Nghiên cứu tạo dòng callus cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG VÕ THỊ NHƯ LỤA NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CALLUS CÂY ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÀ NẴNG - Năm 2016 J ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG VÕ THỊ NHƯ LỤA NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CALLUS CÂY ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn: ThS TRẦN QUANG DẦN Niên khóa: 2012 - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Võ Thị Như Lụa LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật, qua thân trưởng thành nghiên cứu khoa học Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS Trần Quang Dần người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Bùi Thị Thơ người giúp đỡ nhiều việc làm quen phát triển kĩ thực hành thí nghiệm q trình tơi thực đề tài khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến nhóm nghiên cứu, ln giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm thời gian tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên thực Võ Thị Như Lụa MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Đinh lăng 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Mô tả 1.1.3 Nguồn gốc-phân bố 1.1.4 Hợp chất tự nhiên Đinh lăng ((Polyscias fruiticosa (L.) Harms) 1.1.5 Tác dụng dược lý - Công dụng 1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu Đinh lăng 1.2.1 Các nghiên cứu giới 1.2.2 Các nghiên cứu nước 1.3 Callus 10 1.3.1 Khái niệm 10 1.3.2 Đặc điểm callus 11 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành callus ni cấy mơ thực vật 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với KIN lên khả cảm ứng callus in vitro 14 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D lên khả cảm ứng callus thân in vitro 15 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với BA lên khả cảm ứng callus thân in vitro 15 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D lên khả cảm ứng callus rễ in vitro 15 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với BA lên khả cảm ứng callus rễ in vitro 15 2.2.6 Bố trí thí nghiệm xử lí số liệu 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 16 3.1 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với KIN lên khả cảm ứng callus in vitro 16 3.2 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D lên khả cảm ứng callus đoạn thân in vitro 18 3.3 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với BA lên khả cảm ứng callus thân in vitro 19 3.4 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D lên khả cảm ứng callus rễ in vitro 20 3.5 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với BA lên khả cảm ứng callus rễ in vitro 22 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 24 Kết luận 24 Đề nghị 24 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 29 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyacetic acid BA : - benzyl adenine BAP : - benzyl amino purine ĐHST : Điều hòa sinh trưởng IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole - butyric acid KIN : Kinetin MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid SH : Schenk Hildebrandt (1972) TDZ : Thidiazuron Cs : Cộng DANH MỤC BẢNG Tên bảng Bảng Trang Bảng kết ảnh hưởng nồng độ 2,4D KIN lên khả 3.1 tạo callus Đinh lăng in vitro sau 30 ngày 16 nuôi cấy Bảng kết ảnh hưởng nồng độ 2,4D lên khả 3.2 tạo callus thân Đinh lăng in vitro sau 30 ngày nuôi 19 cấy 3.3 Bảng kết ảnh hưởng nồng độ 2,4-D lên khả tạo callus rễ Đinh lăng in vitro sau 30 ngày nuôi 21 cấy 3.4 Bảng kết ảnh hưởng nồng độ 2,4D BA lên khả tạo callus rễ Đinh lăng in vitro sau 30 ngày ni cấy 22 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây Đinh lăng ngồi tư nhiên 2.1 Cây Đinh lăng in vitro 14 Ảnh hưởng 2,4-D KIN lên tạo callus từ Đinh 3.1 lăng in vitro : (A) MS + 0,5 mg/L 2,4-D + mg/L KIN ; (B) 17 MS + mg/L 2,4-D +1 mg/L KIN 3.2 3.3 3.4 3.5 Callus tạo từ đoạn thân Đinh lăng in vitro môi trường MS + 1,5 mg/L 2,4-D sau 30 ngày nuôi cấy Callus tạo từ thân Đinh lăng in vitro môi trường MS + 1,5 mg/L 2,4-D + 1,5 mg/L BA sau 30 ngày nuôi cấy Callus tạo từ rễ Đinh lăng in vitro môi trường MS + 1,5 mg/L 2,4-D sau 30 ngày nuôi cấy Callus tạo từ rễ Đinh lăng in vitro môi trường MS+ 0,5 mg/L 2,4-D + 0,5 mg/L BA sau 30 ngày nuôi cấy 19 20 21 22 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh chăm sóc sức khỏe ưa chuộng giới Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật trở thành vấn đề quan trọng mang tính tồn cầu chúng ngày thương mại hóa nhiều Tuy nhiên, vấn đề đặt nơi sống tự nhiên thuốc bị biến nhanh chóng nhiều yếu tố như: biến đổi khí hậu tồn cầu, khai thác bừa bãi người…Vì việc trồng theo phương pháp truyền thống để tổng hợp hợp chất hóa học có nhiều hạn chế khó đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày tăng tương lai [39] Công nghệ nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật xem đường hữu hiệu để sản xuất hợp chất thứ cấp phục vụ cho công nghiệp dược phẩm Ưu điểm nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật sản xuất lượng sinh khối lớn thời gian ngắn, tạo nguồn nguyên liệu ổn định phục vụ chiết tách hoạt chất sinh học quy mô công nghiệp, góp phần giải khó khăn nguồn dược liệu tự nhiên [7] Callus khối tế bào khơng có tổ chức, hình thành từ mơ quan phân hóa điều kiện đặc biệt vết thương, xử lý với chất điều hòa sinh trưởng thực vật [20] Theo Nguyễn Đức Thành (2000), nuôi cấy callus khâu quan trọng nuôi cấy tế bào Callus xem nguyên liệu lý tưởng khởi đầu cho nghiên cứu quan trọng như: phân hóa mơ tế bào, chọn dịng tế bào, protoplast, sản xuất chất hoạt tính sinh học,…[24] Cây Đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) thuộc họ Ngũ Bì Araliaceae [4], thuốc sử dụng nhiều y học dân gian Việt Nam Trung Quốc Cây Đinh lăng có nhiều tác dụng dược lí giống Nhân sâm, đặc biệt dược liệu từ Đinh lăng có tác dụng tăng cường thể lực, tăng sức đề kháng tăng khả thích nghi Chúng dùng thân rễ, dùng để ăn sống, làm gỏi, rễ dùng để ngâm rượu làm thuốc Theo kết nghiên cứu gần đây, Đinh lăng có hai hợp chất quan trọng polyacetylen saponin, hợp chất có nhiều rễ Hợp chất saponin, đặc biệt triterpen, có tác dụng ức chế tạo thành malonyl dialdehyde q trình peroxy hóa lipid màng tế bào, tích cực 19 Hình 3.2: Callus tạo từ thân Đinh lăng in vitro môi trường MS + 1,5 mg/L 2,4-D sau 30 ngày nuôi cấy Thanh tỷ lệ = 0,5 cm 3.3 Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với BA lên khả cảm ứng callus thân in vitro Trong nghiên cứu này, khảo sát tạo thành callus đoạn thân Đinh lăng in vitro môi trường MS bổ sung kết hợp 2,4-D với BA Sau 30 ngày nghiên cứu, tiến hành xác định tiêu số mẫu tạo callus Số liệu thể liệu bảng 3.2 Bảng 3.2: Bảng kết ảnh hưởng nồng độ 2,4-D lên khả tạo callus thân Đinh lăng in vitro sau 30 ngày nuôi cấy Nồng độ 2,4 D Nồng độ BA Tỷ lệ mẫu Hình thái callus ( mg/L) ( mg/L ) (%) 0,5 0,5 47,78c Xanh nhạt, cứng 1,0 1,0 68,89b Xanh nhạt, cứng 1,5 1,5 92,22a Xanh nhạt, cứng 2,0 2,0 46,67b Xanh nhạt, cứng Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p