh lý và thuộc tính cấu trúc. Ví dụ, trong khi rễ phát triển từ đầu dƣới gốc cắt, chồi phát triển từ ở đỉnh, ngay cả khi chúng ta đảo ngƣợc.  Sự phát triển phôi theo mô hình trục của phôi: Hợp tử đƣợc hình thành sẽ kéo dài, hình thành nên trục lƣỡng cực. Phía trên của hợp tử chứa nhân và tế bào chất đậm đặc hơn, phía dƣới chứa phần lớn không bào trung tâm. Lần phân chia lần đầu tiên của hợp tử là không đối xứng và diễn ra vuông góc với trục lƣỡng. Sự phân chia này tạo ra hai tế bào – một tế bào đỉnh và một tế bào gốc có nhiệm vụ khác nhau. Tế bào đỉnh có kích thƣớc nhỏ hơn nhận nhiều tế bào chất hơn tế bào gốc, và nhận không bào lớn của hợp tử. Gần nhƣ tất cả các cấu trúc của phôi, và thực vật trƣởng thành, đều xuất phát từ tế bào đỉnh nhỏ hơn. Hai lần phân chia dọc và một lần phân chia ngang của tế bào đỉnh tạo thành tám tế bào, phôi hình cầu. Tế bào gốc cũng phân chia, nhƣng các lần phân chia theo phƣơng nằm ngang, vuông góc với trục tế bào. Kết quả là sợi trục gồm 6 đến 8 tế bào giống nhƣ cuống gắn vào phôi tới hệ mạch của thực vật. Kết thúc của quá trình phát sinh, phôi gồm 3 vùng: + Vùng đỉnh: Hình thành các lá mầm và mô phân sinh đỉnh chồi. + Vùng trung gian (giữa): Tạo thành trụ dƣới lá mầm, rễ, và gần nhƣ mô phân sinh rễ. + Vùng cuống phôi: Tạo thành phần còn lại của mô phân sinh rễ.  Mô hình tỏa tròn: trong chồi và rễ, các mô đƣợc sắp xếp dạng tỏa tròn. Ví dụ, khi quan sát cắt ngang rễ thấy ba vòng đồng tâm của mô sắp xếp theo một trục tỏa tròn: lớp ngoài cùng là các tế biểu bì bao một trụ của mô vỏ, 19 chúng nằm vòng quanh mạch (nội bì, trụ bì, mạch rây và mạch gỗ). Mô hình tỏa tròn đƣợc quan sát sớm nhất ở giai đoạn phôi có tám tế bào. Các tế bào phân chia liên tục và đƣợc sắp xếp tỏa tròn thành mô đỉnh chồi và đỉnh rễ. Các tế bào lớp ngoài cùng tạo thành một lớp tế bào bề mặt có một tế bào dày, đƣợc gọi là nguyên bì. Nguyên bì bao phủ cả hai nửa của phôi và sẽ hình thành nên biểu bì. 1.2.7. Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng 1.2.7.1. Tạo cây con Mô phân sinh của Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms đƣợc cảm ứng để phát triển thành cây con trong môi trƣờng MS dinh dƣỡng khoáng và bổ sung 2mg/l BAP. Trong môi trƣờng này trung bình tạo 4,1 ± 0,25 chồi trong 60 ngày. Tất cả chồi phát triển từ chồi nách mà không tạo sẹo [11]. Quy trình nhân giống cây Đinh lăng lá nhỏ bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô – tế bào: Vật liệu sử dụng ban đầu là chồi đã qua quá trình khử trùng, sau 2 tuần cho tỷ lệ mẫu sạch tái sinh cao nhất là 73,33%. Các mẫu sạch đƣợc tái sinh tốt nhất và nhanh nhất trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP 2 mg/l và IBA 0,5 mg/l. Trong môi trƣờng tạo đa chồi (tăng các chất khoáng đa lƣợng trong môi trƣờng MS lên 1,5 lần và bổ sung 2 mg/l BAP), 100% mẫu cấy tạo đa chồi và số chồi trung bình đạt 7,13 chồi/mẫu, chất lƣợng chồi tốt sau 6 tuần nuôi cấy [22]. Chồi non (1 – 3 tháng) đƣợc lấy từ các cây Đinh lăng ngoài tự nhiên, các chồi non đƣợc ngâm trong chất khử trùng (Sodium Hypochlorite 5,25%) tỷ lệ 20, 25, 30% trong 10, 15, 20 và 25 phút, sau đó rửa sạch trong nƣớc cất khử trùng năm lần để loại bỏ chất khử trùng. Sau đó cắt chồi đã đƣợc khử trùng nên cắt khoảng 0,5 – 1 cm. Mẫu vô trùng đƣợc cấy trên môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung 0.5, 1.0, 3.0, 5.0 mg/l BAP và kinetin với các nồng độ khác nhau là 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg/l kết hợp với 3 g/l than hoạt tính. Đặt mẫu trên giàn nuôi cấy dƣới ánh 20 sáng có cƣờng độ ánh sáng 300 lux, thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày, nhiệt độ trung bình là 25 ± 20C. Đối với giai đoạn nhân nhanh mẫu đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau. Giai đoạn ra rễ sử dụng các chồi non đã đƣợc cấy trên môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau là 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg/l hoặc bổ sung IBA ở các nồng độ 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg/l. Cây con đơn lẻ đƣợc chọn ra và trồng trên giá thể trong một thời gian trƣớc khi trồng ra ngoài tự nhiên [14]. 1.2.7.2. Tạo phôi soma Cây Đinh lăng tái sinh đƣợc hình thành qua con đƣờng tạo phôi soma. Mẫu sử dụng để nuôi cấy là chồi đỉnh hay chồi bên còn non của cây Đinh lăng. Môi trƣờng sử dụng là MS cơ bản và có bổ sung Vitamin Morel, nƣớc dừa 10%, 30 g/l saccaroso và các hoocmon sinh trƣởng. Điều kiện nuôi cấy mô ở nhiệt độ 26oC, cƣờng độ chiếu sáng 2000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày [3]. 1.2.7.3. Tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma Môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D 2mg/l là thích hợp cho sự cảm ứng tạo mô sẹo ở mẫu cấy lá và thân cây Đinh lăng. Nếu chuyển loại mô sẹo này sang môi trƣờng không có auxin ngoại sinh sẽ tạo phôi soma sau 8 tuần. Mô sẹo có rễ và cây con từ phôi soma đƣợc xác định có sự hiện diện sapoin thông qua phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng và đánh giá khả năng tạo bọt [11]. Mô sẹo 14 tuần tuổi của cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms nuôi trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,4 - D 2mg/l và 20% nƣớc dừa là vật liệu tốt nhất để sử dụng làm vật liệu tạo dịch treo tế bào. Môi trƣờng lỏng MS có bổ sung 2,4 - D 1mg/l và 20% nƣớc dừa là môi trƣờng thu nhận các dòng tế bào cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L.) Harms có khả năng sinh phôi. Đó là các tế bào vách mỏng, đẳng kính, nhân to, tế bào chất đậm đặc. Môi 21 trƣờng lỏng MS có bổ sung 2,4 - D 1mg/l, BA 2 mg/l và 20% nƣớc dừa là môi trƣờng mà các dòng tế bào có khả năng sinh phôi của cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms tạo đƣợc rễ. Từ số lƣợng lớn rễ này có thể thu nhận sapoin bằng các phƣơng pháp li trích [15]. 1.2.7.4. Nhân nhanh chóng phôi soma thứ cấp của cây Đinh lăng Lá và cuống lá đƣợc sử dụng để thử nghiệm sơ bộ trong môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung 2,4-D 2 mg/l, BAP 2 mg/l, và 60 g/l đƣờng sucrose để cảm ứng tạo mô sẹo. Thí nghiệm đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, lá và cuống lá tạo thành mô sẹo và mô sẹo phát triển đƣợc cấy chuyển 4 tuần mỗi lần. Sau khi mô sẹo đƣợc hình thành trên các đoạn lá đƣợc tách ra và đặt trên môi trƣờng MS cơ bản chứa 30 g/l đƣờng sucrose vàcó bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau: 0,1 – 0,2 mg/l 2,4-D, 0,1 – 2,0 mg/l axit 2,4,5trichlorophenoxyacetic, 0,01 – 1,0 mg/l BAP, và 0,01 – 1,0 mg/l kinetin một cách riêng rẽ hoặc kết hợp chúng. Khi mô sẹo phát triển từ các cuống lá và lá non thì có màu xanh lá cây tƣơi sáng và lỏng lẻo trong cấu trúc, cảm ứng để tạo mô sẹo phôi sử dụng cho các nghiên cứu sâu hơn [17]. Mô sẹo đƣợc chia thành các mảnh vỡ nặng khoảng 3 g (trọng lƣợng tƣơi) và đặt bình tam giác chứa150 ml môi trƣờng lỏng đƣợc thử nghiệm với các công thức khác nhau sau:  MS cơ bản + 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0 ml/l BAP + 30 g sucrose  ½ MS cơ bản + 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BAP + 30 g sucrose  ½ MS cơ bản + 30 g sucrose Cấy chuyển các phôi mô sẹo trong khoảng thời gian 4, 6, và 8 tuần ra các đĩa Petri vô trùng và đánh gia bằng kính hiển vi. Sau khi mô sẹo đƣợc chuyển vào các môi trƣờng: ½ MS cơ bản + 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BAP + 30 g sucrose, ½ MS cơ bản + 30 g sucrose thì bắt đầu cảm ứng tạo phôi soma, phôi soma phát triển ở các giai đoạn khác 22 nhau, năng suất tạo phôi soma cao nhất ở môi trƣờng ½ MS cơ bản + 30 g sucrose không có chất điều hòa sinh trƣởng sau 6 tuần. Ở môi trƣờng MS cơ bản + 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0 ml/l BAP + 30 g sucrose, ½ MS cơ bản + 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BAP + 30 g sucrose chủ yếu hình thành phôi hình cầu, có màu nâu nhạt. Phôi phát triển trong các môi trƣờng lỏng đƣợc chuyển sang môi trƣờng vững chắc. Phôi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ½ MS cơ bản với 50 g/l sucrose sau 7 ngày nuôi cấy hầu hết phôi ở giai đoạn hình tim hoặc phôi hình cá đuối. Mỗi phôi soma phát triển một hoặc nhiều chồi[17]. 23 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 10/2013 đến tháng 4/2015 tại Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Thực vật Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu MẫuĐinh lăng (Polyscias fruticosa (L.)Harms) Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật – Khoa Sinh KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2cung cấp. 2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ Các thiết bị: Tên thiết bị Model & hãng sản xuất Cân kĩ thuật GM612, Đức Tủ lạnh sâu FRIGO Máy đo pH HM30G/TOA, Đức Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAYAMA, Nhật Tủ lạnh Hitachi 31AG5D, Thái lan Máy cất nƣớc hai lần Trung Quốc Buồng cấy vô trùng AV – 110/TELSTAR Máy khuấy từ gia nhiệt ARE/VELP, Italia Cân phân tích CP224S, Đức Tủ ấm UNIVERSAL 320R/ HETTICH, Đức Micropipet Jinson Các loại 200 - 1000µl (Pháp) 24 Dụng cụ:Pipet tự động các loại, các tủ đựng hóa chất,các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50 ml, 15 ml,...), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy, panh, kéo,... 2.2.3. Môi trường nuôi cấy Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962): Thành phần Khoáng đa lƣợng Khoáng vi lƣợng Sắt EDTA Vitamin Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 MnSO4.4H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3PO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Myo-Inositol 100 Thiamin (B1) 0,5 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine (B6) 0,5 Glycine 2 Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng: BAP, NAA (mg/l). 25 Các thành phần khác: Đƣờng saccarose: 30 g/l Agar: 8 g/l Môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N và HCl 1N) trƣớc khi hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 117oC, 1atm trong 15 phút (đối với các dụng cụ thí nghiệm, dụng cụ thủy tinh không chứa môi trƣờng thì khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút). 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối Nhiệt độ: 25 ± 2o C Độ ẩm: 50 – 60 % Cƣờng độ ánh sáng: 2000 lux 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu Cắt mẫu vật (đoạn thân, mảnh lá…) Cây Callus Cấy gây Cấy vào môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp Callus phátsinh phôi phôi nảy vô mầm tính Cây in vitro hoàn chỉnh 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nghiên, mỗi công thức đƣợc nhắc lại 4 lần, 30 mẫu/công thức. 2.3.2.1. Thí nghiệm 1: Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng Lá non và thân cây Đinh lăng đƣợc cắt từ mẫu Đinh lăng sạch sử dụng để đặt vào môi trƣờng tạo mô sẹo theo các công thức theo bảng 2.1. Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của 2,4 -D và Kinetin đến khả năng tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng Môi trƣờng Công thức ĐC MS T1 MS + 2,4 - D 2 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l T2 MS + 2,4 - D 2,5 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l T3 MS + 2,4 - D 3 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l 27 Mẫu Đinh lăng sạch đƣợc lấy ra trong buồng cấy an toàn sinh học, tách mẫu Đinh lăng đa chồi thành các mẫu đơn chồi, cắt lá non của các chồi và cắt một phần cuống thân rồi đƣa các mẫu đó vào các môi trƣờng nhƣ bảng 2.1. Đặt trên giàn nuôi cấy theo dõi sự tạo thành mô sẹo qua các tuần (2 tuần, 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần). Chỉ tiêu theo dõi: - Màu sắc - Độ xốp - Kích thƣớc 2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo ở cây Đinh lăng từ lá non và thân cây Sau khi xác định đƣợc công thức tạo mô sẹo tốt nhất sau 8 tuần nuôi cấy, chúng tôi chuyển mô sẹo đã hình thành sang môi trƣờng MS có bổ sung BAP, Kinetin ở các nồng độ khác nhau để theo dõi ảnh hƣởng của BAP, Kinetin đến sự phát sinh hình thái mô sẹo cây Đinh lăng. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với các công thức sau: Bảng 2.2. Công thức xác định ảnh hƣởng của BAP, Kinetin đến quá trình phát sinh hình thái mô sẹo cây Đinh lăng Công thức Môi trƣờng ĐC MS T1 BAP 1 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l T2 BAP 1 mg/l + Kinetin 1 mg/l T3 BAP 3 mg/l + Kinetin 1 mg/l T4 BAP 3 mg/l Theo dõi sự phát sinh phôi của cây Đinh lăng qua 4 giai đoạn sau: - Giai đoạn phôi hình cầu. - Giai đoạn phôi hình tim. 28 - Giai đoạn phôi hình “cá đuối”. - Giai đoạn phôi trƣởng thành. Chúng tôi tiến hành chụp ảnh hình thái phôi ở các giai đoạn sử dụng kính hiển vi soi nổi. 2.3.2.3. Thí nghiệm3: Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng) Các chồi tái sinh sau khi thực hiện thí nghiệm 2 có chiều cao 2 – 3 cm chúng tôi tiến hành cắt đƣa vào môi trƣờng MS có bổ sung NAA với nồng độ khác nhau, để xác định hiệu quả của NAA đến khả năng tạo rễ cọc của cây Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo nhằm đạt hiệu quả kinh tế cao.Thí nghiệm đƣợc tiến hành với các công thức sau: Bảng 2.3.Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng Môi trƣờng Công thức ĐC MS T1 MS + NAA 0,3 mg/l T2 MS + NAA 0,5 mg/l Chỉ tiêu theo dõi: - Công thức nào tạo rễ cọc và công thức nào tạo rễ chùm. - Chiều dài rễ tái sinh từ mô sẹo (cm) sau 4 tuần so với rễ chồi đỉnh Đinh lăng đƣợc tạo ra bằng phƣơng phƣơng pháp tạo đa chồi. 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L). Harms) Kỹ thuật tạo dòng các tế bào đơn đƣợc phân lập trong điều kiện in vitro đã chứng minh một thực tế rằng các tế bào soma, dƣới các điều kiện thích hợp, có thể phân hóa để phát triển thành một cơ thể thực vật hoàn chỉnh. Sự phát triển của một cơ thể trƣởng thành từ tế bào đơn (hợp tử) là kết quả của sự hợp nhất sự phân chia và phân hóa tế bào. Để biểu hiện tính toàn thế, các tế bào phân hóa đầu tiên trải qua giai đoạn phản phân hóa và sau đó là giai đoạn tái phân hóa. Hiện tƣợng tế bào trƣởng thành trở lại trạng thái phân sinh và tạo ra mô callus không phân hóa đƣợc gọi là phản phân hóa, trong khi khả năng để các tế bào phản phân hóa tạo thành cây hoàn chỉnh hoặc các cơ quan thực vật đƣợc gọi là tái phân hóa. Mô sẹo đƣợc tạo thành phụ thuộc vào việc sử dụng auxin riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin, bản chất hay nồng độ của auxin. Mặt khác auxin đặc biệt là 2,4 – D đƣợc sử dụng thƣờng xuyên trong cảm ứng tạo mô sẹo ở nhiều loài thực vật. Ngoài ra auxin cần thiết để tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi ở nhiều loài thực vật. Thí nghiệm này là tìm ra môi trƣờng có nồng độ auxin và cytokinin tốt nhất để tạo mô sẹo cây Đinh lăng dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm sau. 3.1.1. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 2 tuần ở các công thức - ĐC (môi trƣờng MS): Lá và phần thân cây vẫn giữ nguyên trạng thái ban đầu là có màu xanh. - T1 (môi trƣờng MS + 2,4 - D 2 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l): 30 Lá và cuống thân vẫn xanh. Phần vết cắt, rìa lá và cuống thân tiếp xúc trực tiếp với môi trƣờng có dấu hiệu có khả năng tạo thành mô sẹo thấy xuất hiện màu kem trắng, những phần đó phồng ra không đáng kể. - T2 (môi trƣờng MS + 2,4 - D 2,5 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l): Lá và cuống thân vẫn xanh. Phần vết cắt màu vàng nhạt,phồng ra không đáng kể, và phần vết cắt phồng ra kích thƣớc nhỏ hơn môi trƣờng T1 trông thấy. - T3 (môi trƣờng MS + 2,4 - D 3 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l): Lá và cuống thân vẫn xanh. Phần vết cắt màu vàng hơi nâu, phồng ra không đáng kể, và phần vết cắt phồng ra kích thƣớc nhỏ hơn môi trƣờng T1 trông thấy. CT ĐC CT T1 31 CT T2 CT T3 Hình 3.1.1. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 2 tuần 3.1.2. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 4 tuần ở các công thức - ĐC: Lá và phần thân cây vẫn giữ nguyên trạng thái ban đầu là có màu xanh. - T1: Tế bào mô sẹo xuất hiện quanh vị trí vết cắt và rìa lá tiếp tục gia tăng kích thƣớc và có màu kem trắng. Phần lá xanh sát nơi phồng tạo mô sẹo trở nên xanh nhạt, hơi trắng, và to hơn ban đầu. Những phần lá còn lại vẫn xanh nhƣ trƣớc. - T2: Phần lá và cuống thân tạo mô sẹo lan rộng hơn nhƣng kích thƣớc vẫn nhỏ hơn môi trƣờng T1, có màu vàng nghệ. Một phần rìa lá nhỏ bị úa vàng và chết. 32 - T3: Kích thƣớc phần mô sẹo đƣợc tạo thành nhỏ hơn môi trƣờng T1. Phần mô sẹo có màu vàng nâu , một phần rìa lá bị úa vàng và chết nhiều hơn môi trƣờng T2. CTT1 33 CT T2 CT T3 Hình 3.1.2. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 4 tuần 34 3.1.3. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 8 tuần ở các công thức - Đa phần các môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu sắc mô sẹo nhƣ trƣớc, trọng lƣợng tƣơi tăng trƣởng ổn định, chỉ còn một phần nhỏ lá và cuống thân chƣa tạo mô sẹo. - Môi trƣờng T1 có kích thƣớc mô sẹo lớn nhất, mô sẹo xốp nhất , màu sắc tƣơi nhất. - Môi trƣờng T2, T3 có kích thƣớc nhỏ hơn, phần lá không tạo mô sẹo và bị chết nhiều nhất ở môi trƣờng T3. CT T1 35 CT T2 CT T3 Hình 3.1.3. Hình thái lá Đinh lăng ở các công thức khác nhau sau 8 tuần 36 3.1.4. Quan sát sự tạo thành mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng sau 14 tuần ở các công thức. Mô sẹo đƣợc tạo thành và ổn định. CT T1 CT T2 CT T3 Hình 3.1.4. (a) Mô sẹo Đinh lăng ở các công thức sau 14 tuần ở các công thức 37 CT T1 n CT T2 CT T3 Hình 3.1.4. (b) Hiệu quả các môi trƣờng tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng Kết quả cho thấy, mẫu sử dụng ở công thức ĐC không cho hiệu quả tạo mô sẹo, các mẫu vẫn giữ nguyên trạng thái lá ban đầu trong thời gian nuôi cấy. Các công thức từ T1 đến T3 cho thấy có khả năng tạo thành mô sẹo. Tuy nhiên có sự khác nhau về hiệu quả nhƣ sau: Hiệu quả tạo mô sẹo tốt nhất ở môi trƣờng T1, tiếp theo là T2, và T3. Kết quả này cho thấy, nồng độ 2,4 - D 2 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l là phù hợp nhất cho sự tạo mô sẹo ở lá non và thân cây Đinh lăng, sự gia tăng nồng độ 2,4 - D cũng đƣa lại hiệu quả tạo mô sẹo nhƣng không cao vì có biểu hiện mô sẹo không tƣơi, sức sống yếu và phần lá bị chết và không tạo mô sẹo nhiều. 38 Từ kết quả này, chúng tôi tìm ra môi trƣờng sử dụng tốt nhất cho sự tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng là môi trƣờng MS + 2,4 - D 2 mg/l + Kinetin 0,2 mg/l. 3.2. Quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹo ở cây Đinh lăng từ lá non và thân cây Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhƣng do không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, và vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, các phôi vô tính có vật chất di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng. Ở trƣờng hợp phôi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử. Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phôi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ và ngọn. Khi hợp tử phát triển, miền sinh trƣởng rễ và miền sinh trƣởng ngọn cùng phát triển và cuối cùng tạo thành cây hoàn chỉnh, qua các giai đoạn phôi học nhƣ sau: - Trƣờng hợp cây hai lá mầm: Dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm - Trƣờng hợp cây một lá mầm: Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu Ở rất nhiều cây, ngƣời ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức đã tạo nên callus khi nuôi cấy. Có thể thay đổi hƣớng phát triển của chúng để tạo ra các phôi vô tính với các bƣớc phát sinh hình thái rất giống với trƣờng hợp phôi hữu tính. Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lƣợng và chất dinh dƣỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn không có nội nhũ. Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện vật lý, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống, dòng trong cùng một loài. 39 Quá trình tạo mô sẹo từ lá và thân cây Đinh lăng thấy có sự biến đổi về mặt hình thái sau hai tuần nhận thấy có sự phản phân hóa của tế bào nhu mô. Quan sát các dòng có khả năng phát sinh phôi thấy các tế bào này có quá trình phát triển giống nhƣ quá trình phát triển của phôi hợp tử, gồm các giai đoạn phát triển: phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình cá đuối, phôi trƣởng thành. Sau 4 tuần chuyển mô sẹo vào các môi trƣờng kích thích sự phát sinh hình thái chúng tôi quan sát thấy phôi ở giai đoạn phôi hình cầu nhƣ hình 3.2 (a). Hình 3.2. (a) giai đoạn phôi hình cầu Sau 5 tuần quan sát thấy phôi ở giai đoạn phôi hình tim nhƣ hình 3.2 (b). 40 Hình 3.2. (b) giai đoạn phôi hình tim Sau 6 tuần quan sát thấy phôi ở giai đoạn phôi hình “cá đuối” nhƣ hình 3.2 (c). 41 Hình 3.2. (c) giai đoạn phôi “cá đuối” Sau 7 tuần quan sát thấy phôi ở giai đoạn phôi trƣởng thành nhƣ hình 3.2 (d). 42 43 Hình 3.2. (d) giai đoạn phôi trƣởng thành Từ thí nghiệm này ta thấy tác động của BAP và kinetin đến sự phát sinh hình thái là tƣơng đối chậm. Công thức T1 (BAP 1 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l) sau khi chuyển mô sẹo vào thì sau 4 tuần mô sẹo có dấu hiệu hơi vàng đen và không còn màu tƣơi nhƣ trƣớc, một phần mô sẹo chết. Các tuần tiếp theo màu sắc đen hơn, phần mô sẹo chết tăng dần về kích thƣớc và kết quả là sau 7 tuần mô sẹo ở công thức T1 chết hoàn toàn và có màu đen. Nhƣ vậy công thức T1 cho thấy BAP và kinetin ở nồng độ thấp không có khả năng phát sinh hình thái mô sẹo. Khi tăng nồng độ BAP và kinetin nên nhƣ ở công thức T2(BAP 1 mg/l + Kinetin 1 mg/l), T3(BAP 3 mg/l + Kinetin 1 mg/l) và công thức T4 (BAP 3 mg/l) thì khả năng phát sinh hình thái và cơ quan của mô sẹo càng tăng. Trong đó công thức T4 là có tác động mạnh nhất đến khả năng phát sinh hình thái mô sẹo, tốc độ phát sinh hình thái của mô sẹo là nhanh hơn, và số lƣợng chồi phát sinh là nhiều nhất sau 7 tuần nghiên cứu. 44 (e) (f) (g) (h) Hình 3.2. Sự phát sinh hình thái từ mô sẹo lá cây Đinh lăng sau 7 tuần ở các công thức: (e) CT T1, (f) CT T2, (g) CT T3, (h) CT T4 45 Nhƣ vậy từ thí nghiệm này giúp chúng tôi tìm ra công thức thích hợp nhất đối với quá trình phát sinh hình thái chồi từ mô sẹo cây Đinh lăng là môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung BAP 3 mg/l và 15 g đƣờng. Hình 3.2. (i) hình thái chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo ở công thức CTT4 sau 14 tuần 46 3.3.Tạo rễ cây Đinh lăng tái sinh (Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ ở chồi tái sinh của cây Đinh lăng) Sau thí nghiệm 2 chúng tôi sử dụng chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo đặt sang môi trƣờng có bổ sung NAA với nồng độ khác nhau để xác định ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo rễ của chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo so với chồi Đinh lăng qua con đƣờng tạo đa chồi từ mô phân sinh đỉnh. Rễ là một bộ phận quan trọng của cây. Nó có tác dụng hút nƣớc, muối khoáng và chất dinh dƣỡng cung cấp cho cây sinh trƣởng và phát triển. Do đó, trong việc tạo cây in vitro hoàn chỉnh ta phải quan tâm đến bộ rễ của cây, tìm môi trƣờng thật sự thích hợp cho sự tạo và phát triển của rễ. Trong nuôi cấy mô, việc bổ sung các auxin vào môi trƣờng nuôi cấy cho hiệu quả kích thích cây khỏe mạnh, tạo nhiều rễ, phát triển tốt. Việc này phụ thuộc vào loại auxin sử dụng trong thí nghiệm, cũng nhƣ nồng độ sử dụng chúng. Thông thƣờng chồi Đinh lăng không tạo rễ ở môi trƣờng có bổ sung NAA 0,3 mg/l trong vòng 4 tuần. Ở nồng độ NAA cao hơn là o,5 mg/l thì Đinh lăng bắt đầu mọc rễ chùm trắng sau 4 tuần, nhƣ vậy là tác động của NAA đến việc tạo rễ của cây Đinh lăng in vitro là tƣơng đối chậm. Đối với chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo lá non và thân cây thì ngay cả ở môi trƣờng có bổ sung NAA 0,3 mg/l cũng bắt đầu tạo rễ sau 1 tuần, rễ chùm có màu trắng. Còn trong môi trƣờng có bổ sung NAA 0,5 mg/l sau 1 tuần tốc độ tạo rễ nhanh hơn, và đặc biệt xuất hiện cả rễ chùm và rễ cọc. Từ thí nghiệm này chúng tôi nhận thấy tác động của NAA đến việc tạo rễ của cây Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo là tƣơng đối cao, tốc độ và hiệu quả kinh tế cao hơn so với chồi Đinh lăng trong phƣơng pháp tạo đa chồi. Tìm ra môi trƣờng thích hợp nhất cho việc tạo rễ và đáp ứng mục tiêu sản xuất dƣợc liệu là môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung NAA 0,5 mg/l và 15 g đƣờng. 47 Hình 3.3. (a) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA 0,3 mg/l Hình 3.3. (b) Chồi Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng NAA 0,5 mg/l 48 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua những thí nghiệm đã thực hiện chúng tôi đã rút ra đƣợc những kết luận sau về việc nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹocây Đinh lăng: - Bƣớc đầu tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trongđiều kiện nuôi cấy in vitro. - Môi trƣờng thích hợp nhất tạo mô sẹo là: môi trƣờng MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + 2,4 D 2 mg/l + kinetin 0,2 mg/l. - Quá trình phát sinh hình thái mô sẹo với các bƣớc rất giống với trƣờng hợp phôi hữu tính trong các môi trƣờng: BAP 1 mg/l + Kinetin 0,5 mg/l, BAP 1 mg/l + Kinetin 1 mg/l, BAP 3 mg/l + Kinetin 1 mg/l, BAP 3 mg/l,gồm 4 giai đoạn: + Giai đoạn phôi hình cầu + Giai đoạn phôi hình tim + Giai đoạn phôi hình “cá đuối” + Giai đoạn phôi trƣởng thành - Môi trƣờng thích hợp nhất để phát sinh hình thái chồi từ mô sẹo câyĐinh lăng là: MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + BAP 3mg/l. - Môi trƣờng tái sinh rễ chùm là: MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + NAA 0,3 mg/l. Môi trƣờng tái sinh rễ cọc là: MS + 15 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + NAA 0,5 mg/l. 4.2. Kiến nghị Nghiên cứu ở giai đoạn vƣờn ƣơm để tìm ra giá thể thích hợp cho sự phát triển của cây Đinh lăng tái sinh từ mô sẹo lá và thân cây. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích và các tác giả (2004), Cây thuốc và Động vật làm thuốc, Tập I, Nxb Khoa học và Kĩ thuật, tr.793-796. 2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội. 3. Nguyễn Ngọc Dung (1998), Nhân giống cây Đinh lăng (Polyscias fruticosaL. Harms) thông qua con đường tạo phôi soma trong nuôi cấy in vitro, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Viện Sinh học Nhiệt đới, Nxb Nông Nghiệp Tp.HCM, tr 442- 445. 4. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, quyển II, Nxb Trẻ, tr. 668. 5. Nguyễn Nhƣ Khanh, Nguyễn Văn Đính (2006), Sinh học phát triển thực vật, Nxb Giáo dục Hà Nội. 6. Dƣơng Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, Nxb Đại Học Quốc gia Tp.HCM. 7. Trần Thị Liên, Nguyễn Văn Thuận, Đoàn Thị Thanh Nhàn (2005), "Nghiên cứu nhân nhanh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) bằng phƣơng pháp in-vitro”,Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 14, tr 39. 8. Ngô Ứng Long và cs (1985), “So sánh tác dụng tăng lực và sinh thích nghi của Đinh lăng, Chân chim và Eleuterococ”, Tạp chí Dược liệu, tr.24- 27. 9. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật. Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. Tr 111 – 114. 10. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội. 11. Lê Thiên Thƣ (2006), "Sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy in-vitro cây Đinh lăng và bƣớc đầu tìm hiểu saponin trong các mẫu cấy in- vitro cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms”, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên. 50 12. Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 13. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Giáo dục, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 14. A. Śliwińska, O. multiplication Olszowska, M. of Polyscias Furmanowa, A. filicifolia by Nosov, secondary “Rapid somatic embryogenesis”. In: In Vitro Cellular & Developmental Biology– PlantApril 2008, Volume 44, Issue 2, pp 69-77. 15. Murashige, T. (1980), “Plant growth substances in commercial uses of tissue culture”. In: Plant growth Substances 1979, ed. by F.Skoog. Springer- Verag, Berlin Heidelberg New York, pp. 426 – 434. 16. Nickell, L.G. (1973), “Test-tube Approaches to by pass sexx”, Hawaiian Planters Record.58, pp. 239-314. 17. Salwa S. Sakr, Saad S. Melad, M. A. El-Shamy and Asmaa E. Abd Elhafez,“In vitro Propagation of Polyscias fruticosa Plant”. In: International Journal of Plant & Soil Science, ISSN: 2320-7035,Vol.: 3, Issue.: 10 (October). Tài liệu từ Internet 18. http://www.duk.vn/view/1209_tac-dung-cua-la-va-re-dinh-lang.htm 19. http://www.caythuocquy.info.vn/old/modules.php?name=News&opcase=deta ilsnews&mid=1266&mcid=245&pid=&menuid= 20. http://www.sciencedomain.org 21. https://scholar.google.com.vn/scholar?q=in+vitro+propagation+of+polyscias+ fruticosa+plant%2CSalwa+AL.+Sakr&btnG=&hl=vi&as_sdt=0%2C5&as_vi s=1 22. http://canthostnews.vn/?tabid=230&NDID=35653&keyword=Xay-dung-quytrinh-nhan-giong-in-vitro-cay-dinh-lang-la-nho- 51 [...]... cao hiệu quả nghiên cứu khai thác, bào chế các sản phẩm từ Đinh lăng 2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu hình thái đƣợc phát sinh từ mô sẹo của cây Đinh lăng( Polyscias fruticosa (L. )Harms) đƣợc nuôi cấy in vitro 3 Nội dung nghiên cứu - Tạo mô sẹo từ lá non và thân cây Đinh lăng - Quá trình phát sinh hình thái từ mô sẹo cây Đinh lăng - Ảnh hƣởng của α – NAA đến khả năng ra rễ tạo cây Đinh lăng in vitro... các bộ phận khác (l , thân) [8], [1], [19] Ngoài ra trong Đinh lăng chứa alkaloid, acid amin, vitamin, đặc biệt dƣợc liệu từ cây Đinh lăng có tác dụng tăng cƣờng thể lực, tăng sức đề kháng và tăng khả năng thích nghi [3] Đinh lăng có nhiều loại khác nhau nhƣ: Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L. ) Harms), Đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana), Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei) [4] Mặc dù... TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L. ) Harms 1.1.1 Vị trí Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan) Lớp: Magnolyopsida (Ngọc lan) Bộ: Araliales(Nhân sâm) Họ: Araliaceae (Nhân sâm hay Ngũ gia b ) Loài: Polyscias fruticosa (L. ) Harms (Đinh lăng, cây gỏi cá, Nam dƣơng lâm, ) [4] 1.1.2 Mô tả Cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L. ) Harms là cây bụi cao 0,5 – 2 m Thân tròn sần... quan tâm đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn giống đồng nhất, năng suất cao, thời gian thu hoạch ngắn hơn so với trồng ngoài tự nhiên Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái mô sẹo của cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L. ) Harms) là cần thiết để ứng dụng vào phục vụ cho nhu cầu trồng trọt, sản 1 xuất cây giống có hiệu quả cao, chất... biểu bì 1.2.7 Các nghiên cứu in vitro về cây Đinh lăng 1.2.7.1 Tạo cây con Mô phân sinh của Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L. ) Harms đƣợc cảm ứng để phát triển thành cây con trong môi trƣờng MS dinh dƣỡng khoáng và bổ sung 2mg/l BAP Trong môi trƣờng này trung bình tạo 4,1 ± 0,25 chồi trong 60 ngày Tất cả chồi phát triển từ chồi nách mà không tạo sẹo [11] Quy trình nhân giống cây Đinh lăng lá nhỏ bằng... rây) - Giai đoạn phôi trƣởng thành: Là giai đoạn kết thúc quá trình phát sinh phôi Sự phát sinh phôi ở thực vật diễn ra theo cả mô hình trục và mô hình tỏa tròn:  Mô hình trục: là sự bố trí các tế bào, mô và cơ quan thực vật theo một trục phân cực Mô phân sinh đỉnh chồi là điểm kết thúc, mô phân sinh rễ ở đầu còn lại Trong phôi và cây non, một hoặc hai lá mầm đƣợc gắn phía 18 dƣới của mô phân sinh. .. một thời gian cho cây phát triển và quen dần với điều kiện môi trƣờng trƣớc khi trồng ra đất 17 1.2.6 Các giai đoạn phát sinh phôi soma Sự phát sinh phôi bắt đầu từ một hợp tử theo một chƣơng trình di truyền đặc trƣng cho loài chịu sự kiểm soát của yếu tố môi trƣờng Các giai đoạn của phát sinh phôi (của cây mô hình Arabidopsis) gồm: - Giai đoạn phôi hình cầu: Sau lần phân chia đầu tiên của hợp tử, tế... tài Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật đã có nhiều nghiên cứu về cây Đinh lăng - Polyscias fruticosa (L. )Harms thuộc họ Nhân sâm hay Ngũ gia bì (Araliaceae) [4], các kết quả nghiên cứu cho thấy cây Đinh lăng có nhiều tác dụng dƣợc lí giống Nhân sâm, và Tam thất nhƣ chứa saponin đƣợc coi là một trong những thành phần hóa học có tác dụng chính của dƣợc liệu, đồng thời ở cây Đinh lăng, rễ là nơi... Quốc, Ở Việt Nam, hiện có hơn 10 loài Đinh lăng [4], đƣợc trồng làm cảnh ở khắp nơi hoặc trồng làm thuốc ở quy mô nhỏ theo từng hộ gia đình, loài Đinh lăng đƣợc sử dụng làm thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L. ) Harms Đây là loài có nhiều tác dụng dƣợc lý giống Nhân sâm [8] 1.1.4 Hợp chất tự nhiên trong cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa( L) Harms) Cây Đinh lăng chứa alkaloid, glycosid và các... vật Kết thúc của quá trình phát sinh, phôi gồm 3 vùng: + Vùng đỉnh: Hình thành các lá mầm và mô phân sinh đỉnh chồi + Vùng trung gian (giữa): Tạo thành trụ dƣới lá mầm, rễ, và gần nhƣ mô phân sinh rễ + Vùng cuống phôi: Tạo thành phần còn lại của mô phân sinh rễ  Mô hình tỏa tròn: trong chồi và rễ, các mô đƣợc sắp xếp dạng tỏa tròn Ví dụ, khi quan sát cắt ngang rễ thấy ba vòng đồng tâm của mô sắp xếp