Nghiên cứu nhân nhanh cây đinh lăng (polyscias fruticosa (l) harm) bằng con đường phát sinh phôi soma

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  PHAN THỊ THẢO NHI NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH CÂY ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARM) BẰNG CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI SOMA Đà Nẵng – Năm 2016 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  PHAN THỊ THẢO NHI NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH CÂY ĐINH LĂNG (POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARM) BẰNG CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI SOMA Ngành: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn: ThS Trần Quang Dần Đà Nẵng – Năm 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Phan Thị Thảo Nhi LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật, qua thân trưởng thành nghiên cứu khoa học Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ThS Trần Quang Dần người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Bùi Thị Thơ người giúp đỡ nhiều việc làm quen phát triển kĩ thực hành thí nghiệm trình tơi thực đề tài khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến nhóm nghiên cứu, giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm thời gian tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ vật chất lẫn tinh thần để đạt kết tốt Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên thực Phan Thị Thảo Nhi MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu……………………………………………………… Ý nghĩa khoa học thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Đinh lăng 1.1.1 Phân loại Đinh lăng 1.1.2 Đặc điểm nhận dạng 1.1.3 Đặc điểm sinh thái 1.1.4 Phân bố, sinh thái học 1.1.5 Thành phần hóa học Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harm) 1.1.6 Tác dụng dược lí 1.2 Nhân giống trồng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2 Ưu, nhược điểm nhân giống vơ tính kỹ thuật ni cấy mơ tế bào 1.2.3 Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy nhân giống in vitro 1.3 Phơi vơ tính 10 1.3.1 Lịch sử…………………………………………………………………… 11 1.3.2 Khái niệm………………………………………………………………… 12 1.3.3 Các giai đoạn hình thành phơi vơ tính…………………………………… 13 1.3.4 Các kiểu phát sinh phơi vơ tính…………………………………………….14 1.3.5 Những nhân tố ảnh hưởng đến phát sinh phơi vơ tính………………….15 1.3.6 Một số vấn đề thường gặp phát sinh phơi vơ tính………………… 15 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu nhân giống Đinh lăng .16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nguyên liệu nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp tạo phôi soma 21 2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái phơi 21 2.2.3 Phương pháp nhân nhanh phôi soma 21 2.2.4 Phương pháp tái sinh chồi từ phôi soma 22 2.2.5 Phương pháp tạo rễ in vitro chồi tái sinh Đinh lăng 22 2.2.6 Bố trí thí nghiệm xử lí thống kê 22 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 23 3.1 Ảnh hưởng mẫu cấy đến khả phát sinh phôi soma 23 3.2 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả phát sinh phôi soma 24 3.2.1 Ảnh hưởng 2,4-D đến khả phát sinh phôi soma 24 3.2.2 Ảnh hưởng 2,4-D KIN đến khả phát sinh phôi soma……… 25 3.2.3 Ảnh hưởng NAA KIN đến khả phát sinh phôi soma…………26 3.3 Ảnh hưởng chất ĐHST đến nhân nhanh phôi soma 29 3.3.1 Ảnh hưởng BA đến nhân nhanh phôi soma……………………… 29 3.3.3 Ảnh hưởng KIN đến nhân nhanh phôi soma……………………….30 3.4 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tái sinh chồi từ phôi soma 33 3.4.1 Ảnh hưởng BA đến khả tái sinh chồi từ phôi soma…………… 33 3.4.2 Ảnh hường KIN đến khả tái sinh chồi từ phôi soma…………….34 3.5 Ảnh hưởng chất ĐHST đến tạo rễ chồi tái sinh từ phôi soma 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 47 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyl acetic acid BA : - benzyl adenine BAP : - benzyl amino purine B5 : Gamborg (1968) ĐHST : Điều hòa sinh trưởng IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole - butyric acid KIN : Kinetin MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid SH : Schenk Hildebrandt (1972) TDZ : Thidiazuron DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tên bảng Sự ảnh hưởng mẫu cấy lên phát sinh phôi soma 3.2 Sự ảnh hưởng 2,4-D lên phát sinh phôi soma 26 3.3 Sự ảnh hưởng 2,4-D KIN lên phát sinh phôi soma 28 3.4 Sự ảnh hưởng 2,4-D KIN lên phát sinh phôi soma 29 3.5 Sự ảnh hưởng BA lên nhân nhanh phôi soma 31 3.6 Sự ảnh hưởng KIN lên nhân nhanh phôi soma 33 3.7 Sự ảnh hưởng BA lên tái sinh chồi từ phôi soma 35 3.8 Sự ảnh hưởng KIN lên tái sinh chồi từ phôi soma 36 3.9 Sự ảnh hưởng NAA lên tạo rễ 37 Trang 24 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Tên hình Các giai đoạn phát triển phơi thực vật Trang 2.1 Cây Đinh lăng ngồi tự nhiên 21 2.2 Cây Đinh lăng in vitro tháng tuổi 21 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 21 13 Sự ảnh hưởng mẫu cấy lên phát sinh phôi soma sau 3.1 13 tuần nuôi cấy 25 3.2 Sự ảnh hưởng 2,4-D lên phát sinh phôi soma sau 13 tuần nuôi cấy 26 3.3 Các giai đoạn phát triển phôi soma quan sát mẫu cấy môi trường bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D +2 mg/l KIN 26 3.4 Sự ảnh hưởng 2,4-D KIN lên phát sinh phôi soma sau 13 tuần nuôi cấy 28 3.5 Sự ảnh hưởng NAA KIN lên phát sinh phôi soma sau 13 tuần nuôi cấy 30 3.6 Sự ảnh hưởng BA lên nhân nhanh phôi soma sau tuần nuôi cấy 32 3.7 Sự ảnh hưởng KIN lên nhân nhanh phôi soma sau tuần nuôi cấy 34 3.8 Sự ảnh hưởng BA lên tái sinh chồi từ phôi soma sau tuần nuôi cấy 35 3.9 Sự ảnh hưởng KIN lên tái sinh chồi từ phôi soma sau tuần nuôi cấy 37 3.10 Sự ảnh hưởng NAA lên tạo rễ sau tuần nuôi cấy 38 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Đinh lăng, thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) [44], dược liệu phân bố vùng Đông Nam Á, Ấn Độ [9], [33] Theo phân loại Phạm Hồng Hộ, Đinh lăng có nhiều loài, thuộc chi Polyscias Đinh lăng trổ, Đinh lăng ráng, Đinh lăng tròn Đinh lăng nhỏ Việt Nam có 10 số loài phân loại [18] Nhiều loài chi dùng làm thuốc chữa trị chứng bệnh khác y học dân tộc nhiều địa phương, thuốc giúp lợi tiểu, tăng cường thể lực, tăng sữa mẹ sau sinh … [1], [2] Những nghiên cứu khoa học gần chứng minh dược tính Đinh lăng [13], [17] Các loài chi Đinh lăng (Polyscias), thường chứa hợp chất thuộc nhóm: Saponin, hederagenin, triterpenoid, polyacetylen, sterol, ceramid, cerebrosid tinh dầu… [5], [14], [23] Đặc biệt quan trọng hợp chất Saponin triterpen (tương tự nhân sâm) có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống stress [13], [17] Ngoài ra, hợp chất khác polyacetylen có vai trị chống ung thư, chống oxi hóa, kháng khuẩn nấm [22] Hợp chất có chủ yếu nhân sâm, điều cho thấy tiềm sử dụng Đinh lăng thay cho nhân sâm [22] Những nghiên cứu hóa học tập trung nhiều vào loài Đinh lăng xẻ (Polyscias fruticosa (L.) Harms), chúng chứa hàm lượng lớn hợp chất có tính dược liệu, sử dụng phổ biến thuốc dân gian [1], [14], [13], [17], [23] Vì vậy, nhu cầu sử dụng Đinh lăng xẻ làm thuốc ngày tăng Hàng năm, Tổng công ty Dược Traphaco cần 400 Đinh lăng xẻ để làm thuốc, nguồn cung không ổn định chưa chủ động sản xuất, đồng thời hệ số nhân giống Đinh lăng từ tự nhiên thấp [11] Phát triển nghiên cứu Đinh lăng in vitro phương pháp cung cấp nguồn nguyên liệu nhanh chất lượng cho sản xuất dược chất [60] Trong phương pháp nhân nhanh in vitro, tái sinh chồi phơi soma có nhiều ưu việc cải thiện di truyền, thay đổi hay tăng cường tính chất mong muốn cách thêm trình tự gen cố định vào tế bào phơi nhằm tăng hàm 33 A B C D Hình 3.7 Ảnh hưởng KIN lên nhân nhanh phôi soma sau tuần nuôi cấy Phôi nhân môi trường bổ sung 0,5 mg/l KIN (A); mg/l KIN (B); mg/l KIN (C); mg/l KIN (D) Thanh tỉ lệ = 0,3 cm 3.4 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả tái sinh chồi từ phôi soma 3.4.1 Ảnh hưởng BA đến tái sinh chồi từ phôi soma Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin dùng để kích thích phát sinh chồi [16], [20] BA chất thuộc nhóm cytokinin, sử dụng để kích thích phân hóa, sinh trưởng phát triển chồi mẫu cấy in vitro Tác dụng chủ yếu BA kích thích phân chia mạnh mẽ tế bào, ảnh hưởng rõ rệt lên hình thành phân hố chồi [39], [45] BA kích thích phân chia tế bào mơ phân sinh đỉnh từ phát sinh chồi kích thích tạo [42], [52] Nghiên cứu tái tạo chồi từ phôi soma cà phê [69], sử dụng BA, đem lại hiệu tái tạo chồi 100% Trong nghiên cứu này, sử dụng BA để khảo sát tái sinh chồi từ phôi soma Đinh lăng Sau tuần nuôi cấy, thu kết bảng 3.7 34 Bảng 3.7 Sự ảnh hưởng BA lên tái sinh chồi từ phôi soma sau tuần Tỉ lệ tái sinh Chiều cao chồi tái chồi (%) sinh (cm) 100 1,98c 1,90b 0,5 100 1,23e 1,20d 1,0 100 1,56d 1,17d 2,0 100 2,58b 1,67c 3,0 100 2,84a 2,73a Nồng độ BA (mg/l) Số lá/ chồi Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p